Zoptymalizowana metoda uprawy i bioaugmentacji mikroorganizmów Typha latifolia (pałki pałki)

Nasza praca zajmuje się brakiem protokołów dotyczących uprawy pałki z nasion. Opracowaliśmy powtarzalne metody kiełkowania nasion, wczesnego wzrostu oraz bioaugmentacji mikroorganizmów, aby wspierać przyszłe badania nad mikroorganizmami roślinnymi. Niewiele badań hoduje pałkę z nasion lub śledzi ją do dojrzałości, a mimo to pałka jest powszechnie wykorzystywana w badaniach nad rekultywacją terenów podmokłych.

Większość badań nad pałką polega na zakupie kłączy do rozmnażania pałki w badaniach laboratoryjnych. Niewiele badań hoduje pałkę z nasion, pozostawiając brak ustandaryzowanych metod. Osiągnięcie spójnej kiełkowania i trwałej kolonizacji wprowadzonych mikroorganizmów było poważnym wyzwaniem.

Opracowaliśmy powtarzalne metody kiełkowania nasion i bioaugmentacji mikroorganizmów, pokazując, jak wczesne szczepienie wspiera długoterminową kolonizację. Na początek użyj nożyc ogrodowych, aby odciąć łodygę rośliny Typha latifolia około dwóch centymetrów od podstawy kwiatostanu. Zdejmij nasiona z kwiatostanu, przelej je do blendera laboratoryjnego, aż mieszarka będzie około 1/4 pełna, co odpowiada około 250 mililitrom niezagęszczonych nasion.

Teraz napełnij blender 500 mililitrami wody z kranu, zapewniając 10-centymetrową przestrzeń głowicy. Mieszaj mieszankę w średniej wolnej prędkości przez 20 sekund i natychmiast przelej lepką zawartość do zlewki o pojemności jednego litra. Przelej około 100 mililitrów mieszanki z nasionami z powrotem do blendera.

Następnie dodaj od 400 do 600 mililitrów świeżej wody z kranu i mieszaj na średniej prędkości przez 20 sekund. Wlej zawartość do świeżej, litrowej zlewki. Teraz napełnij zlewkę wodą z kranu do 800 mililitrów.

Po odstawieniu na 60 sekund zbierz unoszącą się osadę z góry, nie naruszając nasion osiadających na dnie. Powoli wylej resztę wody i przelej nasiona do zlewki o pojemności 100 mililitrów. Powtórz proces mieszania dla pozostałego osadu wodnego z nasien. Następnie umieść zlewkę z oddzielonymi nasionami na talerzu do mieszania.

Po mieszaniu zbierz pływające rośliny z powierzchni zlewki. Wlej nasiona do lejka Buchnera z papierem filtracyjnym przymocowanym do próżni i pozwól im wyschnąć przez noc. Przechowuj suszone nasiona w temperaturze 20 stopni Celsjusza w stożkowych tubkach polipropylenowych o pojemności 50 mililitrów.

Przygotuj półmocne płytki Murashige i Skoog z agarem fitohydratowym o 1% mocy. Przełóż około jednego miligrama suszonych nasion do stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj do rurki 10 mililitrów sterylnej podwójnie destylowanej wody.

Umieść tubę na orbitalnym wstrząsie z średnią prędkością na 10 minut. Następnie usuń wodę z rurki i dodaj pięć mililitrów roztworu 0,1% polisorbat 20 przygotowanego w sterylnej wodzie podwójnie destylowanej. Potrząsaj rurką na średniej prędkości przez 10 minut.

Usuń roztwór polisorbatu 20. Wszystkie kolejne kroki wykonuj przed okapem płomiennym lub laminarnym. Zamień roztwór na pięć mililitrów wybielacza komercyjnego 30% i roztworu polisorbanu 20 0,025% przygotowanego w sterylnej wodzie podwójnie destylowanej.

Zamień supernatant na sterylną wodę podwójnie destylowaną. Następnie potrząsaj rurką z dużą prędkością przez pięć minut. Po trzecim płukaniu obróć rurkę z niską prędkością przez 24 godziny, aby wywołać kiełkowanie.

Następnego dnia usuń nadmiar wody i upewnij się, że w tubce pozostaną trzy mililitry płynu. Teraz aseptycznie, przetnij końcówkę plastikowej pipety o pojemności 1000 mikrolitrów. Użyj przeciętej pipety, aby energicznie pipetować i zawiesić nasiona w końcówce.

Nałóż nasiona i płyn na pół silne płytki z agaru Murashige i Skoog. Delikatnie mieszaj talerzem, aby równomiernie rozłożyć nasiona. Owiń płytki folią uszczelniającą laboratoryjną, a następnie umieść je w komorze wzrostu z 16-godzinnym światłem i 8-godzinnym cyklem ciemności przy 23 stopniach Celsjusza i 70% wilgotności.

Aby zaszczepić nasiona pałki, sterylizuj nasiona polisorbatem 20 wybielacza i podwójnie destylowaną wodą, jak pokazano. Zmierz gęstość optyczną nocnej hodowli izolatu Luteimonas na 600 nanometrów. Normalizuj hodowlę do wartości absorpcji 1,0 poprzez rozcieńczenie w medium hodowlanym.

Teraz wiruj jeden mililitr hodowli w dawce 9 300 g przez dwie minuty. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulat w jednym mililitrze PBS. Po odwirowaniu i ponownym usunięciu supernatantu ponownie zawiesij granulat bakteryjny w jednym mililitrze sterylnej podwójnie destylowanej wody.

Użyj sterylizowanych nasion, a następnie rozcieńcz inokulum w stopniu 1 do 10 za pomocą 0,025% organosilikonowego surfaktantu w tej samej tubce. Potrząsaj zawieszeniem na niskiej prędkości przez 24 godziny przed kiełkowaniem nasion. Zacznij od napełnienia sterylnej komory wzrostu roślin wybraną glebą wstępnie zwilżoną wodą z kranu.

Przykryj końcówkę Luer Lock folią aluminiową i poddaj urządzenie w autoklawie na cyklu cieczy przez 20 minut. Następnie, w warunkach sterylnych, podłącza się filtr 0,2 mikrometra do złącza Luer lock w komorze wzrostu. Otwórz komorę i dodaj do gleby 500 mikrolitrów filtra sterylnego w formie 1%20 na 20 na 20 do 20 do gleby.

Wymieszaj ziemię sterylną łopatką, jednocześnie dodając sterylną wodę podwójnie destylowaną, aby utrzymać nawodnienie bez nadmiernego nasycenia gleby. Teraz użyj sterylnej żyletki, aby pokroić agar Murashige i Skoog z talerzy zawierających jedną słabą, starą siewkę na ćwiartki. Sterylną łopatką przenieś jeden kawałek agaru z sadzonką na przygotowaną glebę w komorze wzrostowej.

Przenieś jednostkę komory wzrostu do inkubatora roślin ustawionego na 16-godzinny cykl światła i 8-godzinny ciemny przy 23 stopniach Celsjusza i 70% wilgotności. Całkowite skaryzowanie nasion Typha spowodowało widoczne oddzielenie komponentów nasion, podczas gdy niepełne skaryzowanie pozostawiło dziób przyczepiony, a nieskaryzowane nasiona pozostały nienaruszone. Wykazano, że sterylny system hydroponiczny wspiera wzrost gatunków pałki i Juncus, przedstawionych tutaj jako Juncus, które były utrzymywane w systemie jałowym do jednego roku.

Najwyższy wskaźnik kiełkowania nasion wynoszący 20,8% zaobserwowano metodą 30% wybielania i polisorbatu 20, co było znacząco wyższe niż we wszystkich innych zabiegach sterylizacji z wyjątkiem godzinnej metody gazu chlorowego, która nie była w stanie zapewnić pełnej sterylizacji nasion. Siedem dni po skaryzacji kiełkujące siewki Typha rozwinęły widoczne rodniki i tkankę pędów w środowisku niesterylnej płyty Petriego. Po przesadzeniu do gleby, część siewek Typha z powodzeniem się ukorzeniła i w ciągu jednego do dwóch tygodni wytworzyła nową tkankę pędową.

Po zaszczepieniu gatunkami Luteimonas noszącymi plazmid DsRed, zaobserwowano kolonizację czerwonych fluorescencyjnych bakterii w korzeniach siewek Typha 16 dni po inokulacji.