Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych
August 9th, 2024
Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.
W niniejszej pracy przedstawiamy i porównujemy metody tworzenia sferoidów, które można wykorzystać do analizy metabolizmu komórkowego i dystrybucji tlenu za pomocą mikroskopii żywych komórek. W ostatnich latach mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji była szeroko stosowana do badania biomarkerów metabolicznych, takich jak NADPH i FAD w żywych komórkach, a kilka fluorescencyjnych nanocząstek zostało opracowanych w celu zwielokrotnienia takich pomiarów z obrazowaniem natlenienia komórek i tkanek. Wielokomórkowe sferoidy, organoidy i narządy na chipie mogą replikować złożone, podobne do in vivo mikrośrodowisko, minimalizując potrzebę badań na zwierzętach.
W przypadku produkcji sferoidów pokazujemy różne metody formowania, mogą wahać się od niskiej do wysokiej przepustowości. Podkreślają również ich dostępność optyczną, kompatybilność z mikroskopem obrazowania fluorescencyjnego czasu życia oraz możliwość włączenia elementów macierzy zewnątrzkomórkowej. Tak więc, mimo że modele 3D in vitro zapewniają lepszy kontekst w porównaniu z hodowlami 2D, ich wysoka zmienność, niska odtwarzalność i niekompletna sprawozdawczość eksperymentalna pozostają problemem.
Parametry takie jak rozmiar sferoidy, skład składników odżywczych, lepkość zewnątrzkomórkowa, a nawet metody tworzenia sferoid mogą prowadzić do zwiększonej heterogeniczności komórkowej. Dzięki temu protokołowi dążymy do harmonizacji i standaryzacji metod produkcji sferoidów, podkreślając kluczowe aspekty ważne dla ciągłej i wieloparametrycznej analizy sferoid przy użyciu mikroskopii FLIM.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia różne metody tworzenia wielokomórkowych sferydów w celu analizy metabolizmu komórek i dystrybucji tlenu przy użyciu mikroskopii żywych komórek. Badanie wskazuje na zastosowanie fluorescencyjnej mikroskopii z pomiarem czasu żywotności (FLIM) do badania biomarkerów metabolicznych w żywych komórkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Mikroskopia żywych komórek
Tło
- Wielokomórkowe sferydy i organoidalne replikują mikrośrodowiska przypominające in-vivo.
- Fluorescencyjna mikroskopia z pomiarem czasu żywotności jest wykorzystywana do badania biomarkerów metabolicznych.
- Duża zmienność i niska powtarzalność są wyzwaniami w 3D modelach in vitro.
- Różne metody tworzenia sferydów mogą być zastosowane w różnych zastosowaniach.
Cel badania
- Porównać metody tworzenia sferydów dla mikroskopii żywych komórek.
- Analizować metabolizm komórek, niedotlenienie i śmierć komórek w 3D modelach.
- Zlepszyć zrozumienie dystrybucji tlenu w wielokomórkowych systemach.
Zastosowanie metod
- Fluorescencyjna mikroskopia z pomiarem czasu żywotności (FLIM)
- Analiza autofluorescencji komórkowej
- Zastosowanie barwników do barwienia i fluorescencyjnych nanocząstek
- Różne techniki tworzenia sferydów
Główne wyniki
- Przedstawiono metody analizy metabolizmu komórek w 3D sferydach.
- Pokazano zgodność sferydów z FLIM do badań metabolicznych.
- Podkreślono znaczenie składników macierzy pozakomórkowej w tworzeniu sferydów.
- Zadresowano wyzwania dotyczące powtarzalności i zmienności 3D kultur.
Konkluzje
- Różne metody tworzenia sferydów mogą ulepszać analizę żywych komórek.
- FLIM zapewnia cenne informacje o procesach metabolicznych w 3D modelach.
- Kontynuacja rozwoju tych metod może zmniejszyć zależność od modeli zwierzęcych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized production and multi-parameter FLIM analysis of multicellular spheroids address critical challenges in modeling tumor microenvironments for drug discovery. Harmonizing spheroid formation and live-cell imaging workflows enhances predictive confidence in metabolic and hypoxia-related readouts, supporting robust early-stage decision-making. This approach strengthens translational continuity and reduces biological risk across oncology and stem cell R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and oxygen gradients in physiologically relevant 3D models.
- Supports functional target validation by quantifying NADPH and FAD biomarkers in live spheroids.
- Facilitates biological de-risking through multiplexed metabolic and hypoxia measurements.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in complex systems.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible 3D spheroid models compatible with widefield, confocal, and two-photon FLIM platforms.
- Standardizes assay conditions to reduce variability and enhance quantitative output reliability.
- Enables scalable, high-throughput screening of compound effects on cell metabolism and viability.
- Supports robust evaluation of bio- and nanosensor integration for multiplexed readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro metabolic and hypoxia profiles with disease-relevant tumor microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by minimizing animal model reliance.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, multiparametric data.
- Facilitates translational biomarker development using live-cell FLIM outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This harmonized workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, leveraging standardized spheroid production and FLIM analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D, in vivo-like contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative metabolic and hypoxia readouts for compound triage.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence lifetime measurements for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by recapitulating tumor microenvironment features.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse oncology and stem cell R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D model systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, live-cell microscopy, and FLIM analytics.
- Demands access to widefield, confocal, or two-photon FLIM instrumentation and compatible analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid production and imaging protocols.
- May require adaptation for different cell types, extracellular matrices, or sensor integration.
- Variability in spheroid size and composition can impact reproducibility and data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
