Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia
January 17th, 2025
Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.
Protokół ten zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania i ilościowego określania zmian w morfologii mitochondriów w wielu tkankach. W elegancji C morfologia mitochondriów jest często kojarzona z jego funkcjonalnością. Zmiany w morfologii mitochondriów można zaobserwować w różnych stanach chorobowych i wraz z postępem starzenia, które często korelują z rozregulowaniem funkcji mitochondriów, Różne tkanki i zobacz elegancję.
Wykazują unikalne struktury mitochondrialne, które wymagają odrębnych strategii obrazowania. Dlatego wybór odpowiedniego mikroskopu i optymalizacja przygotowania próbki jest niezbędna do udanego obrazowania mitochondriów specyficznych dla tkanek i C Elegance. Tutaj zdecydowaliśmy się użyć transgenicznych szczepów cele z ekspresją zlokalizowanego w mitochondriach GFP zamiast konwencjonalnych barwników mitochondrialnych.
Pozwala nam to uniknąć efektów niedocelowych, bipenetracji onal i złożonych etapów przygotowania próbki niezbędnych do wizualizacji mitochondriów w różnych tkankach za pomocą barwnika. Głównym celem naszego laboratorium jest badanie homeostazy mitochondriów podczas stresu i starzenia się. Standaryzacja protokołu obrazowania mitochondriów jest niezbędna do zminimalizowania błędów pozaumysłowych i uzyskania powtarzalnych wyników dotyczących zmian w morfologii mitochondriów w różnych warunkach biologicznych.
Na początek zaopatrz się w czyste szkiełka podstawowe. W celu przygotowania próbki dodać od 10 do 20 mikrolitrów roztworu M nine na szkiełko i umieścić w roztworze żądaną liczbę dorosłych robaków w określonym wieku. Na szkiełku przykryj robaki w roztworze M nine szkłem nakrywkowym, aby zobrazować mięśnie.
Mitochondria, popchnij szkiełko nakrywkowe, aby zwinąć robaki. Następnie za pomocą lakieru do paznokci uszczelnij boki szkła nakrywkowego, aby zapobiec parowaniu roztworu M nine. Użyj standardowego mikroskopu szerokokątnego, aby zobrazować mitochondria mięśni i naskórka wyrażające znaczniki fluorescencyjne.
Użyj mikroskopu konfokalnego do obrazowania mitochondriów jelitowych i zoptymalizuj ustawienia obrazowania, aby dopasować je do konkretnej konfiguracji eksperymentalnej. Aby rozpocząć analizę, otwórz aplikację Fiji po instalacji, aby pobrać i zainstalować makro mito mapper. Najpierw pobierz kod źródłowy.
Skopiuj kod wymieniony w obszarze Kod IJM dla mapowania MIT 1.0. Otwórz Fidżi i przejdź do wtyczek, a następnie nowy i makro wklej skopiowany kod do okna makra. Następnie zapisz makro do wykorzystania w przyszłości za pomocą pliku i zapisz jako.
Przejdź do pliku, a następnie otwórz, aby otworzyć mikroskopijny obraz 3D za pomocą Zs.In Fidżi, utwórz maksymalną projekcję pod obrazem, a następnie stosy i projekt Z. Wybierz zakres przekrojów na obrazach z ostrością dla maksymalnej projekcji i wybierz maksymalną intensywność jako typ projekcji, aby zapisać maksymalny wyświetlany obraz. Jako tiff przejdź do pliku i kliknij zapisz, a następnie tiff.
Przytnij obszary zainteresowania z całego obrazu za pomocą narzędzia prostokąta i przejdź do obrazu i przytnij. Przejdź do pliku, a następnie zapisz jako i tiff, aby zapisać przycięty obraz w formacie Tiff. Przeciągnij i upuść poprzednio zapisaną mapę mito lub plik makra na pasek narzędzi Fidżi.
Kliknij przycisk Uruchom. Po wyświetleniu monitu wybierz folder zawierający plik TIFF zapisany w poprzednim kroku. Po wyświetleniu monitu o wybranie obszaru utwórz prostokąt na obrazie za pomocą narzędzia Prostokąt i naciśnij OK, aby potwierdzić.
Na koniec przejdź do pliku i zapisz dane ze wszystkimi wartościami związanymi z morfologią mitochondriów jako plik CSV z kropką. Morfologia mitochondriów była specyficzna dla tkanki, z mitochondriami rurkowymi wyrównanymi z włóknami mięśniowymi w mięśniach, połączonymi ze sobą strukturami przypominającymi sieć w jelicie i bardziej zaokrąglonymi lub owalnymi. Obrazowanie mitochondriów w tkance podskórnej za pomocą mikroskopu konfokalnego poprawiło wizualizację mitochondriów jelitowych poprzez zmniejszenie nieostrości światła w porównaniu z mikroskopią złożoną.
Na szkiełkach mitochondria wykazywały fragmentację po 30 minutach w buforze M nine, przy czym mitochondria naskórka wykazywały najbardziej widoczną fragmentację. Starzenie się spowodowało fragmentację mitochondriów we wszystkich tkankach, które wyglądały jak ścięte i kuliste struktury. Kwantyfikacja mapera MIT wykazała, że długość obiektu zmieniła się w mięśniach, a punkt połączenia zmienił się w tkance podskórnej.
Przegląd
Ten protokół ustanawia standaryzowaną metodę obrazowania i ilościowego określania morfologii mitochondriów u C. elegans w różnych tkankach podczas procesu starzenia. Badanie podkreśla związek między strukturą mitochondriów a ich funkcjonalnością, pokazując jak zmiany w morfologii zachodzą w reakcji na starzenie i choroby.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Morfologia mitochondriów
- Starzenie
- C. elegans jako organizm modelowy
Tło
- Morfologia mitochondriów jest krytyczna dla ich funkcji.
- Zmiany mogą wskazywać na stany chorobowe i postępowanie starzenia.
- Różne tkanki u C. elegans wymagają unikalnych metod obrazowania.
Stosowane metody
- Fluorescencyjne obrazowanie z wykorzystaniem transgenicznego C. elegans wytwarzającego GFP zlokalizowanych w mitochondriach.
- C. elegans
- Szerokokątne i konfokalne mikroskopowe obrazowanie do określenia specyficznych dla tkanki obrazów.
Główne wyniki
- Dokumentowano morfologię mitochondriów specyficzną dla tkanki.
- Starzenie prowadziło do obserwowalnej fragmentacji we wszystkich tkankach.
- Analiza ilościowa ujawniła znaczące zmiany w strukturze mitochondriów.
Wnioski
- Badanie pokazuje niezawodną metodę oceny zmian mitochondriów u C. elegans.
- Zrozumienie tych dynamiek może pogłębić badania nad starzeniem i dysfunkcją mitochondriów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative imaging of mitochondrial morphology in C. elegans enables high-confidence assessment of organelle dynamics during aging, supporting early discovery and mechanistic de-risking in metabolic and age-related disease research. Standardized protocols and robust quantification reduce variability, enhancing predictive confidence for target validation and translational continuity. This approach strengthens portfolio decisions by providing reproducible, tissue-specific mitochondrial phenotyping across the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial structural changes linked to functional decline during aging.
- Supports biological de-risking by distinguishing tissue-specific mitochondrial phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in target selection for metabolic and aging-related pathways.
Screening & Assay Development
- Provides validated, reproducible imaging protocols for downstream phenotypic screening.
- Standardizes quantification of mitochondrial morphology using single-copy GFP constructs and mitoMAPR analysis.
- Enables reliable comparison of compound or genetic perturbations on mitochondrial structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial phenotypes in C. elegans with disease-relevant cellular changes observed in higher organisms.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-tissue and cross-age comparisons.
- Reduces translational risk by providing quantitative, tissue-specific readouts of mitochondrial health.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation, supporting robust mitochondrial phenotyping at each stage.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven assessment of mitochondrial dynamics and pathway clarification during aging.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for assay readiness and reproducibility.
- Analytics: Provides objective morphological measurements and CSV data for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of mitochondrial biomarkers between C. elegans and mammalian systems when supported by data.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse tissues and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models based on robust mitochondrial phenotyping.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy, transgenic C. elegans handling, and image analysis.
- Needs access to wide field and confocal microscopes, as well as Fiji software with mitoMAPR macro.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and sample preparation.
- Adaptable to multiple tissues but may require optimization for specific experimental setups.
- Potential limitations include tissue-specific imaging challenges and time-dependent morphological changes ex vivo.
