Zrozumienie zmian w morfologii mitochondriów za pomocą dynamicznych i trójwymiarowych mikrofotografii fluorescencyjnych

Celem naszych badań jest obserwacja zmian w sieciach mitochondrialnych i zbadanie, jak te sieci mitochondrialne zmieniają się w odpowiedzi na warunki komórkowe. Używamy narzędzi open source, takich jak Fiji i Python, łącząc istniejące biblioteki z niestandardowymi makrami i skryptami, aby zautomatyzować analizę morfologii mitochondriów na podstawie złożonych danych z mikroskopii fluorescencyjnej. Uzyskanie wiarygodnych danych ilościowych i metryk opisujących dynamikę rozszczepienia i fuzji mitochondriów wraz z ich lokalizacją w 3D pozostaje wyzwaniem.

Standaryzacja takiego generowania danych nie jest powszechnie dostępna. W związku z tym istnieje ograniczona wiedza na temat częstotliwości rozszczepienia i fuzji specyficznej dla komórki oraz lokalizacji wewnątrzkomórkowej. Do dostępnych wskaźników badawczych dodaliśmy wykrywanie życia rozszczepienia i fuzji mitochondrialnej.

Łącząc je z liczbą struktur mitochondrialnych, byliśmy w stanie zdefiniować nowy wskaźnik do zrozumienia dynamiki sieci mitochondrialnej. Nasze odkrycia pozwalają nam scharakteryzować specyficzne dla komórki parametry rozszczepienia i fuzji oraz po raz pierwszy określić, czy system mitochondrialny jest w równowadze, czy się zmienia. Zapobiega to poważnym błędnym interpretacjom fenotypów w zdrowiu i chorobie oraz zapewnia jasne ramy dla dokładnego raportowania.

Aby rozpocząć, otwórz plik RAW w ImageJ. Dostosuj ustawienia kolorów, aby zwiększyć widoczność obszaru zainteresowania, ale nie ustawiaj niczego. Zduplikuj obraz zgodnie z liczbą pojedynczych komórek, które należy przeanalizować.

Jeśli w polu widzenia znajduje się wiele komórek, przejdź do sekcji Analizuj, Narzędzia i użyj narzędzi Zsynchronizowany system Windows oraz narzędzia Rysowanie odręczne, aby narysować obszar zainteresowania wokół interesującej komórki, a następnie wybierz opcję Edytuj i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz, aby wyizolować wybraną komórkę. Oddziel kanały czerwony i niebieski od siebie i zapisz kanał mitochondrialny jako plik tif. Aby wygenerować funkcję rozproszenia punktowego lub PSF, ponownie otwórz obraz RAW.

Następnie otwórz wtyczkę generatora PSF, wybierając Wtyczki, a następnie wybierając Generator PSF i wybierając model optyczny 3D Born wolf. Otwórz informacje o obrazie nieprzetworzonym, wybierając pozycję Obraz, a następnie wybierając opcję Pokaż informacje lub naciskając I na klawiaturze. Przewiń do dołu okna informacji o obrazie.

Wybierz opcję rozmiaru i głębokości woksela i zmień długość fali na 568 nanometrów. Ustaw rozmiar piksela XY na 166,1 nanometra, krok Z na 200 nanometrów. Ustaw rozmiar XYZ tak, aby odpowiadał rozdzielczości obrazu 512 x 512, a stos Z można skonfigurować tak, aby zawierał 10 plasterków Z.

Kliknij Uruchom. Zapisz plik PSF jako plik tif w osobnym folderze. Przejdź do Wtyczki, wybierz Makra, a następnie wybierz Edytuj, a następnie Deconvolution_time_lapse_mine.

ijm, aby uzyskać dostęp do makra dekonwolucji. Edytuj wiersze wejściowe i wyjściowe zgodnie z wymaganiami, a następnie naciśnij przycisk Uruchom, aby uruchomić makro. Aby poprawić kontrast obrazu i rozmycie, przejdź do Wtyczki, wybierz Makra, wybierz Edytuj i otwórz Przetwarzanie wstępne.

icm, aby uzyskać dostęp do makra przetwarzania wstępnego. Wykonaj odejmowanie tła, ustawiając promień toczącej się kuli na 6. Ustaw filtr Sigma Filter Plus w taki sposób, aby promień był ustawiony na 1-krotność współczynnika skali.

Liczba użytych pikseli wynosi 2, a minimalny ułamek pikseli to 0,2, co zapewnia, że wtyczka jest ustawiona tak, aby była świadoma wartości odstających. Dostosuj ustawienia CLAHE, konfigurując rozmiar bloku na 64, przedziały histogramu na 256, maksymalne nachylenie na 2,5 i krzywą gamma na 0,8, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Otwórz interesujący plik, który został zmodyfikowany za pomocą procesu wstępnego.

makra ijm w ImageJ. Przejdź do Wtyczki i wybierz Próg adaptacyjny. Ustaw próg lokalny na średnią ważoną i dostosuj rozmiar bloku pikseli zgodnie z wymaganiami.

Kliknij Podgląd i dostosuj rozmiar bloku, aby wyraźnie uwzględnić jak najwięcej mitochondriów. Zmodyfikuj wartość odejmowania dla każdej komórki, aby wyeliminować niepotrzebne tło, i zanotuj wynikową mikrofotografię. Aby zoptymalizować pod kątem czasu, posortuj obrazy w plikach zgodnie z zastosowaną wartością odejmowania.

Teraz przejdź do Wtyczki, wybierz Makra, wybierz Edytuj i otwórz Próg. ijm, aby uzyskać dostęp do makra progowego. Edytuj skrypt makra, aby zdefiniować poprawne ścieżki wejściowe i wyjściowe, rozmiar bloku i wartości odejmowania.

Kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić makro. Otwórz do 10 mikrofotografii progowych, które należą do tego samego schorzenia zabiegowego. Przejdź do Obraz, stosy, narzędzia i wybierz Połącz, a następnie naciśnij OK.To usuń resztki małych punktów pozostawionych przez próg, przejdź do Wtyczki, a następnie Integralne filtry obrazu, a następnie wybierz Usuń wartości odstające.

Użyj podglądu, aby dostosować rozmiary X i Y w celu wyeliminowania fragmentów. Zapisz połączony plik jako plik TIF. Na koniec przejdź do Wtyczki, Makra, Edycja, QuickTest_new.ijm.

Edytuj wiersze ścieżki wejściowej i wyjściowej, aby wskazać odpowiednie katalogi, kliknij przycisk Uruchom i zwizualizuj lokalizator zdarzeń mitochondrialnych lub wyniki MEL. Dynamika mitochondriów była śledzona w czasie, z czerwonymi puncta oznaczającymi zdarzenia rozszczepienia i zielonymi puncta oznaczającymi zdarzenia fuzji zarówno w widokach 3D, jak i 2D. Sieci mitochondrialne wykazywały specyficzne dla leczenia różnice w strukturze w czasie, z bardziej wydłużonymi i połączonymi formami w komórkach leczonych metforminą i wysoce rozdrobnionymi sieciami w komórkach leczonych metforminą CCCP Baf.

Grupa przyjmująca metforminę CCCP Baf wykazała znacznie wyższą aktywność rozszczepienia i fuzji niż grupa kontrolna lub grupa otrzymująca tylko metforminę, co sugeruje zwiększoną przebudowę mitochondriów. Ta grupa miała również znacznie wyższą liczbę mitochondriów, co było zgodne ze zwiększoną fragmentacją. Objętość mitochondriów została znacznie zmniejszona w tej samej grupie, co dodatkowo wspiera zmianę w kierunku rozszczepienia.

Jednakże, po znormalizowaniu do liczby mitochondrialnej, tylko grupa metforminy wykazywała najwyższą względną aktywność dynamiczną, co sugeruje, że sama metformina promuje bardziej aktywną i wydajną sieć przebudowy, podczas gdy wspólne leczenie napędza rozległy, ale mniej wydajny obrót strukturalny.