Name: Zoptymalizowana metoda uprawy i bioaugmentacji mikroorganizmów Typha latifolia (pałki pałki) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę uprawy Typha latifolia z nasion i bioaugmentacji mikroorganizmów. Standardowe protokoły ułatwiają powtarzalne badania nad interakcjami roślin z mikrobami w ekosystemach bagiennych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AZ była finansowana przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) CGS-M Graduate Award. Badania nad CWTS w laboratorium Muench są wspierane przez Genome Canada poprzez grant Large Scale Applied Research Project (LSARP) (#18207) we współpracy z Genome Alberta i Genome Quebec.

1. Skaryzacja nasion
<ol>
	<li>Nasiona pałki pochodzą z terenów podmokłych w Calgary, AB, Kanada, jesienią 2023 roku (51.11312° N, 114.39381° W). Jesienią zbieraj kwiatostany pałki i przechowuj w papierowej torebce w ciemności do czasu użycia. Jeśli nadal na łodydze, zbierz kwiatostan wiosną, ale odzyskiwanie nasion będzie ograniczone.</li>
	<li>Nożycami ogrodowymi odetnij łodygę rośliny ~2 cm od podstawy kwiatostanu. Zdejmij nasiona z kwiatostanów i umieść je w blenderze laboratoryjnym, aż objętość blendera będzie mniej więcej w jednej czwartej pełna. To około 250 mL nasion niezagęszczonych.</li>
	<li>Napełnij blender 500 ml wody z kranu. Utrzymuj przestrzeń nad głową 10 cm w blenderze. Mieszaj z średnio-niską prędkością przez 20 sekund i natychmiast przelej do dużej zlewki o pojemności 1 L. Powstały roztwór powinien być lepki.</li>
	<li>Przelej około 100 ml tej osadowej wody z nasion z powrotem do blendera i napełnij go 400-600 ml świeżej wody z kranu. Mieszaj na średnio-wysokiej prędkości przez 20 sekund i natychmiast przelej do świeżej zlewki 1 L.</li>
	<li>Napełnij zlewkę wodą z kranu do 800 mL i pozostaw na co najmniej 60 sekund. Skaryfikowane i żywotne nasiona pałki opadają na dno zlewki, a pióropusz i dziób (patrz Rysunek 1 , aby opisać strukturę nasion pałki) unoszą się na powierzchnię. Zbierz osad na górze zlewki i powoli wylewaj wodę z kubka, nie naruszając nasion na dnie. Przełóż nasiona do zlewki o pojemności 100 mL.</li>
	<li>Powtórz proces mieszania na pozostałej części pałki od kroku 1.5.</li>
	<li>Umieść zlewkę z nasionami na podszyciu do mieszania i wiruj ze średnią prędkością przez 1 godzinę. Po godzinie zbierz wszelki materiał roślinny unoszący się na górze zlewki.</li>
	<li>Wlej nasiona do lejka Büchnera z papierem filtracyjnym przymocowanym do próżni, aby wysuszył je przez noc. Suche nasiona można przechowywać w temperaturze -20 °C w stożkowych tubkach polipropylenowych o pojemności 15 mL.</li>
</ol>
2. Kiełkowanie przy użyciu techniki niesterylnej
<ol>
	<li>Przygotuj półmocne płytki Murashige i Skoog (MS) z 1% fitoagaru12.</li>
	<li>Włóż około 1 ml suchych nasion do stożkowej rurki z polipropylenu o pojemności 15 ml i napełnij 10 ml wody z kranu. Obróć się na orbitalnym potrząsaczu z niską prędkością przez 24 godziny, aby wywołać kiełkowanie.</li>
	<li>Usuń nadmiar wody tak, aby 3 mL pozostało w stożkowej tubce z polipropylenu 15 mL.</li>
	<li>Wytnij końcówkę plastikowej pipety o pojemności 1000 μL, aby zwiększyć grubość otworu, i energicznie podaj roztwór nasion, aby zawiesić nasiona wewnątrz końcówki pipety.</li>
	<li>Umieść nasiona i wodę na płytkach agaru MS o połowie mocy. Zamieszaj talerzem, aby równomiernie rozłożyć nasiona.</li>
	<li>Owiń płytki w laboratoryjną folię uszczelniającą i umieść je w komorze wzrostu z cyklem światła-ciemność trwającym 16 h/8 h przy temperaturze 23 °C i wilgotności 70%. Inkubuj płytki przez tydzień (do 2 tygodni), aby wywołać kiełkowanie nasion.</li>
</ol>
3. Kiełkowanie metodą sterylną
UWAGA: Testowano i porównywano różne protokoły sterylizacji nasion. Technika, która dawała najwyższe współczynniki kiełkowania przy produkcji w pełni sterylnych nasion, została zmodyfikowana w stosunku do wcześniejszego protokołu13 i została opisana tutaj.
<ol>
	<li>Przygotuj płytki MS o połowie mocy z 1% fitoagaru12.</li>
	<li>Włóż objętość około 1 mL nasion do stożkowej probówki z polipropylenu o pojemności 15 mL i napełnij 10 mL sterylnego ddH2 O. Umieść na orbitalnym shakerze z średnią do wysokiej prędkości na 10 minut.</li>
	<li>Usuń wodę i dodaj 5 mL roztworu Polysorbate 20 o stężeniu 0,1% (przygotowanego w sterylnym ddH2O) do stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 15 mL. Umieść na orbitalnym wstrząsie z prędkością średnio-wysokiej prędkości na 10 minut.</li>
	<li>Usuń roztwór i dodaj 5 mL rozboju wybielacza komercyjnego 30% oraz 0,025% roztworu Polysorbate 20 (przygotowanego w sterylnym ddH2O) do stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 15 mL. Trzęsij z średnio-wysoką prędkością przez 30 minut.</li>
	<li>Usuń roztwór i zamień go sterylnym ddH2O. Wstrząśnij na średnio-wysokiej prędkości przez 5 minut. Powtarzam to łącznie 3 płukania wodą.</li>
	<li>Napełnij stożkową tubkę z polipropylenu o pojemności 15 mL sterylnym ddH2Oi obracaj z niską prędkością przez 24 godziny, aby wywołać kiełkowanie. Po 24 godzinach usuń nadmiar wody, aby w plastikowej tubce pozostało 3 mL.</li>
	<li>Aseptycznie wytnij końcówkę plastikowej pipety o pojemności 1000 μL i energicznie pipetuj, aby zawiesić nasiona w końcówce.</li>
	<li>Nasiona i płyn na płytkach MS agar o połowie mocy. Zamieszaj talerzem, aby równomiernie rozłożyć nasiona.</li>
	<li>Owiń płytki w laboratoryjną folię uszczelniającą i umieść w komorze wzrostu z cyklem światła-ciemność trwającym 16 h/8 h przy temperaturze 23 °C i wilgotności 70%. Zostawić płytki na tydzień (do 2 tygodni), aby umożliwić kiełkowanie.</li>
</ol>
4. Inokulacja nasion wybranymi bakteriami
<ol>
	<li>Aby zaszczepić nasiona pałki, najpierw stosuj powyższy protokół sterylnej kiełkowania nasion aż do kroku 3.6, aby uzyskać sterylne nasiona. Usuń ostatnią płukankę wodną z stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 15 mL, jak opisano w kroku 3.6 powyżej.</li>
	<li>Używając nocnych kultur mikroorganizmów zaszczepionych z pojedynczego izolatu lub wspólnoty, zmierz OD600 i normalizuj do wartości absorpcji 1,0 poprzez rozcieńczenie w podłożu hodowlanym. Inkubuj hodowle przez dłuższy czas, jeśli nie osiągniesz OD600 na poziomie 1,0. UWAGA: Tutaj ustanowiono hodowle z Luteimonas sp. wyizolowanego z korzeni roślin w północnej Albercie i sprzężonych w celu ekspresji fluorescencyjnego białka DsRed do mikroskopowej wizualizacji.</li>
	<li>Rozkręć 1 ml hodowli w dawce 9300 x g przez 2 minuty. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 1 mL soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Wiruj z 9300 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulat bakteryjny w 1 mL sterylnego ddH2O.</li>
	<li>W stożkowej probówce z polipropylenu o pojemności 15 mL wstrząśnij około 1 mL nasion z niską prędkością przez 24 godziny w 10 mL rozcieńczenia przygotowanego inokulum w stosunku 1:10 z 0,025% organozykolonem surfaktantem.</li>
	<li>Stosuj się do reszty protokołu sterylnej kiełkowania nasion zaczynając od kroku 3.8.</li>
</ol>
5. Niesterylny wzrost pałki na glebie
<ol>
	<li>Napełnij doniczki wybraną glebą o niskiej zawartości materii organicznej, zostawiając 1 cm przestrzeni od góry doniczki. Wstępnie zwilż glebę wodą z kranu i wyrób w glebie otwory o średnicy 1 cm.</li>
	<li>Używając pęsety, delikatnie usuń siewki kiełkujące po tygodniu z płytek agarowych MS uprawianych zgodnie z krokiem 3 powyżej, uważając, by nie uszkodzić korzeni. Delikatnie umieść sadzonkę w każdym dołku w ziemi i przykryj ją ziemią.</li>
	<li>Umieść doniczki w tacy i napełnij je wodą z kranu do poziomu gleby. Na każde 10 doniczek dodaj 100 ml nawozu 0,5% 20/20/20 NPK.</li>
	<li>Do każdego zestawu dziesięciu doniczek dodaj nawóz następująco: tydzień 2 - 100 mL nawozu 0,5%, tydzień 3 - 100 mL nawozu 1,0%, tydzień 4 - 100 ml nawozu 1,0%.</li>
	<li>Po 4 tygodniach przestań nawożenie co tydzień i nawoź tylko raz w miesiącu, podawając 100 ml roztworu nawozu 1,0%. Po 4 tygodniach przesadz do większych doniczek, jeśli trzeba. Rośliny są mniej wrażliwe na typ gleby, więc używaj dowolnej mieszanki.</li>
	<li>Kontynuuj przesadzanie pałki, gdy przerosną swoją pojemnik. Usuń martwe liście nożycami. Nawoz pałkę raz w miesiącu.</li>
	<li>Do eksperymentów przesadz sadzonki do małej doniczki, która po umieszczeniu na dnie pustej skrzynki z końcówką pipety jest zakotwiczona bokami pudełka. Pozwala to na prawidłowe zalanie gleby, co naśladuje warunki mokradeł. Jeśli przeprowadza się eksperymenty na starszych pałkach, modyfikują się podobnie, aby donica mogła być niemal całkowicie zanurzona w wodzie.</li>
</ol>
6. Wzrost bezpłodnych siewek
<ol>
	<li>Konstrukcja komory wzrostu siewek UWAGA: Montaż każdej jednostki komory wzrostu sadzonek wymaga dwóch pudełek hodowlanych, jednej strzykawki z końcówką luer lock, jednorazowego filtra sterylnego 0,2 μm oraz silikonu odpornego na wysoką temperaturę. Zobacz Rysunek 2 , aby zobaczyć wizualną prezentację układu komory.<ol>
		<li>Usuń pokrywki z pudełek do hodowli i użyj ręcznej wiertarki, aby zrobić otwory o średnicy 3,5 cm w środku pokrywek. Użyj silikonu odpornego na wysoką temperaturę, aby skleić górne części obu pokrywek.</li>
		<li>Wywierć otwór wielkości końcówki strzykawki (~ 1 cm średnicy) w dolnym rogu jednego z pudełek hodowlanych. Odetnij końcówkę strzykawki i wyrzuć jej ciało.</li>
		<li>Użyj silikonu odpornego na wysoką temperaturę, aby zamocować końcówkę strzykawki w pudełku hodowlowym za pomocą nici Luer lock na zewnątrz pudełka.</li>
		<li>Pozwól silikonowi utwardzić się co najmniej 24 godziny przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jałowy wzrost w glebie<ol>
		<li>Aby uzyskać sterylne nasiona, stosuj się według protokołu kiełkowania sterylnych nasion opisanych w kroku 3.</li>
		<li>Napełnij sterylną komorę wzrostu wybranym wyborem ziemią, zwilżoną wodą z kranu.</li>
		<li>Autoklawuj w cyklu płynnym 20 minut, przykrywając końcówkę blokującą przynętę folią aluminiową. Po 24 godzinach ponownie podaj system w cyklu płynnym 20 minut. Wszystkie kolejne etapy wykonuj w laminarnym okapu.</li>
		<li>Do zamka Luer w komorze wzrostu należy przymocować filtr o średnicy 0,2 μm (rysunek 2). Otwórz komorę wzrostu i dodaj do gleby 500 μL sterylizowanego przez filtr nawozu 1% 20/20/20. Wymieszaj ziemię sterylną łopatką. Podczas mieszania ziemi dodaj sterylne ddH20, aby zapewnić odpowiednie nawodnienie bez przesycenia.</li>
		<li>Użyj sterylnej żyletki, aby pokroić agar MS z talerzy zawierających siewki sprzed tygodnia na ćwiartki. Użyj sterylnej łopatki, aby położyć kawałek agaru na ziemi.</li>
		<li>Umieść jednostkę komory wzrostu w inkubatorze roślin na cyklu 16 h/8h dzień i noc przy 23 °C i wilgotności 70%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzrost sterylny w roztworze hydroponicznym<ol>
		<li>Aby uzyskać sterylne nasiona, stosuj się według protokołu sterylnego kiełkowania opisanego w kroku 3.</li>
		<li>Autoklaw, pudełko z końcówką pipety i agar MS o połowie mocy w cyklu płynnym, 20-minutowym. W laminarnym okapie owiń dno wkładki końcówki sterylną folią laboratoryjną uszczelniającą. Napełnij każdy otwór na końcówce pipety agarem niemal do góry.</li>
		<li>Dodaj wkładkę z powrotem do pudełka z końcówką, wypełniając dno pudełka hydroponiczną roztworem Hoaglanda o połowie mocy (0,5 mM NH4H2PO4, 3 mM KNO3, 2 mM Ca(NO3)2, 1 mM MgSO4, 0,023 mM H3BO3, 0,005 mM MnCl2,4H 2O, 0,0004 mM ZnSO4,7H 2O, 0,0002 mM CuSO4,5H 2O, 0,00007 mM H2MoO4,1H 2O oraz 0,045 mM FeSO4,7H 2O, skorygowane do pH 7,0).</li>
		<li>Ostrożnie usuń sadzonki z płytek agaru MS i umieść je na agarze MS na agarze w otworze pipety w wkładce do pudełka z końcówkami.</li>
		<li>Zamknij pokrywę pudełka z końcówkami i umieść ją w komorze wzrostu na cyklu 16 h/8 h dzień i noc przy 23 °C i wilgotności 70%.</li>
		<li>Gdy rośliny są zbyt duże do kontenera z końcówkami, przesadź je do komory wzrostu kultury opisanej w kroku 5.1. Aby przenieść roślinę, usuń cały korek agarowy razem z rośliną i przenieś go do piankowego korka z promieniowym cięciem. Korek piankowy można umieścić pomiędzy dwoma pudrami kultury, a dolne pudełko można napełnić półmocnymi Hoaglandami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ciria, M. P., Solano, M. L., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Macrophyte+Typha+latifolia+in+a+Constructed+Wetland+for+Wastewater+Treatment+and+Assessment+of+Its+Potential+as+a+Biomass+Fuel%5BTitle%5D)+AND+%22Biosys+Eng%22%5BJournal%5D)">Role of Macrophyte Typha latifolia in a Constructed Wetland for Wastewater Treatment and Assessment of Its Potential as a Biomass Fuel.</a> Biosys Eng. 92 (4), 535-544 (2005).</li>
<li>Shelef, O., Gross, A., Rachmilevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Plants+in+a+Constructed+Wetland%3A+Current+and+New+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Water%22%5BJournal%5D)">Role of Plants in a Constructed Wetland: Current and New Perspectives.</a> Water. 5 (2), 405-419 (2013).</li>
<li>Parde, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+constructed+wetland+on+type%2C+treatment+and+technology+of+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Tech+Innovation%22%5BJournal%5D)">A review of constructed wetland on type, treatment and technology of wastewater.</a> Environ Tech Innovation. 21, 101261(2021).</li>
<li>Abdullah, S. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-assisted+remediation+of+hydrocarbons+in+water+and+soil%3A+Application%2C+mechanisms%2C+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Plant-assisted remediation of hydrocarbons in water and soil: Application, mechanisms, challenges and opportunities.</a> Chemosphere. 247, 125932(2020).</li>
<li>Noor, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy+metal+and+metalloid+toxicity+in+horticultural+plants%3A+Tolerance+mechanism+and+remediation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Heavy metal and metalloid toxicity in horticultural plants: Tolerance mechanism and remediation strategies.</a> Chemosphere. 303, 135196(2022).</li>
<li>Vymazal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plants+used+in+constructed+wetlands+with+horizontal+subsurface+flow%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Plants used in constructed wetlands with horizontal subsurface flow: A review.</a> Hydrobiologia. 674 (1), 133-156 (2011).</li>
<li>Sandoval, L., Zamora-Castro, S. A., Vidal-Álvarez, M., Marín-Muñiz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Wetland+Plants+and+Use+of+Ornamental+Flowering+Plants+in+Constructed+Wetlands+for+Wastewater+Treatment%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Wetland Plants and Use of Ornamental Flowering Plants in Constructed Wetlands for Wastewater Treatment: A Review.</a> Appl Sci. 9 (4), 685(2019).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructed+wetlands+for+pollution+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Earth+Environ%22%5BJournal%5D)">Constructed wetlands for pollution control.</a> Nat Rev Earth Environ. 4, 218-234 (2023).</li>
<li>Yang, Y., Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytoremediation+of+cadmium-contaminated+wetland+soil+with+Typha+latifolia+L.+and+the+underlying+mechanisms+involved+in+the+heavy-metal+uptake+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollution+Res%22%5BJournal%5D)">Phytoremediation of cadmium-contaminated wetland soil with Typha latifolia L. and the underlying mechanisms involved in the heavy-metal uptake and removal.</a> Environ Sci Pollution Res. 27 (5), 4905-4916 (2020).</li>
<li>Leto, C., Tuttolomondo, T., La Bella, S., Leone, R., Licata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+plant+species+in+a+horizontal+subsurface+flow+constructed+wetland+-+phytoremediation+of+treated+urban+wastewater+with+Cyperus+alternifolius+L.+and+Typha+latifolia+L.+in+the+West+of+Sicily+%28Italy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Eng%22%5BJournal%5D)">Effects of plant species in a horizontal subsurface flow constructed wetland - phytoremediation of treated urban wastewater with Cyperus alternifolius L. and Typha latifolia L. in the West of Sicily (Italy).</a> Ecol Eng. 61, 282-291 (2013).</li>
<li>Sesin, V., Davy, C. M., Freeland, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Typha+spp.+%28cattails%29+as+toxicity+test+species+for+the+risk+assessment+of+environmental+contaminants+on+emergent+macrophytes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollution%22%5BJournal%5D)">Review of Typha spp. (cattails) as toxicity test species for the risk assessment of environmental contaminants on emergent macrophytes.</a> Environ Pollution. 284, 117105(2021).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Revised+Medium+for+Rapid+Growth+and+Bio+Assays+with+Tobacco+Tissue+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plantarum%22%5BJournal%5D)">A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures.</a> Physiol Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Rogers, S., Beech, J., Sarma, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+regeneration+and+plant+acclimatization+of+the+wetland+monocot+cattail+%28Typha+latifolia%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Shoot regeneration and plant acclimatization of the wetland monocot cattail (Typha latifolia).</a> Plant Cell Rep. 18 (1), 71-75 (1998).</li>
<li>Tangen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+native+and+invasive+Typha+%28cattail%29+throughout+the+Prairie+Pothole+Region+of+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22Wetlands+Ecol+Management%22%5BJournal%5D)">Distributions of native and invasive Typha (cattail) throughout the Prairie Pothole Region of North America.</a> Wetlands Ecol Management. 30 (1), 1-17 (2022).</li>
<li>Pieper, S. J., Nicholls, A. A., Freeland, J. R., Dorken, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Hybridization+in+Cattails+%28Typha+spp.%29+and+Its+Implications+for+the+Evolutionary+Maintenance+of+Native+Typha+latifolia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heredity%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Hybridization in Cattails (Typha spp.) and Its Implications for the Evolutionary Maintenance of Native Typha latifolia.</a> J Heredity. 108 (5), 479-487 (2017).</li>
<li>Lansdown, R. V. Typha latifolia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLansdown%2C+RV+%22The+IUCN+Red+List+of+Threatened+Species+2017%22">The IUCN Red List of Threatened Species 2017</a>. , (2017).</li>
<li>Bedish, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cattail+Moisture+Requirements+and+their+Significance+to+Marsh+Management%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Midland+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Cattail Moisture Requirements and their Significance to Marsh Management.</a> Am Midland Naturalist. 78 (2), 288(1967).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół zawiera szczegółowy przewodnik po uprawie gatunków pałki z nasion do zastosowań laboratoryjnych. Chociaż pałkę można łatwo rozmnażać z sadzonek kłącza, wysadzanie roślin z nasion pozwala na zmienność genetyczną w obrębie zestawu próbek, zapewnia roślinom równy etap wzrostu i daje możliwość wczesnej kolonizacji w ramach eksperymentów bioaugmentacji mikroorganizmów. Ważne jest, aby prawidłowo zidentyfikować zbierany gatunek, ponieważ rozmnażanie bardziej inwazyjnych gatunków pałki może sprzyjać...

Jako technologia oszczędna i energooszczędna, konstruowane systemy oczyszczania terenów podmokłych (CWTS) zyskały znaczną popularność w zakresie usuwania zanieczyszczeń środowiskowych 1,2,3. CWTS wykorzystuje procesy fizyczne, chemiczne i biologiczne do usuwania, przekształcania lub stabilizowania zanieczyszczeń. Chociaż procesy fizyczne i chemiczne związane z wymianą chemiczną zostały dobrze scharakteryzowane od czasu powstania CWTS, wpływ roślinności pozostał w dużej mierze zagadkowy2. W ostatnich latach wzrasta nacisk na zrozumienie mechanizmów, dzięki którym rośliny przekształcają zanieczyszczenia organiczne i nieorganiczne budzące potencjalne obawy w ściekach 2,4,5. Jednak takie badania mechanistyczne opierają się na zdolności do uprawy dużej liczby makrofitów i faworyzowaniu wzrostu z nasion, aby zapewnić, że każda roślina jest na tym samym etapie wzrostu i rozwoju.
CWT w Ameryce Północnej często zakłada się na roślinności pochodzącej z naturalnych terenów podmokłych regionu, takiej jak Typha, Scirpus, Juncus oraz Phragmites species 6,7. Wybór roślinności zależy również od wykorzystywanego użytego terenu podmokłego, który może się różnić pod względem głębokości, przepływu wody, pozyskiwania podłoża oraz pozyskiwania wody (z recyrkulacją lub bez)2. Wreszcie, klimat wpływa również na roślinność terenów podmokłych, gdzie chłodniejsze klimaty sprzyjają roślinom zanurzonym ze względu na ich większą elastyczność8. Gatunki typha są szczególnie interesujące w głębokich, powierzchniowych terenach podmokłych ze względu na zdolność szybkiego kolonizowania środowiska i adaptacji do różnorodnych warunków środowiskowych 9,10.
Niedawny przegląd wyników wykazał, że spośród 87 testów fitotoksyczności z udziałem gatunków Typha , tylko 15 badań rozpoczęło badania roślin testowych od nasion, a z nich tylko jedno badanie badało wzrost u dojrzałychroślin 11. To niedostateczne przedstawienie eksperymentów z pałką z nasion wskazuje na lukę w literaturze dotyczącą protokołów mających na celu opisanie uprawy pałki w badaniach laboratoryjnych. Protokoły przedstawione tutaj mają na celu zniwelowanie tej luki poprzez przedstawienie szczegółowego protokołu wzrostu Typha latifolia od nasion do dojrzałej rośliny w warunkach sterylnych i niesterylnych. Ponadto artykuł omawia technikę bioaugmentacji bakteryjnej gatunków pałki na etapie nasion, gdzie wczesna inokulacja może pomóc utrzymać długotrwałą trwałość introdukowanych mikrobótów rhizo- i endofitowych.

<table><tbody><tr><td>0,2 & mikro; Filtr sterylny m</td><td>VWR</td><td>514-4126</td><td></td></tr><tr><td>3&prime;,5&prime;-Dimetoksi-4&prime;-hydroksyacetofenon</td><td>PhytoTech Labs</td><td>S7777</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka hodowli z pokrywkami (77 mm & razy; 77 mm & razy; 97 mm)</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>V8505</td><td></td></tr><tr><td>Termiczny silikonowy uszczelniacz o wysokiej temperaturze</td><td>Imperial Manufacturing Group</td><td>KK0205</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca laboratoryjna</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Murashige i Skoog media&nbsp;</td><td>PhytoTech Labs</td><td>M401</td><td></td></tr><tr><td>Organosilikonowy surfaktant</td><td>PhytoTech Labs</td><td>S7777</td><td></td></tr><tr><td>Phytoagar&nbsp;</td><td>GoldBiotechnology</td><td>P1003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbat 20</td><td>Roche</td><td>11332465001</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana metoda uprawy i bioaugmentacji mikroorganizmów typha latifolia (pałki pałki)

Optimized Method for Cultivation and Microbial Bioaugmentation of Typha latifolia (Cattail)

Typha latifolia, powszechnie znana jako pałka liściasta lub pospolita sitowisko, ma zasięg zasięgu globalnego i dominuje w ekosystemach terenów podmokłych w Ameryce Północnej. Podczas gdy różne gatunki pałki są często uważane za inwazyjne w Ameryce Północnej, T. latifolia jest uznawana za rodzimy gatunek regionu i występuje na całym kontynencie jako dominujący gatunek Typha . Historycznie Typha pełniła różne funkcje, od źródeł żywności po materiały budowlane. W ostatnich latach T . latifolia stała się ważnym gatunkiem wspierającym działania bioremediacyjne. Wraz ze wzrostem zainteresowania rozwojem konstruowanych systemów oczyszczania terenów podmokłych (CWTS) do remediacji zanieczyszczeń, konieczne są powtarzalne techniki hodowli pałki w środowisku laboratoryjnym. Przedstawione tutaj prace analizowały i testowały różne parametry wzrostu skutecznej uprawy T. latifolia z nasion. Pomyślne kiełkowanie gatunków Typha polega na skalaracji (pęknięciu otoczki nasiennej), co osiągnięto za pomocą technik mechanicznych do produkcji na dużą skalę. Wczesne zakorzenienie nasion sprzyjało niskim warunkom wzrostu składników odżywczych przez pierwszy tydzień, a następnie w kolejnych tygodniach wprowadzano nawozy w celu zwiększenia przeżycia po przesadzeniu. W przypadku bioaugmentacji mikrobiologicznej systemu roślinnego wyniki wykazały, że moczenie nasion w inokulum prowadzi do bardziej rozległej kolonizacji tkanki korzeniowej i długotrwałej trwałości bakterii. Zastosowano zoptymalizowaną technikę sterylizacji nasion z wykorzystaniem kombinacji wybielacza i detergentu, aby poprawić skuteczność kolonizacji mikroorganizmów. Naczynia wzrostowe, zarówno sterylne, jak i niesterylne, zaprojektowane w tym badaniu, wspierają długoterminowy wzrost T. latifolia w różnych warunkach.

Rysunek 1 przedstawia nasiono Typha, które przeszło proces skaryzacji, wraz z niecałkowicie skaryfikowanym nasionem z usuniętym dziobem oraz nasionem nieskaryfikowanym. Upewnij się, że czas mieszania jest wystarczający, aby uzyskać głównie w pełni skaryfikowane nasiona.
Po skaryfikacji i wysuszeniu nasion należy sprawdzić ich żywotność za pomocą techniki kiełkowania niesterylnej. Po 7 dniach co najmniej 20% nasion powinno mieć wyłaniający się rodnik z tka...

Typha latifolia, która rozmnaża się głównie bezpłciowo przez kłącza, stanowi wyzwania w zbieraniu ze względu na rozległy system korzeniowy. Niniejszy artykuł przedstawia metodę hodowli T. latifolia z nasion, ułatwiając uprawę laboratoryjną i oferując potencjał do jałowego wzrostu roślin oraz wczesnej bioaugmentacji mikrobiologicznej.

Zoptymalizowana metoda uprawy i bioaugmentacji mikroorganizmów Typha latifolia (pałki pałki)

Typha latifolia, more commonly known as the broadleaf cattail or the common bulrush, has a globally reaching range and dominates wetland ecosystems in ...

Nasza praca zajmuje się brakiem protokołów dotyczących uprawy pałki z nasion. Opracowaliśmy powtarzalne metody kiełkowania nasion, wczesnego wzrostu oraz bioaugmentacji mikroorganizmów, aby wspierać przyszłe badania nad mikroorganizmami roślinnymi. Niewiele badań hoduje pałkę z nasion lub śledzi ją do dojrzałości, a mimo to pałka jest powszechnie wykorzystywana w badaniach nad rekultywacją terenów podmokłych.Większość badań nad pałką polega na zakupie kłączy do rozmnażania pałki w badaniach laboratoryjnych. Niewiele badań hoduje pałkę z nasion, pozostawiając brak ustandaryzowanych metod. Osiągnięcie spójnej kiełkowania i trwałej kolonizacji wprowadzonych mikroorganizmów było poważnym wyzwaniem.Opracowaliśmy powtarzalne metody kiełkowania nasion i bioaugmentacji mikroorganizmów, pokazując, jak wczesne szczepienie wspiera długoterminową kolonizację. Na początek użyj nożyc ogrodowych, aby odciąć łodygę rośliny Typha latifolia około dwóch centymetrów od podstawy kwiatostanu. Zdejmij nasiona z kwiatostanu, przelej je do blendera laboratoryjnego, aż mieszarka będzie około 1/4 pełna, co odpowiada około 250 mililitrom niezagęszczonych nasion.Teraz napełnij blender 500 mililitrami wody z kranu, zapewniając 10-centymetrową przestrzeń głowicy. Mieszaj mieszankę w średniej wolnej prędkości przez 20 sekund i natychmiast przelej lepką zawartość do zlewki o pojemności jednego litra. Przelej około 100 mililitrów mieszanki z nasionami z powrotem do blendera.Następnie dodaj od 400 do 600 mililitrów świeżej wody z kranu i mieszaj na średniej prędkości przez 20 sekund. Wlej zawartość do świeżej, litrowej zlewki. Teraz napełnij zlewkę wodą z kranu do 800 mililitrów.Po odstawieniu na 60 sekund zbierz unoszącą się osadę z góry, nie naruszając nasion osiadających na dnie. Powoli wylej resztę wody i przelej nasiona do zlewki o pojemności 100 mililitrów. Powtórz proces mieszania dla pozostałego osadu wodnego z nasien. Następnie umieść zlewkę z oddzielonymi nasionami na talerzu do mieszania.Po mieszaniu zbierz pływające rośliny z powierzchni zlewki. Wlej nasiona do lejka Buchnera z papierem filtracyjnym przymocowanym do próżni i pozwól im wyschnąć przez noc. Przechowuj suszone nasiona w temperaturze 20 stopni Celsjusza w stożkowych tubkach polipropylenowych o pojemności 50 mililitrów.Przygotuj półmocne płytki Murashige i Skoog z agarem fitohydratowym o 1% mocy. Przełóż około jednego miligrama suszonych nasion do stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj do rurki 10 mililitrów sterylnej podwójnie destylowanej wody.Umieść tubę na orbitalnym wstrząsie z średnią prędkością na 10 minut. Następnie usuń wodę z rurki i dodaj pięć mililitrów roztworu 0,1% polisorbat 20 przygotowanego w sterylnej wodzie podwójnie destylowanej. Potrząsaj rurką na średniej prędkości przez 10 minut.Usuń roztwór polisorbatu 20. Wszystkie kolejne kroki wykonuj przed okapem płomiennym lub laminarnym. Zamień roztwór na pięć mililitrów wybielacza komercyjnego 30% i roztworu polisorbanu 20 0,025% przygotowanego w sterylnej wodzie podwójnie destylowanej.Zamień supernatant na sterylną wodę podwójnie destylowaną. Następnie potrząsaj rurką z dużą prędkością przez pięć minut. Po trzecim płukaniu obróć rurkę z niską prędkością przez 24 godziny, aby wywołać kiełkowanie.Następnego dnia usuń nadmiar wody i upewnij się, że w tubce pozostaną trzy mililitry płynu. Teraz aseptycznie, przetnij końcówkę plastikowej pipety o pojemności 1000 mikrolitrów. Użyj przeciętej pipety, aby energicznie pipetować i zawiesić nasiona w końcówce.Nałóż nasiona i płyn na pół silne płytki z agaru Murashige i Skoog. Delikatnie mieszaj talerzem, aby równomiernie rozłożyć nasiona. Owiń płytki folią uszczelniającą laboratoryjną, a następnie umieść je w komorze wzrostu z 16-godzinnym światłem i 8-godzinnym cyklem ciemności przy 23 stopniach Celsjusza i 70% wilgotności.Aby zaszczepić nasiona pałki, sterylizuj nasiona polisorbatem 20 wybielacza i podwójnie destylowaną wodą, jak pokazano. Zmierz gęstość optyczną nocnej hodowli izolatu Luteimonas na 600 nanometrów. Normalizuj hodowlę do wartości absorpcji 1,0 poprzez rozcieńczenie w medium hodowlanym.Teraz wiruj jeden mililitr hodowli w dawce 9 300 g przez dwie minuty. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulat w jednym mililitrze PBS. Po odwirowaniu i ponownym usunięciu supernatantu ponownie zawiesij granulat bakteryjny w jednym mililitrze sterylnej podwójnie destylowanej wody.Użyj sterylizowanych nasion, a następnie rozcieńcz inokulum w stopniu 1 do 10 za pomocą 0,025% organosilikonowego surfaktantu w tej samej tubce. Potrząsaj zawieszeniem na niskiej prędkości przez 24 godziny przed kiełkowaniem nasion. Zacznij od napełnienia sterylnej komory wzrostu roślin wybraną glebą wstępnie zwilżoną wodą z kranu.Przykryj końcówkę Luer Lock folią aluminiową i poddaj urządzenie w autoklawie na cyklu cieczy przez 20 minut. Następnie, w warunkach sterylnych, podłącza się filtr 0,2 mikrometra do złącza Luer lock w komorze wzrostu. Otwórz komorę i dodaj do gleby 500 mikrolitrów filtra sterylnego w formie 1%20 na 20 na 20 do 20 do gleby.Wymieszaj ziemię sterylną łopatką, jednocześnie dodając sterylną wodę podwójnie destylowaną, aby utrzymać nawodnienie bez nadmiernego nasycenia gleby. Teraz użyj sterylnej żyletki, aby pokroić agar Murashige i Skoog z talerzy zawierających jedną słabą, starą siewkę na ćwiartki. Sterylną łopatką przenieś jeden kawałek agaru z sadzonką na przygotowaną glebę w komorze wzrostowej.Przenieś jednostkę komory wzrostu do inkubatora roślin ustawionego na 16-godzinny cykl światła i 8-godzinny ciemny przy 23 stopniach Celsjusza i 70% wilgotności. Całkowite skaryzowanie nasion Typha spowodowało widoczne oddzielenie komponentów nasion, podczas gdy niepełne skaryzowanie pozostawiło dziób przyczepiony, a nieskaryzowane nasiona pozostały nienaruszone. Wykazano, że sterylny system hydroponiczny wspiera wzrost gatunków pałki i Juncus, przedstawionych tutaj jako Juncus, które były utrzymywane w systemie jałowym do jednego roku.Najwyższy wskaźnik kiełkowania nasion wynoszący 20,8% zaobserwowano metodą 30% wybielania i polisorbatu 20, co było znacząco wyższe niż we wszystkich innych zabiegach sterylizacji z wyjątkiem godzinnej metody gazu chlorowego, która nie była w stanie zapewnić pełnej sterylizacji nasion. Siedem dni po skaryzacji kiełkujące siewki Typha rozwinęły widoczne rodniki i tkankę pędów w środowisku niesterylnej płyty Petriego. Po przesadzeniu do gleby, część siewek Typha z powodzeniem się ukorzeniła i w ciągu jednego do dwóch tygodni wytworzyła nową tkankę pędową.Po zaszczepieniu gatunkami Luteimonas noszącymi plazmid DsRed, zaobserwowano kolonizację czerwonych fluorescencyjnych bakterii w korzeniach siewek Typha 16 dni po inokulacji.

optimized-method-for-cultivation-microbial-bioaugmentation-typha

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Nowatorski projekt reaktora, nazwany bioreaktorem o wysokiej gęstości (HDBR), jest prezentowany do hodowli i badania społeczności drobnoustrojów o dużej gęstości. W tym przypadku HDBR jest z powodzeniem stosowany w konfiguracji fotobioreaktora (PBR) do badania metabolizmu azotu przez mieszaną społeczność glonów o dużej gęstości.

Nowatorski bioreaktor do hodowli o dużej gęstości różnych zbiorowisk mikroorganizmów

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Techniki wzbogacania mikroorganizmów na miejscu lub hodowli in situ mogą ułatwić izolację trudnych do hodowli taksonów mikroorganizmów, zwłaszcza z ekstremalnych środowisk o niskiej biomasie lub geochemicznie. W tym miejscu opisujemy układ elektrochemiczny bez użycia zewnętrznego źródła zasilania w celu wzbogacenia szczepów drobnoustrojów, które są zdolne do zewnątrzkomórkowego transportu elektronów (EET).

Wolnostojący zestaw elektrochemiczny do wzbogacania bakterii oddychających anodą na miejscu

Tutaj opisujemy hydroponiczny test wzrostu roślin, aby określić ilościowo obecność gatunków i zobrazować przestrzenne rozmieszczenie bakterii podczas początkowej kolonizacji korzeni roślin i po ich przeniesieniu do różnych środowisk wzrostu.

Monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym

Opisano protokół wykorzystania dwutlenku węgla z gazów spalinowych elektrowni na gaz ziemny do hodowli mikroalg w otwartych stawach torowych. Wtryskiwanie spalin jest kontrolowane za pomocą czujnika pH, a wzrost mikroalg jest monitorowany za pomocą pomiarów gęstości optycznej w czasie rzeczywistym.

Sprzężenie wychwytywania dwutlenku węgla z elektrowni z półautomatycznymi otwartymi stawami torowymi do uprawy mikroalg

Ten protokół opisuje, jak używać systemu mikrobiologicznej hodowli mikrokropel (MMC) do prowadzenia zautomatyzowanej hodowli mikrobiologicznej i adaptacyjnej ewolucji. MMC może hodować i podkulminować mikroorganizmy automatycznie i w sposób ciągły oraz monitorować online ich wzrost ze stosunkowo wysoką przepustowością i dobrą równoległością, zmniejszając zużycie pracy i odczynników.

Zautomatyzowana hodowla mikroorganizmów i ewolucja adaptacyjna z wykorzystaniem systemu hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)

Dostępny jest protokół o wysokiej przepustowości do powierzchniowej sterylizacji nasion Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optymalizujący etapy obsługi cieczy za pomocą prostego urządzenia ssącego zbudowanego z pompą próżniową. Setki próbek nasion można wysterylizować powierzchniowo w ciągu jednego dnia.

Wysokowydajna, wytrzymała i bardzo elastyczna w czasie metoda powierzchniowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Ten protokół opisuje wykorzystanie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) do integracji interesujących genów z genomem jądrowym zielonej mikroalgi Chlorella vulgaris, co prowadzi do produkcji stabilnych transformantów.

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

Przedstawiamy wydajny, zoptymalizowany protokół transformacji apłciowej obojburzliwej odmiany Brassicaceae, Rorippa aquatica, wywoływanej przez Agrobacterium, bez wymagających zasobów procedur hodowli tkanek sterylnych. Wykorzystanie markera transformacji wizualnej i pipeline'u regeneracji pędów skutecznie wygenerowało transformanty bliskie klonalne, co przyczyniło się do dalszych badań nad adaptacją roślin do środowiska podwodnego.

Efektywna transformacja agrobakterii oparta na regeneracji bezpłciowego gatunku z rodziny kapustnych, Rorippa aquatica

Ten protokół opisuje metodę krok po kroku adaptacji Euglena gracilis do substratów na bazie kasawi i następującą ocenę wzrostu, żywotności i produkcji biomasy w wielu produktach z kasawi w warunkach upraw...

Metoda adaptacji Euglena gracilis do podłoży na bazie kaszawy do heterotroficznego uprawy

Poznaj zoptymalizowaną metodę uprawy Typha latifolia z nasion i bioaugmentacji mikroorganizmów. Standardowe protokoły ułatwiają powtarzalne badania nad interakcjami roślin z mikrobami w ekosystemach bagiennych.

Zoptymalizowana metoda uprawy i bioaugmentacji mikroorganizmów Typha latifolia (pałki pałki)

Przeglądaj więcej filmów