Name: Podstawowe metody Caenorhabditis elegans: synchronizacja i obserwacja (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Poznaj metodę synchronizacji Caenorhabditis elegans na pierwszym etapie larwalnym przy użyciu roztworu zasadowego podchlorynu sodu. Protokół ten umożliwia badanie procesów rozwojowych w jednorodnej populacji nicieni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować MICINN (program PTA wspierający Montserrat Porta de la Riva), AGAUR (stypendium doktoranckie dla Laura Fontrodona), Instituto de Salud Carlos III (program Miguel Servet wspierający Julián Cerón) oraz Marie Curie IRG, ISCIII i IDIBELL za sfinansowanie laboratorium.

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWood%2C+WB+%22The+nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The nematode Caenorhabditis elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).</li>
<li>Potts, M. B., Cameron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+and+cell+death%3A+Caenorhabditis+elegans+and+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell lineage and cell death: Caenorhabditis elegans and cancer research.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 50-58 (2011).</li>
<li>Kimble, J., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postembryonic+cell+lineages+of+the+hermaphrodite+and+male+gonads+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 70, 396-417 (1979).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-24 (2010).</li>
<li>Depuydt, G., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+metabolism+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein metabolism and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 81-107 (2010).</li>
<li>Jia, K., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+longevity%3A+lessons+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and longevity: lessons from C. elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 47-60 (2010).</li>
<li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev. Dyn. 239, 1539-1554 (2010).</li>
<li>Waters, K. A., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+control+of+germ+cell+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic control of germ cell proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 151-160 (2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+calorie-independent+life+span+extension+from+dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Dev. Biol. 8, 49(2008).</li>
<li>Olahova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox-sensitive+peroxiredoxin+that+is+important+for+longevity+has+tissue-+and+stress-specific+roles+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A redox-sensitive peroxiredoxin that is important for longevity has tissue- and stress-specific roles in stress resistance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19839-19344 (2008).</li>
<li>Voisine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+therapeutic+drugs+for+huntington%27s+disease+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 2, e504(2007).</li>
<li>Garigan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Aceves, J., Erlij, D., Martinez-Maranon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+paralysing+action+of+tetramisole+on+Ascaris+somatic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the paralysing action of tetramisole on Ascaris somatic muscle.</a> Br. J. Pharmacol. 38, 602-607 (1970).</li>
<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Methods in cell biology.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbardm, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10417-10422 (2002).</li>
<li>Protocols [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://protocols.mmml.nl">http://protocols.mmml.nl</a> (2012).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Synchronizacja nicieni
Opisano kilka roztworów do wybielania. Przetestowaliśmy pięć różnych receptur (Tabela I), które w naszych badaniach nie wykazały istotnych różnic w synchronizacji populacji nicieni (Rys. 1). Jednak nasze eksperymenty wykazały, że parametry takie jak temperatura (Rys. 2), stosunek roztworu wybielającego do objętości nicieni (Rys. 3) oraz objętość buforu M9, w którym inkubowane są embriony w celu wyklucia (<s...

podstawowe metody pracy z caenorhabditis elegans: synchronizacja i obserwacja

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Badania nad biologią molekularną i rozwojową nicieni Caenorhabditis elegans rozpoczęto na początku lat siedemdziesiątych Sydney Brenner, od tego czasu organizm ten jest szeroko wykorzystywany jako organizm modelowy 1. C. elegans posiada kluczowe cechy, takie jak prostota, przezroczystość i krótki cykl życiowy, dzięki którym od wielu lat stanowi odpowiedni system eksperymentalny do podstawowych badań biologicznych 2. Odkrycia dokonane u tego nicienia mają szerokie znaczenie, ponieważ wiele procesów komórkowych i molekularnych kontrolujących rozwój zwierząt jest konserwatywne ewolucyjnie 3.
C. elegans przechodzi cykl życiowy obejmujący stadium embrionalne i cztery stadia larwalne, zanim zwierzęta osiągną wiek dorosły. Rozwój może trwać od 2 do 4 dni w zależności od temperatury. W każdym z tych stadiów można zaobserwować kilka charakterystycznych cech. Znajomość pełnego rodowodu komórkowego 4,5 wraz z głęboką adnotacją genomu czynią ten nicień doskonałym modelem w tak zróżnicowanych dziedzinach jak neurobiologia 6, starzenie 7,8, biologia komórek macierzystych 9 oraz biologia linii zarodkowej 10.
Dodatkową cechą, która sprawia, że C. elegans jest atrakcyjnym modelem badawczym, jest możliwość uzyskania populacji nicieni zsynchronizowanych na konkretnym etapie rozwoju dzięki stosunkowo prostemu protokołowi. Łatwość utrzymania i namnażania tego nicienia, w połączeniu z możliwością synchronizacji, stanowi potężne narzędzie do pozyskiwania dużych ilości osobników, które mogą być wykorzystane w szerokiej gamie eksperymentów niskoprzepustowych lub wysokoprzepustowych, takich jak między innymi przesiewy RNAi, mikromacierze, sekwencjonowanie masowe, immunoblotting czy hybrydyzacja in situ.
Ze względu na swoją przezroczystość, struktury C. elegans można rozróżnić pod mikroskopem, wykorzystując mikroskopię kontrastu interferencyjnego, znaną również jako mikroskopia Nomarskiego. Zastosowanie fluorescencyjnego związku wiążącego DNA, np. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), pozwala na specyficzną identyfikację i lokalizację poszczególnych komórek, a także powiązanych z nimi struktur lub defektów wewnątrzkomórkowych.

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Badania nad biologią molekularną i rozwojową nicienia Caenorhabditis elegans zostały zapoczątkowane na początku lat siedemdziesiątych przez Sydneya Brennera i ...

W tym filmie pokażemy Państwu, jak synchronizować *C. elegans* na etapie pierwszego stadium larwalnego (L1). Jest to metoda prosta, lecz bardzo powszechna, zatem okaże się ona niezwykle użyteczna dla osób rozpoczynających pracę z tym organizmem.Jeśli jesteś ekspertem w tej dziedzinie, możesz znaleźć tutaj kilka wskazówek dotyczących optymalizacji tego protokołu. Podstawą synchronizacji nicieni jest względna odporność embrionów w porównaniu do dorosłych osobników na zasadowy roztwór podchlorynu. Dorosłe nicienie, zawierające wewnątrz liczne embriony, są inkubowane w roztworze podchlorynu w taki sposób, aby zostały zabite, pozostawiając jedynie żywe embriony.Druga część synchronizacji jest osiągana poprzez brak pożywienia, dzięki czemu mimo że embriony wykluwają się w różnym czasie, nie rozwijają się poza stadium L1. Pierwszym krokiem w celu rozpoczęcia protokołu błyskawicznego jest doprowadzenie nicieni do etapu składania jaj, tak aby na płytce znalazło się kilka rozproszonych jaj. Do odzyskania dorosłych osobników w celu zbioru należy użyć M9.Dodatkowo zarodki znajdujące się już na powierzchni płytki można zebrać, zeskrobując je miękkim materiałem, np. fragmentem kliszy rentgenowsk

basic-caenorhabditis-elegans-methods-synchronization-and-observation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Podstawowe Caenorhabditis elegans metody: Synchronizacja i obserwacja

W tym filmie pokazujemy metodę wytwarzania rozwojowo zsynchronizowanej populacji bezpłodnych dorosłych C. elegans. Przykładowy protokół synchronizuje robaki w celu zbadania wskaźników zużycia tlenu u żywych zwierząt.

Synchronizacja nicieni: metoda uzyskiwania populacji robaków w identycznych stadiach rozwoju

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Tutaj przedstawiono standardowe protokoły do oceny indukcji reakcji na szok cieplny (HSR) u Caenorhabditis elegans za pomocą RT-qPCR na poziomie molekularnym, fluorescencyjnych reporterów na poziomie komórkowym i termoregeneracji na poziomie organizmu.

Znormalizowane metody pomiaru indukcji reakcji na szok cieplny u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.

Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

Badanie to analizuje wpływ wieku na lokomocję u C. elegans poprzez pomiar największego wykładnika Lyapunova (LLE). Wraz z wiekiem C. elegans wykazują wzrost i późniejszy spadek kontroli motorycznej. Wyniki pokazują szczyt LLE po pięciu dniach, a następnie spadek wraz z wiekiem robaków.

Wiekowa dynamika lokomocji u Caenorhabditis elegans: analiza wykładnika Lyapunova

Poznaj metodę synchronizacji Caenorhabditis elegans na pierwszym etapie larwalnym przy użyciu roztworu zasadowego podchlorynu sodu. Protokół ten umożliwia badanie procesów rozwojowych w jednorodnej populacji nicieni.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Przeglądaj więcej filmów