Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

Protokół ten zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania i ilościowego określania zmian w morfologii mitochondriów w wielu tkankach. W elegancji C morfologia mitochondriów jest często kojarzona z jego funkcjonalnością. Zmiany w morfologii mitochondriów można zaobserwować w różnych stanach chorobowych i wraz z postępem starzenia, które często korelują z rozregulowaniem funkcji mitochondriów, Różne tkanki i zobacz elegancję.

Wykazują unikalne struktury mitochondrialne, które wymagają odrębnych strategii obrazowania. Dlatego wybór odpowiedniego mikroskopu i optymalizacja przygotowania próbki jest niezbędna do udanego obrazowania mitochondriów specyficznych dla tkanek i C Elegance. Tutaj zdecydowaliśmy się użyć transgenicznych szczepów cele z ekspresją zlokalizowanego w mitochondriach GFP zamiast konwencjonalnych barwników mitochondrialnych.

Pozwala nam to uniknąć efektów niedocelowych, bipenetracji onal i złożonych etapów przygotowania próbki niezbędnych do wizualizacji mitochondriów w różnych tkankach za pomocą barwnika. Głównym celem naszego laboratorium jest badanie homeostazy mitochondriów podczas stresu i starzenia się. Standaryzacja protokołu obrazowania mitochondriów jest niezbędna do zminimalizowania błędów pozaumysłowych i uzyskania powtarzalnych wyników dotyczących zmian w morfologii mitochondriów w różnych warunkach biologicznych.

Na początek zaopatrz się w czyste szkiełka podstawowe. W celu przygotowania próbki dodać od 10 do 20 mikrolitrów roztworu M nine na szkiełko i umieścić w roztworze żądaną liczbę dorosłych robaków w określonym wieku. Na szkiełku przykryj robaki w roztworze M nine szkłem nakrywkowym, aby zobrazować mięśnie.

Mitochondria, popchnij szkiełko nakrywkowe, aby zwinąć robaki. Następnie za pomocą lakieru do paznokci uszczelnij boki szkła nakrywkowego, aby zapobiec parowaniu roztworu M nine. Użyj standardowego mikroskopu szerokokątnego, aby zobrazować mitochondria mięśni i naskórka wyrażające znaczniki fluorescencyjne.

Użyj mikroskopu konfokalnego do obrazowania mitochondriów jelitowych i zoptymalizuj ustawienia obrazowania, aby dopasować je do konkretnej konfiguracji eksperymentalnej. Aby rozpocząć analizę, otwórz aplikację Fiji po instalacji, aby pobrać i zainstalować makro mito mapper. Najpierw pobierz kod źródłowy.

Skopiuj kod wymieniony w obszarze Kod IJM dla mapowania MIT 1.0. Otwórz Fidżi i przejdź do wtyczek, a następnie nowy i makro wklej skopiowany kod do okna makra. Następnie zapisz makro do wykorzystania w przyszłości za pomocą pliku i zapisz jako.

Przejdź do pliku, a następnie otwórz, aby otworzyć mikroskopijny obraz 3D za pomocą Zs.In Fidżi, utwórz maksymalną projekcję pod obrazem, a następnie stosy i projekt Z. Wybierz zakres przekrojów na obrazach z ostrością dla maksymalnej projekcji i wybierz maksymalną intensywność jako typ projekcji, aby zapisać maksymalny wyświetlany obraz. Jako tiff przejdź do pliku i kliknij zapisz, a następnie tiff.

Przytnij obszary zainteresowania z całego obrazu za pomocą narzędzia prostokąta i przejdź do obrazu i przytnij. Przejdź do pliku, a następnie zapisz jako i tiff, aby zapisać przycięty obraz w formacie Tiff. Przeciągnij i upuść poprzednio zapisaną mapę mito lub plik makra na pasek narzędzi Fidżi.

Kliknij przycisk Uruchom. Po wyświetleniu monitu wybierz folder zawierający plik TIFF zapisany w poprzednim kroku. Po wyświetleniu monitu o wybranie obszaru utwórz prostokąt na obrazie za pomocą narzędzia Prostokąt i naciśnij OK, aby potwierdzić.

Na koniec przejdź do pliku i zapisz dane ze wszystkimi wartościami związanymi z morfologią mitochondriów jako plik CSV z kropką. Morfologia mitochondriów była specyficzna dla tkanki, z mitochondriami rurkowymi wyrównanymi z włóknami mięśniowymi w mięśniach, połączonymi ze sobą strukturami przypominającymi sieć w jelicie i bardziej zaokrąglonymi lub owalnymi. Obrazowanie mitochondriów w tkance podskórnej za pomocą mikroskopu konfokalnego poprawiło wizualizację mitochondriów jelitowych poprzez zmniejszenie nieostrości światła w porównaniu z mikroskopią złożoną.

Na szkiełkach mitochondria wykazywały fragmentację po 30 minutach w buforze M nine, przy czym mitochondria naskórka wykazywały najbardziej widoczną fragmentację. Starzenie się spowodowało fragmentację mitochondriów we wszystkich tkankach, które wyglądały jak ścięte i kuliste struktury. Kwantyfikacja mapera MIT wykazała, że długość obiektu zmieniła się w mięśniach, a punkt połączenia zmienił się w tkance podskórnej.