Podstawowe metody Caenorhabditis elegans: synchronizacja i obserwacja
June 10th, 2012
Łatwość utrzymania i rozmnażania nicienia C. elegans sprawia, że jest to ciekawy organizm modelowy do pracy. Możliwość synchronizacji robaków pozwala na pracę ze znaczną liczbą osób na tym samym etapie rozwoju, co ułatwia badanie jednego konkretnego procesu u wielu zwierząt.
W tym filmie pokażemy, jak zsynchronizować elegancję C na pierwszym poziomie. Jest to prosta metoda, ale bardzo powszechna, więc będzie bardzo przydatna. Jesteś jeszcze początkującym.
Jeśli jesteś ekspertem w C, możesz znaleźć tutaj kilka wskazówek, jak zoptymalizować ten protokół. Podstawa synchronizacji robaków opiera się na względnej odporności clen i zarodków na alkaliczny roztwór podchlorynu dorosłych królików. Że te dorosłe robaki z wieloma zarodkami w środku są inkubowane z roztworem podchlorynu, tak aby zostały zabite i pozostały tylko zarodki.
Druga część synchronizacji jest osiągana przez brak pokarmu, tak że mimo że zarodki łapią się w różnym czasie, nie rozwijają się dalej niż jeden L. Pierwszym krokiem do rozpoczęcia protokołu blitzingu jest umieszczenie robaków na etapie leżenia jaj, a następnie kilka jaj rozrzuconych na talerzu. Użyj M nine, aby odzyskać dorosłe osobniki w celu zebrania plonów.
Ponadto zarodki, które już prowadzą powierzchnię płytki, można zeskrobać miękkim materiałem, takim jak kawałek filmu rentgenowskiego, zmyć odzyskane bakterie za pomocą kilku płukań M nine. Zwykle wystarczy para. Po umyciu robaków nadszedł czas, aby dodać świeżo przygotowany roztwór wybielający zgodnie z naszymi preferencjami.
Kontroluj czas inkubacji podczas potrząsania probówką. Możesz monitorować pokolenie dorosłych pod mikroskopem stereoskopowym. Gdy prawie żadne tusze nie są wskazane, zatrzymaj reakcję, dodając M dziewięć, aż probówka będzie całkowicie pełna.
Aby zakończyć protokół, wykonaj co najmniej trzy prania. Z M nine Jaja są inkubowane z ciągłym wahaniem przez noc w buforze M nine, co umożliwia wykluwanie, ale zapobiega dalszemu rozwojowi robaków. Chociaż synchronizację można wykonać w dowolnej temperaturze od 15 do 25 stopni, zalecana jest 15
.Ponieważ rozwój jest wolniejszy, Jak wspomnieliśmy podczas jego rozwoju, elegan przechodzi przez cztery stadia larwalne przed osiągnięciem dorosłości, czas, w zależności od temperatury, w której jest hodowany. Podczas gdy typ C, elgan toleruje temperatury wzrostu w zakresie od 15 do 25 stopni. Tempo wzrostu jest jednak wyższe.
Górna temperatura tutaj, można zobaczyć, jak po 24 godzinach etapy, na których znajdują się robaki, są różne. W 15 i 25 stopniach po 48 godzinach w 25 stopniach obserwujemy już zarodki. Musimy jednak poczekać ponad 80 godzin, aby zobaczyć zarodki na powierzchni płytek.
W przypadku robaków rosnących w temperaturze 15 stopni, aby uzyskać optymalne wyniki, podczas przeprowadzania eksperymentu błyskawicznego należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Ważne jest również, aby rozpoznać robaki, które są etapem pożądanym do przeprowadzenia eksperymentu. Pokażemy Ci, jak rozróżnić etapy według rozmiaru, interferencji różnicowej, mikroskopii kontrastowej lub barwienia.
Na tym wykresie możesz docenić tempo wzrostu robaków GaN, w zależności od temperatury, jak mówimy, rosną znacznie szybciej w temperaturze 25 stopni. Istnieje korelacja między wielkością zwierząt a rozwojem elementów morskich. Dzięki odpowiedniemu oprogramowaniu zwierzęta mogą być mierzone, a następnie klasyfikowane do właściwej strefy rozwojowej.
Jednak zgodnie z tym wykresem miejsce jest ogólnym markerem etapów rozwoju. Bardziej uzgodnioną inscenizację można osiągnąć, obserwując części mórz, anatomię, która może być wykorzystana i rozpoznana przez interferencję różnicową, mikroskopię kontrastową lub barwienie DPI. W naszym laboratorium użyliśmy tego protokołu do synchronizacji robaków do różnych eksperymentów jako mikrojaj w barwieniu mono, wizualizacji in situ i barwieniu w górę.
Co więcej, protokół ten pomaga również pozbyć się zanieczyszczeń. W celu zwiększenia kontrastu stosuje się kontrast interferencyjny różnicowy lub mikroskopię nomar. W niebarwionych przezroczystych próbkach zwierzęta są umieszczane żywe na podstawie 2%Agros agros można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze czterech stopni w razie potrzeby.
Można go stopić i przechowywać w temperaturze 65 stopni. Gdy agros się rozpuści, połóż trochę taśmy na szkiełku i umieść je po obu stronach trzeciego szkiełka. Ostrożnie weź trochę agros i połóż kroplę na zjeżdżalni bez taśmy.
Przykryj agros innym szkiełkiem umieszczonym poprzecznie. Gdy ścieżka jest solidna, oddziel dwa slajdy, ostrożnie przesuwając jeden na drugim. Podkładka przyklei się do jednego z nich.
Dodaj trochę Amazon na podkładce, aby unieruchomić robaki. Zbierz kilka robaków pod mikroskopem preparacyjnym i przenieś je do kropli lele. Unikanie uszkodzenia ścieżki.
Weź szkiełko nakrywkowe i dodaj trochę lakieru do paznokci na krawędziach Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na tym szkiełku, zapobiegając tworzeniu się jelit. Preparat można obserwować od razu pod mikroskopem. Jedną z najprostszych cech anatomii Elgana jest Alva.
Na przykład aava w kształcie bożonarodzeniowej trójki jest charakterystyczna dla etapu L czwórka. Szczegółowe informacje na temat anatomii c elgana poprzez rozwój można uzyskać od www.orla.org. Barwienie tapis jest powszechną procedurą identyfikacji pojedynczych komórek.
Mocowanie za pomocą tunelu to szybka metoda naprawy robaków. Aby uzyskać delikatne barwienie, najpierw dodaj kroplę buforu M nine na powierzchnię szkiełka mikroskopowego. Zbierz kilka robaków bezpośrednio z talerza i przenieś je do kropli M dziewięć.
Wyeliminuj nadmiar M nine za pomocą rurki lub miękkiej tkanki. Dodaj tunel do robaków. Zrób to jeszcze raz.
Gdy pierwsza kropla wyschnie, dodaj trochę podłoża montażowego z API i zaśpij przed zabraniem preparatu do mikroskopu. Rozwój go można łatwo zaobserwować w ciepłym stencie z api.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To wideo pokazuje prostą, ale skuteczną metodę synchronizacji nicienia C. elegans na pierwszym etapie larw. Synchronizacja pozwala badaczom badać procesy rozwojowe na jednolitej populacji robaków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwoju
- Organizmy modelowe
Tło
- C. elegans jest szeroko stosowanym organizmem modelowym ze względu na łatwość utrzymania.
- Synchronizacja robaków ułatwia badanie określonych procesów rozwojowych.
- Metoda opiera się na różnicowej odporności zarodków na podchloryn wapnia.
- Dorosłe robaki są poddawane obróbce w celu izolowaniu zarodków w celu synchronizacji.
Cel badania
- Dostarczyć protokół synchronizacji C. elegans na pierwszym etapie larw.
- Pomóc początkującym w zrozumieniu procesu synchronizacji.
- Zaoferować wskazówki dotyczące optymalizacji dla doświadczonych badaczy.
Stosowane metody
- Inkubacja dorosłych C. elegans z roztworem podchlorynu wapnia.
- Izolowanie zarodków z dorosłych robaków.
- Synchronizacja zarodków w celu zapewnienia jednorodnych etapów rozwoju.
- Wizyjna demonstracja protokołu w formacie wideo.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie izolowuje zarodki w celu synchronizacji.
- Badacze mogą pracować z dużą liczbą robaków na tym samym etapie rozwoju.
- Wskazówka dotycząca optymalizacji poprawia wydajność protokołu.
- Format wideo pomaga w zrozumieniu procedury.
Wnioski
- Synchronizacja C. elegans jest cenną techniką w biologii rozwoju.
- Protokół jest dostępny dla początkujących i przydatny dla zaawansowanych badaczy.
- Skuteczna synchronizacja pozwala na bardziej kontrolowane warunki eksperymentalne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Synchronization and precise observation of Caenorhabditis elegans populations enable high-confidence developmental and molecular studies critical for early-stage target validation and mechanistic de-risking. Uniform staging supports reproducible phenotypic screening and quantitative assay development, directly impacting predictive confidence in discovery pipelines. These foundational methods underpin scalable, cross-functional workflows for translational research and preclinical model alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of developmental pathways and gene function in a conserved, tractable system.
- Supports biological de-risking by providing synchronized populations for controlled hypothesis testing.
- Facilitates functional target validation through reproducible developmental staging and observation.
- Improves predictive confidence for downstream portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, stage-matched populations for high-throughput RNAi screens and molecular assays.
- Enhances assay reproducibility and quantitative output by minimizing developmental variability.
- Enables reliable compound evaluation and platform reuse across diverse experimental modalities.
- Supports preparation of validated biological systems for scalable screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant pathways due to evolutionary conservation of cellular processes.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting robust model system development.
- Reduces translational risk by enabling precise phenotypic and molecular readouts in synchronized populations.
- Facilitates biomarker discovery and mechanistic studies relevant to human biology.
Pipeline & Workflow Integration
Synchronization and observation of C. elegans integrate at the interface of early discovery, lead identification, and preclinical research, supporting hypothesis-driven experimentation and scalable assay development.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification through controlled developmental staging.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible populations for quantitative screening and molecular profiling.
- Analytics: Enables measurement of developmental progression, cell-specific markers, and quantitative phenotypes.
- Translational Research: Provides a bridge to preclinical models by leveraging conserved biology and robust phenotypic outputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for diverse experimental and screening needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes developmental staging, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and robust advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode handling, microscopy, and developmental staging.
- Needs access to stereo and differential interference contrast microscopy for accurate observation.
- Demands cross-team standardization of synchronization and staging protocols.
- Adaptation may be needed for specific assay formats or model system requirements.
- Practical limitations include temperature sensitivity and the need for precise timing during synchronization.
