Name: Miniskop rejestrujący sygnały wapnia w hipokampie myszy poruszających się po pióropuszu zapachowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Poznaj metodę miniskopowego rejestrowania sygnałów wapnia w hipokampie CA1 myszy podczas nawigacji po pióropuszu zapachowym. Technika ta pozwala dekodować trajektorię przestrzenną i badać zaburzenia w modelu choroby Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH UF1 NS116241 i NIH R01 DC000566) oraz Narodową Fundację Nauki (NSF BCS-1926676). Autorzy dziękują Andrew Scallonowi za pomoc w ustawieniu komory Odor Arena.

Recording Neuronal Activity During Odor Plume Navigation with Miniscope Imaging

<ol><li>Adoff, M. D., Climer, J. R., Davoudi, H., Marvin, J. S., Looger, L. L., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+excitatory+synaptic+input+to+place+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The functional organization of excitatory synaptic input to place cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 3558(2021).</li>
<li>Radvansky, B. A., Oh, J. Y., Climer, J. R., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+determines+the+hippocampal+spatial+mapping+of+a+multisensory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Behavior determines the hippocampal spatial mapping of a multisensory environment.</a> Cell Rep. 36 (5), 109444(2021).</li>
<li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plume+dynamics+structure+the+spatiotemporal+activity+of+mitral%2Ftufted+cell+networks+in+the+mouse+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plume dynamics structure the spatiotemporal activity of mitral/tufted cell networks in the mouse olfactory bulb.</a> Front Cell Neurosci. 15, 633757(2021).</li>
<li>Findley, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sniff-synchronized%2C+gradient-guided+olfactory+search+by+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">Sniff-synchronized, gradient-guided olfactory search by freely moving mice.</a> ELife. 10, e58523(2021).</li>
<li>Gire, D. H., Kapoor, V., Arrighi-Allisan, A., Seminara, A., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+develop+efficient+strategies+for+foraging+and+navigation+using+complex+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Mice develop efficient strategies for foraging and navigation using complex natural stimuli.</a> Curr Biol. 26 (10), 1261-1273 (2016).</li>
<li>Liu, A., Papale, A. E., Hengenius, J., Patel, K., Ermentrout, B., Urban, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+navigation+strategies+for+odor+source+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse navigation strategies for odor source localization.</a> Front Neurosci. 14, 218(2020).</li>
<li>Tariq, M. F., et al. Using head-mounted ethanol sensors to monitor olfactory information and determine behavioral changes associated with ethanol-plume contact during mouse odor-guided navigation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTariq%2C+MF+%22eNeuro%22">eNeuro</a>. 8 (1), (2021).</li>
<li>Rigolli, N., Reddy, G., Seminara, A., Vergassola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternation+emerges+as+a+multi-modal+strategy+for+turbulent+odor+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">Alternation emerges as a multi-modal strategy for turbulent odor navigation.</a> ELife. (11), e76989(2022).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+activity+of+CA1+hippocampal+cells+constitutes+a+temporal+memory+map+for+associative+learning+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential activity of CA1 hippocampal cells constitutes a temporal memory map for associative learning in mice.</a> Curr Biol. 34 (4), 841-854 (2024).</li>
<li>Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+the+light+that+we+can+see%3A+a+new+era+in+miniaturized+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy.</a> Nat Methods. 16 (1), 11-13 (2019).</li>
<li>Aharoni, D., Hoogland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+investigations+with+open-source+miniaturized+microscopes%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: Past, present and future.</a> Front Cell Neurosci. 13, 141(2019).</li>
<li>Flusberg, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed%2C+miniaturized+fluorescence+microscopy+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed, miniaturized fluorescence microscopy in freely moving mice.</a> Nat Methods. 5 (11), 935-938 (2008).</li>
<li>Connor, E. G., McHugh, M. K., Crimaldi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+airborne+odor+plumes+using+planar+laser-induced+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Fluids%22%5BJournal%5D)">Quantification of airborne odor plumes using planar laser-induced fluorescence.</a> Exp Fluids. 59 (9), 137(2018).</li>
<li>Gumaste, A., et al. A Comparison between mouse, in silico, and robot odor plume navigation reveals advantages of mouse odor tracking. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGumaste%2C+A+%22eNeuro%22">eNeuro</a>. 7 (1), (2020).</li>
<li>Gumaste, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+discrimination+and+olfactory+bulb+encoding+of+odor+plume+intermittency%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">Behavioral discrimination and olfactory bulb encoding of odor plume intermittency.</a> ELife. 13, e85303(2024).</li>
<li>Marin, A. C., Schaefer, A. T., Ackels, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+information+from+the+odour+environment+in+mammalian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial information from the odour environment in mammalian olfaction.</a> Cell Tissue Res. 383 (1), 473-483 (2021).</li>
<li>Eichenbaum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+hippocampus+in+navigation+is+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The role of the hippocampus in navigation is memory.</a> J Neurophysiol. 117 (4), 1785-1796 (2017).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-day+calcium+imaging+of+CA1+hippocampus+in+freely+moving+rats+reveals+a+high+preponderance+of+place+cells+with+consistent+place+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-day calcium imaging of CA1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields.</a> J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).</li>
<li>Mizuta, K., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+hippocampal+neural+circuits%3A+techniques+and+biological+insights+into+region-%2C+cell-type-%2C+and+pathway-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of hippocampal neural circuits: techniques and biological insights into region-, cell-type-, and pathway-specific functions.</a> Neurophotonics. 11 (3), 033406(2024).</li>
<li>Radvansky, B. A., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+virtual+reality+system+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An olfactory virtual reality system for mice.</a> Nat Commun. 9 (1), 839(2018).</li>
<li>Almeida-Santos, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+isolation+impairs+the+persistence+of+social+recognition+memory+by+disturbing+the+glutamatergic+tonus+and+the+olfactory+bulb-dorsal+hippocampus+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Social isolation impairs the persistence of social recognition memory by disturbing the glutamatergic tonus and the olfactory bulb-dorsal hippocampus coupling.</a> Sci Rep. 9 (1), 473(2019).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy1-GCaMP6+transgenic+mice+for+neuronal+population+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo.</a> PLoS One. 9 (9), e108697(2014).</li>
<li>Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+viral+injection+and+gradient-index+lens+implantation+for+deep+brain+in+vivo+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging.</a> J Vis Exp. (176), e63049(2021).</li>
<li>Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+baseplating+and+a+miniscope+preanchored+with+an+objective+lens+for+calcium+transient+research+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62611(2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+lens+system+for+calcium+imaging+of+neuronal+activity+from+deep+brain+structures+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals.</a> Curr Protoc Neurosci. 86 (1), e56(2019).</li>
<li>Guo, D., Gürkan Özer, A., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+in+mouse+inferior+olive%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging in mouse inferior olive.</a> J Vis Exp. (172), e62222(2021).</li>
<li>Yun, M., Shin, J., Jung, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+calcium+imaging+of+dorsal+and+ventral+CA1+neurons+in+head-fixed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for calcium imaging of dorsal and ventral CA1 neurons in head-fixed mice.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102439(2023).</li>
<li>Yun, M., Hwang, J. Y., Jung, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septotemporal+variations+in+hippocampal+value+and+outcome+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Septotemporal variations in hippocampal value and outcome processing.</a> Cell Rep. 42 (2), 112094(2023).</li>
<li>Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transient+prevalence+across+the+dendritic+arbour+predicts+place+field+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties.</a> Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NoRMCorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInan%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2021).</li>
<li>Segalin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+action+recognition+system+%28MARS%29+software+pipeline+for+automated+analysis+of+social+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">The mouse action recognition system (MARS) software pipeline for automated analysis of social behaviors in mice.</a> ELife. 10, e63720(2021).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hardware+system+for+real-time+decoding+of+in+vivo+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">A hardware system for real-time decoding of in vivo calcium imaging data.</a> ELife. (12), e78344(2023).</li>
<li>Xue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-region+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice+with+ultra-compact+head-mounted+fluorescence+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Sci+Rev%22%5BJournal%5D)">Multi-region calcium imaging in freely behaving mice with ultra-compact head-mounted fluorescence microscopes.</a> Natl Sci Rev. 11 (1), nwad294(2024).</li>
<li>Tabourin, L., Bretzner, F., Galstian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+mini-endoscope+design+with+spatially+selective+excitation+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Towards a mini-endoscope design with spatially selective excitation and imaging.</a> Biomed Opt Express. 15 (3), 1750-1760 (2024).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten skrupulatnie określa kroki rejestrowania komórek miejsca i komórek reagujących na zapach w obszarze dCA1 hipokampa myszy poruszających się po pióropuszu zapachu. Krytyczne kroki w protokole obejmują chirurgię stereotaktyczną, umieszczenie płytki bazowej miniskopu, budowę obszaru zapachowego, sprawdzenie pióropusza na arenie zapachowej, trening behawioralny, miniskopowe nagrywanie swobodnie poruszającej się myszy, wstępne przetwarzanie danych i analizę danych. Dodatkowo protokół wyjaśnia proces dekodowania trajektorii myszy na podstawie nagrań dCA1.
Kluczowym krokiem w chirurgii stereotaktycznej jest podążanie za współrzędnymi względem bregma, aby umieścić soczewkę GRIN we właściwym miejscu. Ograniczeniem metody jest opóźnienie między operacją a czasem rozpoczęcia obserwacji sygnałów GCaMP6f, które może trwać od 2 do 4 tygodni. Mysz powinna być gotowa do użycia po tym krytycznym okresie. Różnica między obecnym protokołem a poprzednimi protokołami 24,25,26,27 polega na użyciu myszy Thy1-GCaMP6f, które już wykazują ekspresję GCaMP6f w CA1, zamiast wstrzykiwania wirusa AAV-GCaMP6f do hipokampa. Oszczędza czas podczas operacji i nie wymaga czasu oczekiwania na ekspresję wirusa AAV w mózgu. Ponadto protokół ten nie aspiruje mózgu i wykorzystuje izofluran zamiast ketaminy/ksylazyny, co zapewnia lepszą kontrolę dawki, aby zapobiec przedawkowaniu. Ograniczeniem metody jest aberracja optyczna soczewki GRIN, która ogranicza pole widzenia. Kluczowym krokiem przy umieszczeniu płytki bazowej jest utrzymanie soczewki elektrozwilżającej na środku, aby zapobiec ograniczeniu w regulacji płytki Z po zacementowaniu płytki bazowej na głowicy. Ograniczeniem budowy areny zapachowej jest złożoność systemu, która może trwać kilka miesięcy i może wymagać pomocy inżyniera. Ograniczeniem treningu behawioralnego jest to, że myszy mogą preferować jedną stronę areny zapachowej przeciwko drugiej. Jednym ze sposobów na pokonanie tego problemu jest naprzemienne próby, nagradzające mysz za nawigację w kierunku lewego i prawego pasa.
Krytycznym krokiem do sprawdzenia pióropusza jest utrzymanie igły PID w jednej linii ze źródłem zapachu w celu wykrycia ścieżki pióropusza. Kluczowym krokiem w nagrywaniu swobodnie poruszającej się myszy w miniskopie jest upewnienie się, że przewód mini-koncentryczny nie plącze się podczas zadania, czemu można zapobiec za pomocą komutatora. Balony z helem mogą być używane, aby zapobiec przedostawaniu się przewodu koncentrycznego mini-przed mysz. Dla wstępnego przetwarzania danych kluczowe znaczenie ma synchronizacja impulsów TTL górnej kamery cyfrowej areny zapachowej i kamery miniskopowej. W przypadku procedury EXTRACT zaleca się stosowanie przetwarzania nieujemnego w celu lepszej ekstrakcji sygnałów ROI i δF/F0. EXTRACT zapewnia wizualną kontrolę śladów dla każdego zwrotu z inwestycji, aby wykluczyć złe. Bardzo ważne jest, aby zdekodować pozycje X i Y myszy na podstawie ROI, aby mieć duży zestaw danych z setkami epok w celu lepszego trenowania sztucznej sieci neuronowej.
Znaczenie tej swobodnie poruszającej się metody nagrywania w odniesieniu do istniejących metod unieruchomionych na głowie polega na badaniu zachowania myszy w etologicznie istotnym kontekście z prawidłowym ruchem głowy do poruszania się po złożonym pióropuszu zapachowym. Metoda ta ma zastosowanie do badania dynamicznej roli neuronów dCA1 w złożonej nawigacji po nazapachach. Co więcej, procedura nie ogranicza się do hipokampa lub węchu. Inne potencjalne zastosowania tej techniki obejmują badanie roli różnych obszarów mózgu i modalności sensorycznych, w tym możliwych zastosowań w nawigacji wizualnej za pomocą diod LED do wskazywania nagradzanych pasów. Ponadto metoda ta może być potencjalnie zastosowana w eksperymentach w pętli zamkniętej w czasie rzeczywistym, w których dekodowanie wapnia nerwowego z populacji wyzwala neurostymulację lub sensoryczne sprzężenie zwrotne 20,34,35,36.

Chociaż poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu obwodów neuronowych zaangażowanych w nawigację węchową u myszy z głową skupioną na głowie1,2,3 i strategie nawigacji w swobodnie poruszających się myszach4,5,6,7,8, rola obwodów neuronalnych w etologicznie istotnej, swobodnie poruszającej się nawigacji w turbulentnych pióropuszach zapachowych jest nadal nieznana. W tym artykule opisano monitorowanie aktywności neuronalnej poprzez obrazowanie stanów przejściowych Ca2+ w komórkach wyrażających genetycznie kodowany czujnik wapnia GCaMP6f u myszy Thy1-GCaMP6f 9 w celu zbadania, czy sekwencyjna dynamika neuronalna grzbietowej warstwy CA1 w warstwie piramidalnej neuronów w hipokampie (dCA1) odgrywa rolę w nawigacji pióropusza zapachowego. Metody dostarczają informacji na temat obrazowanej fluorescencji GCaMP6f za pomocą miniaturowego mikroskopu epifluorescencyjnego zogniskowanego przez soczewkę GRIN na dCA110,11,12. Metody wyjaśniają, jak jednocześnie monitorować nawigację przestrzenną i stany przejściowe wapnia GCaMP6f neuronu dCA1 u myszy wykonujących zadanie nawigacji zapachowo-pióropuszowej, w której otrzymywały nagrodę wodną, gdy dotarły do wylewki, dostarczając środek zapachowy na arenę zapachową z laminarnym przepływem powietrza w tle13,14. W tym artykule opisano metody wymagane do osiągnięcia tego zadania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), w tym stereotaktyczną operację wszczepienia soczewek o wskaźniku gradientu (GRIN), umieszczenie płytki bazowej w celu przymocowania miniskopu do czaszki w swobodnie poruszającej się myszy, obrazowanie za pomocą mikroskopu miniaturowego i monitorowanie ruchu myszy za pomocą szybkiej kamery cyfrowej, wstępne przetwarzanie danych w celu usunięcia artefaktów ruchu i znalezienia obszarów zainteresowania (ROI), oraz przygotowanie zestawów danych oraz trenowania i przewidywania sztucznej sieci neuronowej do dekodowania pozycji X i Y myszy na arenie zapachowej na podstawie zmian fluorescencji w dCA1 ROIs7.
Miniskopowy zapis sygnałów wapniowych w regionie CA1 hipokampa myszy poruszających się po smugu zapachu jest istotny dla zrozumienia obliczeń obwodów neuronowych związanych z węchem i informacją przestrzenną w złożonym zadaniu zachowania nawigacji po smugach zapachu2,14,15,16. Region CA1 hipokampa odgrywa rolę w nawigacji przestrzennej i ma kluczowe znaczenie dla tworzenia kognitywnej mapy środowiska dla efektywnej nawigacji17,18. Rejestrowanie sygnałów wapniowych za pomocą miniskopu jest cennym sposobem badania neuronów CA1, które kodują informacje przestrzenne podczas nawigacji w smugach zapachów.
Ta technika łączy zalety technologii miniskopowej do rejestrowania sygnałów wapniowych GCaMP z dobrze ugruntowaną rolą hipokampa CA1 w nawigacji przestrzennej, aby lepiej zrozumieć, jak obwody neuronowe kierują złożonymi zachowaniami19. Alternatywnie, podejścia wykorzystujące mikroskopię 2-fotonową mogą rejestrować neurony CA19,20, co wymaga myszy z głową i ogranicza możliwość swobodnego poruszania się w celu poruszania się po pióropuszu zapachu21. Zapisy elektrofizjologiczne neuronów CA1 w polu lokalnym pozwalają na badanie swobodnie poruszających się myszy poruszających się po pióropuszach zapachowych22. Mimo to sygnały elektryczne pola lokalnego nakładają ograniczenia na szacowanie wypalania wewnątrzkomórkowego poprzez izolowanie sygnałów pojedynczych jednostek za pomocą technik sortowania spajków. Sygnały miniskopowe pozwalają w niezawodny sposób zidentyfikować ROI związane bezpośrednio z wewnątrzkomórkowymi sygnałami wapniowymi10,11, aby precyzyjnie badać obliczenia neuronowe w rozdzielczości pojedynczej komórki. Technologia Miniscope daje wyjątkową możliwość lepszego zrozumienia, w jaki sposób region CA1 koduje informacje przestrzenne na podstawie sygnałów zapachowych.
Ponadto, ta technika bada, jak określone populacje neuronów przetwarzają informacje o zapachu do nawigacji i związku między wzorcami aktywności neuronów a podejmowaniem decyzji podczas śledzenia smug zapachu. Metoda ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia, w jaki sposób mózg przetwarza zapach i informacje przestrzenne. Chociaż miniskopy oferują rozdzielczość pojedynczej komórki do nagrywania swobodnie poruszającego się mózgu myszy, wymagają specjalistycznej wiedzy z zakresu chirurgii i analizy danych. W tym artykule przedstawiamy kompleksowy protokół, który pomaga naukowcom przejść przez każdy krok w celu zbadania mechanizmów neuronalnych nawigacji w smugach zapachowych.
Zadanie nawigacji zapachowej jest obiecującym narzędziem do badania kodowania neuronowego i przestrzennej pamięci sygnałów zapachowych u myszy. Wyniki artykułu wskazują, że możliwe jest rozszyfrowanie trajektorii myszy poruszającej się po pióropuszu zapachu na podstawie sygnałów wapnia zespołu neuronalnego w dCA1. Zrozumienie roli sygnałów wapniowych dCA1 w nawigacji po pióropuszach zapachowych jest kluczowym krokiem do złamania podstaw obwodu neuronowego do nawigacji sterowanej zapachem w realistycznych środowiskach13,14.

<table><tbody><tr><td>Arduino Micro</td><td>Arduino</td><td>Micro</td><td></td></tr><tr><td>Biokompatybilna żywica metakrylanowa</td><td>Parkell</td><td>S380</td><td>C& B-Metabond Klej Cement</td></tr><tr><td>Dekodowanie Sygnały mózgowe Oprogramowanie</td><td>CU Anschutz</td><td></td><td>https://github.com/restrepd/drgMiniscope</td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>Osada</td><td>LHP-6</td><td>AZ210015</td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>Osada</td><td>XL-230</td><td>30000 obrotów na minutę</td></tr><tr><td>Cyfrowy instrument stereotaktyczny</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td>Stereotaktyczny przyrząd myszy, #51904 Ramię manipulatora cyfrowego, 3-osie, Dodatek, LEWY&nbsp;</td></tr><tr><td>Wiertło</td><td>FST Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Średnica końcówki 0,5 mm</td></tr><tr><td>Szybki aparat cyfrowy</td><td>Edmund Optics</td><td>BFS-U3-63S4C</td><td>FLIR Blackfly</td></tr><tr><td>S Focal Lens</td><td>Edmund Optics</td><td>C-Series</td><td>3,5 mm</td></tr><tr><td>Soczewka GRIN</td><td>Inscopix</td><td>1050-004595</td><td>Średnica 1 mm i długość 4 mm</td></tr><tr><td>Uchwyt na soczewkę GRIN</td><td>UCLA</td><td></td><td>http://miniscope.org/index.php/Surgery_Protocol</td></tr><tr><td>Płynny klej tkankowy</td><td>3M</td><td>1469C</td><td>Vetbond Klej tkankowy</td></tr><tr><td>System znieczulenia o niskim przepływie dla myszy</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SomnoSuite</td><td>https://www.kentscientific.com/products/somnosuite/</td></tr> <tr><td>Klej silikonowy o niskiej toksyczności</td><td>WPI &ndash; World Precision Instruments</td><td>Kwik-sil</td><td></td></tr><tr><td>miniPID Kontroler</td><td>ASI &ndash; Aurora Scientific Inc.</td><td>Model 200B</td><td>Szybko reagujący miniaturowy detektor fotojonizacyjny</td></tr><tr><td>Miniskop V4 Uchwyt</td><td>UCLA</td><td>NA</td><td>https://github.com/Aharoni-Lab/Miniscope-v4/tree/master/Miniscope-v4-Holder</td></tr><tr><td>Miniskop V4</td><td>Labmaker</td><td>NA</td><td>https://www.labmaker.org/products/miniscope-v4</td></tr><tr><td>Płyta podstawy miniskopu V2</td><td>Labmaker</td><td>NA</td><td>https://www.labmaker.org/products/miniscope-v4-base-plates-variant-2-pack-of-10</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Miniscope DAQ-QT</td> Oprogramowanie <td>do</td><td></td>korekcji ruchu UCLA <td></td> https://github.com/Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software/wiki</tr><tr><td></td><td>CU Anschutz</td><td></td><td>https://github.com/restrepd/drgMiniscope</td></tr><tr><td>Odor Arena Hardware</td><td>Niestandardowy</td><td>model</td> <td>3Dhttps://www.dropbox.com/scl/fo/lwtpqysnpzis32mhrx3cd/ADomsxyhxu42sqDmTBl2O6k?rlkey=b3l4809eradundt5l3iz0gq74&amp; dl=0</td></tr><tr><td>Odor Arena Software</td><td>CUAnschutz</td><td></td><td>https://github.com/wryanw/odorarena</td></tr><tr><td>Środek zapachowy Octan izoamylu</td><td>Aldrich Chemical Co</td><td>06422AX</td><td>Rozcieńczony w 1% w bezwonnym oleju mineralnym</td></tr><tr><td>Płytka interfejsu USB RHD</td><td>Intan Technologies</td><td>C3100</td><td>Produkt wycofany z rynku. Alternatywnie użyj innej równoważnej płyty.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do ekstrakcji ROI</td><td>CU Anschutz</td><td></td><td>https://github.com/restrepd/drgMiniscope</td></tr><tr><td>Sutter Micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do synchronizacji</td><td>CU Anschutz</td><td></td><td>https://github.com/fsimoesdesouza/Synchronization</td></tr><tr><td>Thy1-GCaMP6f myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>IMSR_JAX 028281</td><td>C57BL/6J-TG(Thy1-GCaMP6f)GP5.12Dkim/J)</td></tr></tbody></table>

miniskop rejestrujący sygnały wapnia w hipokampie myszy poruszających się po pióropuszu zapachowym

Miniscope Recording Calcium Signals at Hippocampus of Mice Navigating an Odor Plume

Myszy poruszają się po pióropuszu zapachu o złożonej strukturze czasoprzestrzennej w ciemności, aby znaleźć źródło odorantów. W tym artykule opisano protokół monitorowania zachowania i rejestrowania stanów przejściowych Ca2 + w neuronach grzbietowej warstwy piramidalnej CA1 w hipokampie (dCA1) u myszy poruszających się po pióropuszu zapachu na arenie zapachowej o wymiarach 50 cm x 50 cm x 25 cm. Miniskop epifluorescencyjny zogniskowany przez soczewkę o indeksie gradientu (GRIN) obrazował stany przejściowe Ca2 + w neuronach dCA1 wyrażających czujnik wapnia GCaMP6f u myszy Thy1-GCaMP6f. W artykule opisano protokół behawioralny mający na celu wyszkolenie myszy do wykonywania tego zadania nawigacji po pióropuszach zapachowych na zautomatyzowanej arenie zapachowej. Metody obejmują procedurę krok po kroku do operacji implantacji soczewki GRIN oraz umieszczenie płytki bazowej do obrazowania GCaMP6f w CA1. Artykuł zawiera informacje na temat śledzenia pozycji myszy w czasie rzeczywistym w celu zautomatyzowania rozpoczęcia prób i dostarczenia nagrody w postaci wody. Ponadto protokół zawiera informacje na temat wykorzystania karty interfejsu do synchronizacji metadanych opisujących automatyzację zadania nawigacji zapachowej i czasy wyświetlania klatek dla miniskopu oraz kamery cyfrowej śledzącej pozycję myszy. Ponadto metody te wyznaczają potok używany do przetwarzania filmów fluorescencyjnych GCaMP6f poprzez korekcję ruchu przy użyciu algorytmu NorMCorre, a następnie identyfikację obszarów zainteresowania za pomocą EXTRACT. Wreszcie, artykuł opisuje podejście sztucznej sieci neuronowej do dekodowania ścieżek przestrzennych na podstawie aktywności zespołu neuronowego CA1 w celu przewidywania nawigacji myszy po pióropuszu zapachu.

Zastosowanie tej procedury pozwala na wizualizację i rejestrację przejściowych sygnałów fluorescencji dCA1 GCaMP6f u myszy nawigujących w arenie zapachowej w celu odnalezienia źródła substancji zapachowych (Rysunek 6A,B, Dodatkowy Film 1 oraz Dodatkowy Film 2). Obrazy fluorescencji są korygowane pod kątem ruchu za pomocą NoRMCorre, a do wyodrębnienia ROI wykorzystywany jest program EXTRACT. Ponadto rejestracja z użyciem płyty interfejsu umożliwia synchronizację sygnałów δF/F0 z ROI z momentami podawania zapachu i wody w arenie zapachowej (Rysunek 7A), a także z ruchem myszy w arenie zapachowej (Rysunek 7B oraz Dodatkowy Film 3). Reprezentatywny wynik nawigacji myszy w pióropuszu zapachowym obejmuje dużą liczbę przejściowych sygnałów wapniowych podczas wykonywania zadania (Rysunek 7A,B). Dodatkowo możliwe jest sprawdzenie, w jaki sposób odpowiedzi wapniowe korelują z obecnością zapachu i nagrody w postaci wody (Rysunek 7A). Wizualizacja pojedynczych prób za pomocą BENTO dostarcza informacji o odpowiedziach wapniowych na różnych etapach próby, w tym podczas rozpoczęcia próby, podejmowania decyzji, nawigacji, picia oraz powrotu do tylnej części areny (Rysunek 7B). Przedstawiona metoda dostarczyła cennych informacji na temat związku między odpowiedziami wapniowymi w CA1 a zachowaniem myszy podczas zadania nawigacyjnego zorientowanego na zapach.
Rejestracje z detektora PID mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat pióropusza zapachowego oraz prędkości powietrza w obrębie tego pióropusza. Reprezentatywny wynik pokazuje wzrost odpowiedzi PID po otwarciu zaworu i uwolnieniu pióropusza zapachowego wewnątrz areny zapachowej (Rycina 5A). Ponadto protokół umożliwia dekodowanie pozycji X i Y myszy na podstawie sygnałów δF/F0 z obszarów ROI w dCA1 (Rycina 8). Technika ta pozwala przewidzieć lokalizację przestrzenną myszy podczas zadania nawigacji w pióropuszu zapachowym na podstawie odpowiedzi CA1, co jest istotne dla lepszego zrozumienia sposobu, w jaki neurony CA1 przetwarzają informacje zapachowe i przestrzenne. Dekodowanie trajektorii myszy z sygnałów wapniowych zespołów neuronowych w dCA1 ma duże znaczenie, ponieważ ujawnia, jak neurony w grzbietowej części CA1 reprezentują mapę poznawczą substancji zapachowej i informacji przestrzennych w celu wykonania złożonego zadania nawigacji w pióropuszu zapachowym. Metodę tę rozszerzono na różne obszary ROI, które zachowują się wyłącznie jako komórki miejsca (place cells), oraz inne komórki reagujące na bodziec zapachowy. Prawidłowość dekodowania trajektorii myszy z sygnałów zespołów neuronowych można potwierdzić poprzez silną korelację między przewidywaniem z dekodowania a rzeczywistymi pozycjami X i Y myszy.
<img alt="Chirurgia stereotaktyczna, umieszczenie miniskopu, trening behawioralny; schemat badania myszy, rejestracja danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67039/67039fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat badania. (A) Operacja stereotaktyczna polega na implantacji soczewki GRIN w warstwie CA1 hipokampa oraz płytki mocującej na czaszce w celu unieruchomienia głowy myszy. (B) Na górze soczewki GRIN umieszcza się płytkę bazową, aby umożliwić optyczny dostęp do fluorescencji neuronów CA1 za pomocą miniskopu. (C) Mysz jest trenowana w zadaniu nawigacji w smudze zapachowej. (D) Rejestracja zachowania myszy oraz aktywności neuronów CA1 podczas swobodnej nawigacji w smudze zapachowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/67039fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ eksperymentu stereotaktycznego na myszach i mikroskopia; obejmuje aparat chirurgiczny i narzędzia analityczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67039/67039fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Chirurgia stereotaktyczna. (A) Umieść znieczuloną mysz w aparacie stereotaktycznym. Dostosuj poziom znieczulenia w zakresie od 2 do 3% w zależności od odpowiedzi odruchowej na uciśnięcie łapy (B) Wygol sierść nad głową. (C) Za pomocą wiertła ostrożnie wykonaj mały, trwały wgłębienie w górnej części docelowej lokalizacji. (D) Użyj wiertła stomatologicznego, aby wykonać okrągłą perforację o średnicy 1.5 mm, umożliwiającą implantację do mózgu soczewki GRIN o średnicy 1 mm i długości 4 mm. (E) Podłącz uchwyt soczewki GRIN do mikromanipulatora i włącz aspirator podłączony do pipety, aby utrzymać soczewkę GRIN. (F) Powoli implantuj soczewkę GRIN do kory, aż osiągnie głębokość -1.25 mm poniżej opony twardej. (G) Ilustracja utrwalonej po śmierci głowy, pokazująca płytkę głowową i płytkę podstawową przycementowane do czaszki wraz z implantowaną soczewką GRIN. (H) Pośmiertny skan CT głowy ilustrujący pasek głowowy na szczycie czaszki oraz soczewkę GRIN implantowaną wewnątrz czaszki. (I) Konstrukcja płytki głowowej zapewniająca unieruchomienie głowy myszy. Zwierzę na tym przedstawieniu jest odsłonięte, aby ułatwić wizualizację anatomiczną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/67039fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces dynamicznego pomiaru siły z użyciem przetwornika siły, przedstawiony w sekwencji eksperymentalnej A-D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67039/67039fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Mocowanie płytki podstawy miniskopu. (A) Wydrukowany w technologii 3D uchwyt miniskopu połączony z mikromanipulatorem. (B) Miniskop zamocowany w uchwycie. (C) Mocowanie płytki podstawy do miniskopu. (D) Dokręcanie śruby mocującej w celu utrwalenia płytki podstawy w miniskopie. Śrubę mocującą luzuje się po przyklejeniu płytki podstawy do czaszki myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/67039fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="A: Zautomatyzowany system inspekcyjny; B: Układ przepływu cieczy; C: Perforowana kratka wentylacyjna; D: System pompowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67039/67039fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4Konstrukcja areny zapachowej. (APrzezroczysta komora areny zapachowej. Na górze znajduje się kamera cyfrowa do rejestrowania zachowania myszy.BSilniki krokowe połączone ze strzykawkami kontrolują podawanie wody w celu nagrodzenia myszy.C) Widok z wnętrza areny zapachowej pokazujący strukturę plastra miodu, która służy do uzyskania przepływu laminarnego, oraz cztery linie doprowadzające zapach. (D) System podawania zapachów, obejmujący rurki, zawory i butelki z zapachami, widziany z zewnątrz areny zapachowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/67039fig04large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres odpowiedzi na zapach i schemat rozkładu przepływu; dane z czujnika PID, analiza przepływu powietrza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67039/67039fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Rejestracja pióropusza zapachowego. (A) Pióropusz zapachowy zarejestrowany za pomocą detektora fotojonizacyjnego (PID). Średnia (ciemnoniebieski)±odchylenie standardowe (jasnoniebieski) z pięciu przebiegów PID dla pióropusza zapachowego rozprzestrzeniającego się z prędkością 4,23 cm/s w arenie zapachowej. Źródło substancji zapachowej znajduje się 2 cm nad dnem areny zapachowej. Głowica czujnika PID generuje sygnał napięciowy odpowiadający stężeniu gazu w pióropuszu zapachowym. (B) Laserowa rejestracja pióropusza zapachowego przy swobodnym przepływie z prędkością 20 cm/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/67039fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy zachowania myszy z fazami próby: nawigowanie, picie, decydowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67039/67039fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Trening behawioralny myszy. (A) Mysz ucząca się nawigowania w kierunku pióropusza zapachowego uwalnianego w prawym kanale. Mysz uczy się rozpoczynać próbę, udając się do tylnej części areny zapachowej, wybierając stronę, w którą ma nawigować w stronę pióropusza zapachowego, a następnie wypijając wodną nagrodę. (B) Mysz ucząca się nawigowania w kierunku pióropusza zapachowego uwalnianego w lewym kanale. Mysz jest nagradzana za nawigowanie do właściwego kanału. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/67039fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza aktywności neuronalnej; bodźce zapachowe i wodne; wykres i wizualizacja danych; śledzenie zachowania myszy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67039/67039fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Przetwarzanie wstępne danych. (A) Przebiegi wapnia zsynchronizowane z zdarzeniami w arenie zapachowej dla wielu prób. Każda pojedyncza próba rozpoczyna się od podania zapachu (kolor czerwony), a próby nagrodzone kończą się impulsem podania wody (kolor niebieski). Przebiegi wapnia δF/F0 (bezwymiarowe) dla każdego ROI przedstawiono kolorem czarnym. Każda linia oznacza jeden ROI. Do rejestracji wyjść TTL górnej kamery w arenie zapachowej oraz kamery miniscope w celu synchronizacji klatek wykorzystano płytkę interfejsową. Do korekcji szumów ruchowych z klatek miniscope użyto programu NorMCorre, a do wyznaczania ROI i ekstrakcji przebiegów wapnia δF/F0 programu EXTRACT. (B) Reprezentatywna pojedyncza próba myszy nawigującej w pióropuszu zapachowym. Symultaniczna wizualizacja zsynchronizowanego zachowania (lewy panel) oraz przebiegów wapnia δF/F0 (prawy panel) z każdego ROI z pojedynczej próby została przeprowadzona za pomocą BENTO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/67039fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres dynamicznej analizy ruchu, pozycje X i Y w zależności od klatek, porównanie trendów danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67039/67039fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Dekodowanie pozycji myszy na podstawie sygnałów z obszaru CA1. Dekodowanie pozycji X i Y myszy z ROI obszaru CA1. Przewidywana pozycja została zaznaczona kolorem niebieskim, a rzeczywista pozycja myszy kolorem czerwonym. Przewidywane ślady są silnie skorelowane z wartościami rzeczywistymi. (A) Dekodowanie pozycji X z ROI (współczynnik korelacji Pearsona = 0,88). (B) Dekodowanie pozycji Y z ROI (współczynnik korelacji Pearsona = 0,88). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/67039fig08large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Film uzupełniający 1: Reprezentatywny przykład zsynchronizowanych klatek z nagrania behawioralnego i miniskopu, przedstawiający mysz poruszającą się w kierunku pióropusza zapachowego w lewym pasie. (A) Klatki z nagrania behawioralnego myszy z założonym miniskopem, poruszającej się wewnątrz areny zapachowej. (B) Klatki z miniskopu myszy pokazujące surowe przejściowe stężenia wapnia zarejestrowane przez soczewkę GRIN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/Movie1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Uzupełniający film 2: Reprezentatywny przykład zsynchronizowanych klatek behawioralnych i z miniskopu przedstawiający mysz poruszającą się w stronę pióropusza zapachowego w prawym pasie. (A) Klatki behawioralne myszy z założonym miniskopem, poruszającej się wewnątrz areny zapachowej. (B) Klatki z miniskopu myszy ukazujące surowe przejściowe stężenia wapnia zarejestrowane przez soczewkę GRIN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/Movie2.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Dodatkowy film 3: Prezentacja przetworzonych danych dotyczących zachowania myszy i sygnałów mózgowych w programie BENTO. Panel lewy: mysz porusza się w stronę prawego toru w arenie. Adnotacje behawioralne są przedstawione w różnych kolorach. Panel prawy: sygnały wapniowe δF/F0 myszy podczas nawigacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/Movie3.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Plik uzupełniający 1: NoseconeRender.png. Plik dla wydrukowanego w 3D stożka nosowego do przeprowadzania anestezji izofluranem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/NoseconeRender.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: HeadbarRender.png. Plik paska głowowego do unieruchamiania głowy myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/HeadbarRender.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: HeadbarTechnicalDrawing.png. Plik rysunku technicznego poprzeczki głowowej do unieruchomienia głowy myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/HeadbarTechnicalDrawing.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: ArenaFig_Draft2.tiff. Szczegółowy układ areny zapachowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67039/ArenaFig_Draft2.zip" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół bada zależność między mózgiem a zachowaniem w hipokampie CA1 u myszy poruszających się po smugach zapachu. Zapewniamy protokół krok po kroku, w tym operację w celu uzyskania dostępu do obrazowania hipokampa, trening behawioralny, rejestrację i przetwarzanie mózgu w miniskopie GCaMP6f oraz dane behawioralne w celu dekodowania pozycji myszy na podstawie aktywności neuronalnej ROI.

Miniskop rejestrujący sygnały wapnia w hipokampie myszy poruszających się po pióropuszu zapachowym

Mice navigate an odor plume with a complex spatiotemporal structure in the dark to find the source of odorants. This article describes a protocol to ...

Moje badania mają na celu zrozumienie, w jaki sposób mózg przetwarza informacje węchowe i przestrzenne. Próbujemy zrozumieć rolę neuronów CA1 w hipokampie w nawigacji zapachowo-pióropuszowej. Obecnie technologia swobodnie poruszających się zapisów neuronów za pomocą miniaturowych mikroskopów została wykorzystana do postępu badań w tej dziedzinie.Odkryliśmy, że możliwe jest rozszyfrowanie trajektorii myszy poruszającej się po smugu zapachu na podstawie neuronów i sygnałów wapniowych w grzbietowym CA1. Technika ta łączy w sobie zalety technologii mini scope do rejestrowania sygnałów wapniowych GCaMP z dobrze ugruntowanym rzędem nawigacji przestrzennej CA1 hipokampa. aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób obwody neuronalne napędzają złożone zachowania, Zbadamy, w jaki sposób nawigacja zapachowo-pióropuszowa jest upośledzona w mysim modelu choroby Alzheimera z nieprawidłową funkcją hipokampa CA1.Na początek zbuduj komorę z dwiema akrylowymi ścianami i akrylowym sufitem oraz szeroko ekspandowaną podłogą z polichlorku winylu. Pozostałe dwie unikalne ściany z przodu i z tyłu muszą ułatwiać przepływ powietrza. Umieść cztery zestawy źródeł zapachów w połączeniu z wylewkami doprowadzającymi wodę w odległości 10 centymetrów od siebie wzdłuż osi X.Zainstaluj szybką kamerę cyfrową nad areną, aby monitorować zachowanie zwierząt. Użyj niestandardowego kodu Pythona do zarządzania sprzętem areny zapachowej, a oprogramowanie zintegruje kamerę i cały sprzęt do konfiguracji eksperymentu. Skonfiguruj aparat cyfrowy tak, aby eksportował sygnał zegara podczas nagrywania klatek wideo w celu synchronizacji post-hoc z mini lunetą.Umieść miniaturowy detektor fotojonizacyjny (PID) w pobliżu źródła zapachu, a drugi umieść 10 centymetrów dalej. Zmień przełącznik wzmocnienia na panelu przednim regulatora PID na pozycję X pięć. Następnie ustaw przełącznik pompy na przednim panelu regulatora PID w pozycji wysokiej.Sprawdź diodę elektroluminescencyjną lub lampkę stanu LED na przednim panelu sterownika, aby upewnić się, że wyjście czujnika pokazuje zerowe napięcie przy braku substancji zapachowych. Przełącz przesunięcie potencjometru na zero, wyjście napięcia w przypadku braku substancji zapachowych i włącz zawór zapachowy na arenie zapachowej. Zmierz opóźnienie w wykrywaniu smugi zapachu za pomocą PID w każdym miejscu po otwarciu zaworu.Aby rozpocząć, skonfiguruj komorę, kamerę i detektor fotojonizacyjny lub czujniki PID na potrzeby eksperymentu. Aby wyszkolić mysz, poproś ją, aby przesunęła się na tył areny. Gdy mysz dotrze do tyłu, ręcznie dostarcz zapach i wodę w losowym pasie i pozwól myszy zlokalizować źródło i wypić wodę.Gdy mysz nauczy się inicjować próby, przełącz się na zautomatyzowane oprogramowanie do dostarczania zapachu. W zadaniu dwupasmowej nawigacji zapachowej losowo wybierz jeden z dwóch portów zapachowych, które mają dostarczać zapach. I nagrodź mysz wodą, gdy dotrze do właściwego dziobka wody Napraw mysz i umieść mini lunetę na płycie podstawy za pomocą mikromanipulatora.Dokręć dociskową, aby zabezpieczyć mini lunetę. Dostosuj soczewkę elektrozwilżającą, aby znaleźć optymalną płaszczyznę ogniskowej, zapewniając jak największą liczbę ogniw o największej intensywności fluorescencji. Aby uzyskać optymalny zakres dynamiki, użyj grzbietowego CA1 i przywiąż jedną mysz GCaMP six-F, ustawiając moc mini lunety na około 30% przy częstotliwości akwizycji 30 Hz.Zwolnij mysz wewnątrz areny zapachowej za pomocą mini lunety przymocowanej do płyty podstawy. Rozpocznij akwizycję za pomocą płytki interfejsu, aby nagrać logikę tranzystor-tranzystor lub wyjście TTL kamery cyfrowej oraz mini oscyloskop do synchronizacji. Rozpocznij nagrywanie mini lunety i filmów behawioralnych, a następnie włącz zautomatyzowane oprogramowanie do zadania nawigacji zapachowej z dwoma wylewkami.Następnie zsynchronizuj metadane areny zapachowej, nagrane klatki kamery cyfrowej i ramki mini lunety za pomocą kodu MATLAB synchronize_files_jove.m. Korzystając z korekcji normy, wykonaj korekcję ruchu zsynchronizowanych ramek mini oscyloskopu. Zidentyfikuj obszary zainteresowania za pomocą zmiennych w czasie sygnałów delta F przez F zero za pomocą ekstrakcji.Użyj zespołu zachowań i obserwatorium trajektorii neuronalnej, aby zobrazować zachowanie i obszary zainteresowania każdego oddzielnego badania. Odpowiedź PID znacznie wzrosła po uwolnieniu pióropusza zapachu, co wskazuje na czas dostarczenia zapachu. Podczas nawigacji zapachowej myszy zaobserwowano wiele stanów przejściowych wapnia w grzbietowej części CA1, korelujących ze zdarzeniami związanymi z zapachem i nagrodą wodną.Odpowiedzi wapnia były związane z różnymi etapami zadania nawigacyjnego, w tym startem próby, podejmowaniem decyzji i powrotem. Trajektoria przestrzenna myszy została zdekodowana na podstawie sygnałów wapniowych, ujawniając rolę grzbietowego CA1 w mapowaniu zapachu i informacji przestrzennych.

miniscope-recording-calcium-signals-at-hippocampus-mice-navigating-an

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Źródło: Thapa, R., et. al., Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewki o indeksie gradientowym dla głębokiego mózgu In vivo Obrazowanie wapnia.  J. Vis. Exp. (2021)Film demonstruje obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą miniskopu u transdukowanej myszy, korelując aktywność neuronów z zachowaniem.

Obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym przyśrodkowej kory przedczołowej myszy za pomocą miniskopu

Tutaj opisujemy protokół pomiaru i analizy reakcji na temperaturę w opuszce węchowej Xenopus laevis. Neurony receptorów węchowych i komórki mitralne są barwione różnicowo, po czym rejestrowane są zmiany wapnia, odzwierciedlające wrażliwość niektórych sieci neuronowych w bańce na spadki temperatury wywołane w nosie.

Rejestrowanie aktywności neuronalnej wywołanej temperaturą poprzez monitorowanie zmian wapnia w opuszce węchowej Xenopus laevis

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia in vivo jest nieocenionym narzędziem, które umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się zwierząt. Jednak zastosowanie tej techniki do ciała migdałowatego było trudne. Protokół ten ma na celu dostarczenie użytecznych wskazówek do skutecznego celowania w komórki ciała migdałowatego za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu u myszy.

Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu do montażu na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy

Ten artykuł demonstruje przygotowanie specjalnego okna obrazowania uzupełnionego o kaniulę infuzyjną i jej implantację w regionie CA1 hipokampa u myszy.

Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Zakręt zębaty hipokampa pełni podstawowe i odrębne funkcje w uczeniu się i pamięci. Protokół ten opisuje zestaw solidnych i skutecznych procedur obrazowania in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym u swobodnie poruszających się myszy.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo neuronów podwzgórza za pomocą miniaturyzowanego mikroskopu (miniscope) u swobodnie zachowujących się myszy podczas manipulacji stanem społecznym (izolacja społeczna i spotkanie społeczne). Metoda ta umożliwia obrazowanie aktywności podwzgórza w rozdzielczości pojedynczych neuronów, reprezentując potrzeby społeczne i nasycenie, umożliwiając mechanistyczne badania homeostazy społecznej.

In Vivo Obrazowanie wapnia mikroskopem miniaturowym w podwzgórzu w celu zrozumienia zachowań społecznych u myszy

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Poznaj metodę miniskopowego rejestrowania sygnałów wapnia w hipokampie CA1 myszy podczas nawigacji po pióropuszu zapachowym. Technika ta pozwala dekodować trajektorię przestrzenną i badać zaburzenia w modelu choroby Alzheimera.

Miniskop rejestrujący sygnały wapnia w hipokampie myszy poruszających się po pióropuszu zapachowym

Przeglądaj więcej filmów