Oznaczanie morfologii mitochondriów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej
3 lipca 2025
W tym badaniu opisujemy krok po kroku protokół i kładziemy nacisk na kluczowe szczegóły dotyczące określania cech morfologicznych mitochondriów w żywych komórkach, w tym przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i analizę danych. Ta metoda jest powszechnie stosowana do badania morfologii mitochondriów w celu badania różnych schorzeń.
Nasze badania koncentrują się na podstawach neurofarmakologii. W szczególności badamy, jak działają cząsteczki leków. Naszym celem jest zrozumienie związku między potencjalnymi związkami leków a funkcją mitochondriów w chorobie Parkinsona.
Wcześniejsze badania analizują długotrwałe wyzwania związane z analizą komórek laboratoryjnych, nawet w oparciu o wytyczne producenta. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy szczegółowy protokół oceny morfologii mitochondriów w komórkach laboratoryjnych krok po kroku. Nasz protokół wykorzystuje proste barwienie mitochondrialne, obrazowanie fluorescencyjne i oprogramowanie open source.
Zmniejsza to koszty, zwiększa dostępność i sprawia, że jest łatwiejszy w użyciu niż złożone alternatywy, takie jak mikroskopia elektronowa. Na początek należy uzyskać kultury komórek SH-SY5Y hodowanych w kolbach zawierających DMEM/F12, uzupełnionych 10% FBS. Oderwij komórki na jedną minutę za pomocą 0,05% roztworu trypsyny.
Następnie odwirować komórki o sile 100 G przez trzy minuty przed pasażem. Następnie zawiesić komórki SH-SY5Y w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej 1% FBS. Następnie umieść komórki na konfokalnych naczyniach ze szklanym dnem i utrzymuj je przez noc.
W przypadku stymulacji MPP+ należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą pożywką z 1-metylo-4-fenylopirydyną lub bez niej na 24 godziny. W przypadku barwienia MitoTracker rozcieńczyć roztwór podstawowy MitoTracker wstępnie podgrzanym podłożem DMEM/F12, aby uzyskać stężenie robocze 50 nanomolowych. Roztwór barwiący należy chronić przed światłem przez cały czas trwania zabiegu.
Usuń pożywkę hodowlaną z naczyń konfokalnych. Umyj komórki dwukrotnie świeżym DMEM/F12. Następnie odpipetuj jeden mililitr roztworu roboczego MitoTracker do naczynia.
Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Teraz usuń roztwór roboczy MitoTracker i umyj naczynia dwukrotnie za pomocą DMEM/F12. Po ostatnim praniu dodaj jeden mililitr DMEM/F12 do każdego naczynia.
Inkubować w inkubatorze komórkowym przed obrazowaniem. Aby wstępnie zrównoważyć mikroskop konfokalny do obrazowania, pod panelem akwizycji dostosuj parametry ścieżki światła, ustawiając długości fal wzbudzenia i emisji. Ustaw rozmiar otworka na 1,2 jednostki przewiewnej, rozmiar skanowania pikseli na 1024 na 1024, czas przebywania pikseli na 2,4 mikrosekundy ze średnią dwóch.
Teraz użyj światła halogenowego, aby skupić się na komórkach za pomocą planapochromatycznej soczewki obiektywowej 60X o aperturze numerycznej 1,4, minimalizując fototoksyczność. Dostosuj moc lasera i wysokie napięcie tuż poniżej poziomu nasycenia. Następnie ustaw współczynnik powiększenia na trzy i uchwyć obrazy.
Przesuń obszar zainteresowania, aby ustawić ostrość na innych komórkach pod mikroskopem. Następnie rób zdjęcia bez zmiany jakichkolwiek ustawień. Aby poprawić jakość obrazu przed transformacją binarną i szkieletyzacją, najpierw otwórz obraz.
Zaznacz obszar pojedynczej komórki za pomocą narzędzia ROI. Teraz sekwencyjnie kliknij proces, filtry, funkcję maski wyostrzającej, aby zwiększyć ostrość. Następnie użyj procesu i zwiększ kontrast, aby zmniejszyć wzmocnienie szumów.
Kliknij proces, filtry i opcję mediany, aby usunąć szum soli i pieprzu. Aby przekonwertować obraz na binarny, kliknij proces, a następnie binarny i wybierz opcję tworzenia binarnego. Szkieletyzuj obraz binarny, klikając pozycję proces, binarny i szkieletowy.
Następnie pogrupuj wszystkie piksele szkieletu, wybierając analizę, a następnie szkielet i funkcję analizuj szkielet 2D 3D. Uprość analizę, korzystając z narzędzia MiNA do obliczenia dziewięciu parametrów opisowych na szkieletowym obrazie. Intensywność fluorescencji barwienia mitochondriów wzrastała stopniowo wraz ze stężeniem czerwonego CMXRos MitoTracker od 25 nanomolowców do 200 nanomolowców.
Jednak przy 200 nanomolach zaobserwowano znaczne cytoplazmatyczne barwienie tła. Morfologia mitochondriów była lepiej zachowana w pożywce DMEM/F12 w porównaniu z PBS po jednej godzinie od barwienia, chociaż DMEM/F12 wykazywał również wyższą fluorescencję tła. Uśrednianie dwuklatkowe znacznie poprawiło stosunek sygnału do szumu w obrazowaniu mitochondrialnym w porównaniu z trybem pojedynczego skanowania.
Wydłużenie czasu przebywania pikseli z 2,4 do 10,8 mikrosekundy skutkowało jaśniejszymi obrazami, ale powodowało fotowybielanie. Wzrost wysokiego napięcia intensyfikował szum tła, podczas gdy zwiększona moc lasera prowadziła do fotowybielania. Narzędzie MiNA uzyskało spójne wyniki szkieletyzacji zarówno dla przyciemnionych, jak i jasnych obrazów, wskazując na solidną segmentację w różnych intensywnościach fluorescencji, przy czym jasny obraz wykazywał 5,5-krotnie większą intensywność niż obraz przyciemniony.
Leczenie MPP+ w dawce 500 mikromolów zaburzyło morfologię mitochondriów w komórkach SH-SY5Y w porównaniu z nieleczoną kontrolą, co spowodowało znaczne zmniejszenie śladu mitochondrialnego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia szczegółowy protokół oceny morfologii mitochondriów w żywych komórkach SH-SY5Y, istotny dla badań farmakologicznych, szczególnie w chorobie Parkinsona. Metoda podkreśla dostępność i niższe koszty poprzez zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego z barwieniem MitoTracker, omijając skomplikowane techniki takie jak mikroskopowe elektronowe.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neurofarmakologia
- Funkcja mitochondriów
- Techniki obrazowania komórek
Tło
- Wyzwania w analizie komórek laboratoryjnych utrzymują się mimo wskazówek producentów.
- To badanie zajmuje się tym, opisując krok po kroku protokół oceny morfologii mitochondriów.
- Celem jest zmniejszenie kosztów i poprawa dostępności dla badaczy.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnej metody analizy morfologii mitochondriów w żywych komórkach.
- Ułatwienie zrozumienia związków związków leków z funkcją mitochondriów w chorobach neurodegeneracyjnych.
- Porównanie skuteczności prostych metod barwienia z bardziej złożonymi technikami obrazowania.
Stosowane metody
- Główną platformą jest kultura żywych komórek.
- Komórki neuroblastoma SH-SY5Y są wykorzystywane jako model biologiczny do badania reakcji mitochondriów na środki farmakologiczne.
- Zbieranie obrazów polega na mikroskopii fluorescencyjnej i oprogramowaniu open-source do analizy danych.
- Kluczowe kroki obejmują oddzielenie komórek, barwienie MitoTracker, i techniki przetwarzania obrazu takie jak szkieletonizacja.
Główne wyniki
- Opracowany protokół pozwala na lepszą wizualizacje i analizę morfologii mitochondriów.
- Leczenie MPP+ wykazało znaczące zaburzenie struktury mitochondriów w komórkach leczonych w porównaniu do kontroli.
- Intensywność fluorescencji i szum tła są kluczowymi czynnikami jakości obrazu.
Wnioski
- To badanie ustanawia niezawodne i opłacalne podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w żywych neuronach.
- Metoda poprawia zrozumienie dynamiki mitochondriów w odpowiedzi na leki, szczególnie w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial morphology in live cells is critical for mechanistic de-risking and target validation in neurodegenerative disease research. This confocal microscopy protocol enables reproducible, cost-effective evaluation of mitochondrial dynamics, supporting predictive confidence in early discovery and translational workflows. The approach facilitates robust comparison of compound effects on mitochondrial structure, directly informing portfolio triage and advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial dynamics as a functional readout for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying morphological changes under pharmacological stress.
- Provides reproducible, quantitative data to inform predictive confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live-cell systems for downstream phenotypic screening of mitochondrial modulators.
- Standardizes imaging and analysis parameters to ensure assay reproducibility and comparability.
- Generates quantitative morphological outputs suitable for compound evaluation and triage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology metrics with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by linking in vitro findings to preclinical endpoints.
- Facilitates biomarker development through robust morphological quantification.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation, supporting iterative hypothesis testing and data-driven decision-making.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial morphology to clarify pathway effects and biological risk.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging outputs for compound screening workflows.
- Analytics: Provides robust, quantitative morphological parameters for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mitochondrial dynamics to disease-relevant phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse cell models and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and confocal microscopy operation.
- Needs access to fluorescence microscopes and open-source image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis parameters.
- Adaptable to various cell models with protocol optimization for each system.
- Careful calibration is necessary to minimize photobleaching and background fluorescence.
