Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych
9 sierpnia 2024
Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.
W niniejszej pracy przedstawiamy i porównujemy metody tworzenia sferoidów, które można wykorzystać do analizy metabolizmu komórkowego i dystrybucji tlenu za pomocą mikroskopii żywych komórek. W ostatnich latach mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji była szeroko stosowana do badania biomarkerów metabolicznych, takich jak NADPH i FAD w żywych komórkach, a kilka fluorescencyjnych nanocząstek zostało opracowanych w celu zwielokrotnienia takich pomiarów z obrazowaniem natlenienia komórek i tkanek. Wielokomórkowe sferoidy, organoidy i narządy na chipie mogą replikować złożone, podobne do in vivo mikrośrodowisko, minimalizując potrzebę badań na zwierzętach.
W przypadku produkcji sferoidów pokazujemy różne metody formowania, mogą wahać się od niskiej do wysokiej przepustowości. Podkreślają również ich dostępność optyczną, kompatybilność z mikroskopem obrazowania fluorescencyjnego czasu życia oraz możliwość włączenia elementów macierzy zewnątrzkomórkowej. Tak więc, mimo że modele 3D in vitro zapewniają lepszy kontekst w porównaniu z hodowlami 2D, ich wysoka zmienność, niska odtwarzalność i niekompletna sprawozdawczość eksperymentalna pozostają problemem.
Parametry takie jak rozmiar sferoidy, skład składników odżywczych, lepkość zewnątrzkomórkowa, a nawet metody tworzenia sferoid mogą prowadzić do zwiększonej heterogeniczności komórkowej. Dzięki temu protokołowi dążymy do harmonizacji i standaryzacji metod produkcji sferoidów, podkreślając kluczowe aspekty ważne dla ciągłej i wieloparametrycznej analizy sferoid przy użyciu mikroskopii FLIM.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia różne metody tworzenia wielokomórkowych sferydów w celu analizy metabolizmu komórek i dystrybucji tlenu przy użyciu mikroskopii żywych komórek. Badanie wskazuje na zastosowanie fluorescencyjnej mikroskopii z pomiarem czasu żywotności (FLIM) do badania biomarkerów metabolicznych w żywych komórkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Mikroskopia żywych komórek
Tło
- Wielokomórkowe sferydy i organoidalne replikują mikrośrodowiska przypominające in-vivo.
- Fluorescencyjna mikroskopia z pomiarem czasu żywotności jest wykorzystywana do badania biomarkerów metabolicznych.
- Duża zmienność i niska powtarzalność są wyzwaniami w 3D modelach in vitro.
- Różne metody tworzenia sferydów mogą być zastosowane w różnych zastosowaniach.
Cel badania
- Porównać metody tworzenia sferydów dla mikroskopii żywych komórek.
- Analizować metabolizm komórek, niedotlenienie i śmierć komórek w 3D modelach.
- Zlepszyć zrozumienie dystrybucji tlenu w wielokomórkowych systemach.
Zastosowanie metod
- Fluorescencyjna mikroskopia z pomiarem czasu żywotności (FLIM)
- Analiza autofluorescencji komórkowej
- Zastosowanie barwników do barwienia i fluorescencyjnych nanocząstek
- Różne techniki tworzenia sferydów
Główne wyniki
- Przedstawiono metody analizy metabolizmu komórek w 3D sferydach.
- Pokazano zgodność sferydów z FLIM do badań metabolicznych.
- Podkreślono znaczenie składników macierzy pozakomórkowej w tworzeniu sferydów.
- Zadresowano wyzwania dotyczące powtarzalności i zmienności 3D kultur.
Konkluzje
- Różne metody tworzenia sferydów mogą ulepszać analizę żywych komórek.
- FLIM zapewnia cenne informacje o procesach metabolicznych w 3D modelach.
- Kontynuacja rozwoju tych metod może zmniejszyć zależność od modeli zwierzęcych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized production and multi-parameter FLIM analysis of multicellular spheroids address critical challenges in modeling tumor microenvironments for drug discovery. Harmonizing spheroid formation and live-cell imaging workflows enhances predictive confidence in metabolic and hypoxia-related readouts, supporting robust early-stage decision-making. This approach strengthens translational continuity and reduces biological risk across oncology and stem cell R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and oxygen gradients in physiologically relevant 3D models.
- Supports functional target validation by quantifying NADPH and FAD biomarkers in live spheroids.
- Facilitates biological de-risking through multiplexed metabolic and hypoxia measurements.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in complex systems.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible 3D spheroid models compatible with widefield, confocal, and two-photon FLIM platforms.
- Standardizes assay conditions to reduce variability and enhance quantitative output reliability.
- Enables scalable, high-throughput screening of compound effects on cell metabolism and viability.
- Supports robust evaluation of bio- and nanosensor integration for multiplexed readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro metabolic and hypoxia profiles with disease-relevant tumor microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by minimizing animal model reliance.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, multiparametric data.
- Facilitates translational biomarker development using live-cell FLIM outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This harmonized workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, leveraging standardized spheroid production and FLIM analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D, in vivo-like contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative metabolic and hypoxia readouts for compound triage.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence lifetime measurements for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by recapitulating tumor microenvironment features.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse oncology and stem cell R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D model systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, live-cell microscopy, and FLIM analytics.
- Demands access to widefield, confocal, or two-photon FLIM instrumentation and compatible analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid production and imaging protocols.
- May require adaptation for different cell types, extracellular matrices, or sensor integration.
- Variability in spheroid size and composition can impact reproducibility and data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
