Name: Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metody produkcji sferoid wielokomórkowych do analizy metabolizmu komórek i rozkładu tlenu przy użyciu mikroskopii FLIM. Technika ta umożliwia badanie biomarkerów metabolicznych w żywych komórkach 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Specjalnego Funduszu Badawczego (BOF) Uniwersytetu w Gandawie (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Fundacja Badawcza Flandria (FWO, I001922N) oraz Unia Europejska, fliMAGIN3D-DN Horyzont Europa-MSCA-DN nr 101073507.

Multicellular Spheroid Formation for FLIM-Based Metabolic and Hypoxia Analysis

Nic do ujawnienia.

Sferoidy wielokomórkowe stają się metodą z wyboru w badaniach mikrośrodowisk niszowych nowotworów i komórek macierzystych, odkrywaniu leków i opracowywaniu "cegiełek budulcowych" tkanek do biofabrykacji. Niejednorodna architektura wewnętrzna, gradienty składników odżywczych i natlenienia sferoidów mogą naśladować te w tkankach i guzach in vivo w stosunkowo uproszczonych i dostępnych warunkach. Oczekuje się, że ze względu na potrzebę większej przejrzystości metodologicznej26,28 i standaryzacji71, protokoły te pomogą naukowcom wybrać najlepszą metodę tworzenia sferoidów do eksperymentów z ilościowym obrazowaniem czasu życia fluorescencji na żywo. Przedstawione metody wykorzystują czujniki nanocząstek do barwienia komórek i wewnętrzną autofluorescencję komórkową, które można łatwo połączyć z barwieniem śmierci komórki.
Najbardziej krytyczne etapy to protokół tworzenia sferoid; Tak więc, w przypadku wysokoprzepustowej metody opartej na agarozie, konieczne jest wystarczające zrównoważenie form agarozowych dla pożywek hodowlanych. Niewystarczający czas równowagi doprowadzi do rozcieńczenia składników odżywczych w pozostałym PBS i przyniesie dodatkowe czynniki dla niejednorodności sferoidalnej 21,26,72,73. Świeżo wykonana pleśń agarozowa musi być również wizualnie sprawdzona pod kątem obecności pęcherzyków powietrza, mikropęknięć i innych wad.
Chociaż zawiesina nanocząstek jest skuteczna w obrazowaniu, może wykazywać samoagregację i powodować powstawanie sferoid o nieregularnych kształtach w metodach tworzenia o niskim przyłączeniu. Często można to złagodzić poprzez dodanie surowicy do pożywki hodowlanej lub przez wstępne barwienie jednowarstwowej kultury komórkowej przed utworzeniem sferoidów. Często podczas kompaktyzacji sferoidowej dodanie niewielkiej ilości nanocząstek (np. 10% początkowego stężenia barwienia) może również pomóc w barwieniu strefy proliferacji sferoid. Wreszcie, ważne jest, aby używać "bezpyłowych" sterylnych końcówek do pipet we wszystkich metodach formowania.
Podczas eksperymentów obrazowych należy zawsze brać pod uwagę potencjalny wpływ oświetlenia na żywotność komórek. Dlatego ważne jest, aby znać czynniki ryzyka negatywnie wpływające na każdy eksperyment obrazowania na żywo. Ogólnie rzecz biorąc, fotouszkodzenia obejmują kilka mechanizmów: (1) wysoki lokalny wzrost temperatury, (2) naprężenia mechaniczne oraz (3) stres fotochemiczny (reakcja oksydacyjna i wolnorodnikowa)74. W zależności od metody obrazowania (np. obrazowanie konfokalne jednofotonowe vs. wielofotonowe, tryby oświetlenia ciągłego vs. impulsowego, czułość detektorów i moc źródła światła przy różnych długościach fal, jeśli możliwe jest dostrojenie wzbudzenia), typu komórki i tkanki (np. zależna od typu tkanki akumulacja pigmentów skutecznie pochłaniających światło lub innych cząsteczek autofluorescencyjnych, organizacja 3D vs. 2D, wzrost i skład pożywki do obrazowania), pochodzenie sondy fluorescencyjnej (np. właściwości fotouczulające) różne kombinacje czynników ryzyka mogą powodować fototoksyczność podczas obrazowania. Ponadto, nawet jeśli nie obserwuje się wzrostu śmierci komórki po oświetleniu, zależne od mocy światła wcześniejsze efekty przedśmiertne na mitochondria i metabolizm mogą potencjalnie zakłócać analizęi interpretację eksperymentu.
Aby wykluczyć wpływ fototoksyczności na wyniki eksperymentalne, badacz powinien przeprowadzić ogólne monitorowanie żywotności komórek i zmian w morfologii komórek w porównaniu z nienaruszoną kontrolą lub użyć sond śmierci komórki w celu oszacowania wzrostu śmiertelności komórek po oświetleniu. Jeżeli eksperymenty metaboliczne są wykonywane, optymalizacja parametrów obrazowania powinna być dokonana odpowiednio w eksperymentach pilotażowych w celu oszacowania i zminimalizowania wpływu obrazowania na mierzone parametry metaboliczne. W przypadku sond wrażliwych na tlen przedawkowanie światła można łatwo prześledzić poprzez nagły wzrost trwałości i intensywności fosforescencji barwnika O2 wrażliwego na działanie (odpowiednie zmiany współczynnika intensywności odniesienia do barwnika wrażliwego naO2) spowodowany tak zwanym efektem "fotoindukowanego zużyciaO2"53,75. Można to łatwo osiągnąć poprzez analizę krzywej kinetycznej eksperymentów poklatkowych z różnymi parametrami mocy światła, wykorzystując na przykład następujący opublikowany protokół25. W "obronie" iluminacji impulsowej (np. wykorzystywanej w mikroskopii TCSPC-F(P)LIM), ostatnie badania wykazały jej minimalny wpływ na produkcję ROS i fotowybielanie sondy w porównaniu z pomiarami oświetlenia w stanie ustalonym76,77, wskazując na dodatkową przewagę TCSPC-FLIM w porównaniu z konwencjonalnym podejściem do obrazowania opartym na intensywności.
Głównym ograniczeniem prezentowanych metod powstawania sferoid są zastosowania w monitorowaniu bezpośrednim i długoterminowym. Formy agarozowe wymagają obiektywu o dużej odległości roboczej (lub dodatkowego mikroskopu pionowego lub stereomikroskopu fluorescencyjnego) ze względu na grubą warstwę agarozy, a materiał płytki sferycznej 5D może zakłócać pomiary w kanałach czerwonej fluorescencji (sondaO2 ). Rozmiar sferoidy wytwarzany metodami wysokoprzepustowymi jest ograniczony średnicą mikrodołka i wymaga częstej wymiany pożywki, aby uniknąć wyczerpania i zakwaszenia pożywki. Biorąc pod uwagę wszystkie te ograniczenia, zalecamy szalki Petriego 3D (MicroTissue) do eksperymentów wymagających wysokiej przepustowości (np. do zastosowań biodruku 3D) i metod o niskiej przyczepności do "średnioprzepustowych" badań podstawowych, wymagających również mniejszej liczby komórek.
Ratiometryczne monitorowanie natlenienia i konwencjonalne eksperymenty mikroskopowe oparte na barwniku fluorescencji żywych komórek są przystępne cenowo na powszechnie dostępnych mikroskopach odwróconych, jeśli są wyposażone w kamerę czułą na bliską podczerwień (NIR), wzbudzenie oparte na diodach elektroluminescencyjnych (LED) i odpowiedni obiektyw25. W celu uzyskania bardziej odpowiedniego przekroju optycznego i FLIM zaleca się dostępne od ręki komercyjne systemy mikroskopów konfokalnych (takie jak opisane tutaj). Chociaż opisujemy również metodę wykrywania autofluorescencji NAD(P)H, wymagającą bardziej kosztownego dwufotonowego mikroskopu FLIM, istnieje wiele różnych podejść, kompatybilnych i przydatnych dla konfokalnych systemów FLIM, idealnie wyposażonych w laser światła białego i detektory hybrydowe lub. Obejmują one ocenę metabolizmu komórkowego, białka biosensora FRET-FLIM, obrazowanie mechaniki komórek i tkanek, autofluorescencję określonych typów komórek i tkanek oraz interakcje receptor-lek wizualizowane za pomocą FLIM-FRET31.
Dostarczone przez dostawcę oprogramowanie do akwizycji i analizy FLIM może mieć wpływ na powodzenie eksperymentu, ponieważ nie zawsze jest możliwe wyeksportowanie IRF lub obrazów w formacie zgodnym z późniejszą analizą typu open source. Przetwarzanie końcowe jest ważną częścią przepływu pracy analizy FLIM i nadal nie jest powszechnie ustandaryzowane ani akceptowane. Dopasowanie krzywej wymaga większej liczby fotonów i większej mocy obliczeniowej w porównaniu z podejściem fazorowym. FLIMfit45 (dopasowanie globalne i piksel po pikselu) i Flimview78 należą do otwartego oprogramowania używanego do analizy dopasowania krzywych, podczas gdy PAM79, FLUTE64 i AlliGator80 są używane do analizy wskazówkowej. FLIMJ46 to przydatna wtyczka ImageJ, która działa z obydwoma podejściami. Ogólnie rzecz biorąc, te opcje pomagają ulepszyć procedurę przetwarzania końcowego i sprawiają, że jest ona szybsza, bardziej wszechstronna i przyjazna dla użytkownika.

Sferoidy wielokomórkowe reprezentują grupę trójwymiarowych modeli tkanek uzyskanych w wyniku samoagregacji komórek i wykazujących kulisty kształt. Są one szeroko stosowane do naśladowania interakcji komórka-komórka i komórka-macierz in vitro oraz do odtwarzania kontekstu 3D w wielu konstruktach pochodzących z raka i komórek macierzystych. Stosuje się kilka technik w celu zmniejszenia przyczepiania się komórek i promowania agregacji. Należą do nich metoda wiszącego spadku oparta na napięciu powierzchniowym1; metody odpychania przyczepiania komórek, takie jak ultra-niskie płytki mocujące, mikroformy i mikrostudzienki2,3; podejście oparte na falach akustycznych<klasa sup="xref">4; metody agregacji indukowanej przepływem (kolby wirujące, bioreaktory i urządzenia mikroprzepływowe)<klasa sup="xref">5; tworzenie wspomagane cząstkami magnetycznymi6 oraz wykorzystanie syntetycznych i opartych na ECM matryc i rusztowań promujących agregację7,8,9.</klasa></klasa>
W badaniach, rozwoju i walidacji nowych terapii lekowych, sferoidy są atrakcyjnym modelem ze względu na ich zdolność do rekapitulacji ograniczonych dyfuzją przestrzenną gradientów składników odżywczych, produktów przemiany materii i O2, co często prowadzi do powstania martwiczego rdzenia, typowego dla guzów litych10,11. Te bardziej wiarygodne i wyrafinowane modele in vitro stanowią wyzwanie dla potrzeby szerokiego wykorzystania modeli zwierzęcych (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), zgodnie z zasadą 3R w badaniach na zwierzętach (zastępowanie, redukcja i udoskonalanie). Oprócz raka, sferoidy znajdują swoje zastosowanie w badaniach nad komórkami macierzystymi. Na przykład pluripotencjalne komórki macierzyste mają zdolność do tworzenia ciał zarodkowych (EB), które można wykorzystać do różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w kierunku wyspecjalizowanych typów komórek, które są trudne do uzyskania bezpośrednio od pacjentów, takich jak neuronalne komórki prekursorowe13 lub komórki ziarniste jajnika13,14. Co więcej, utworzenie EB jest często pierwszym krokiem w rozwoju bardziej złożonych modeli organoidowych, np. neural15, retinal16, cardiac17, liver18, stomach19 i organoidy jelitowe20. Przy wyborze odpowiedniej metody tworzenia sferoid do eksperymentów należy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak rozmiar, odtwarzalność, przepustowość i dalsze zastosowania.
Zwiększona złożoność hodowli 3D może prowadzić do większej zmienności w porównaniu do kultury 2D. Czynniki takie jak skład składników odżywczych21, parowanie pożywki22, lepkość23, kontrola pH24, metoda tworzenia sferoidów, a nawet czas w kulturze25,26 mogą prowadzić do uzyskania sferoid o różnej morfologii, rozmiarach, żywotności i różnej odporności na chemoodporność27,28. Ostatnie badania wykazały, że sferoidalne gradienty tlenu nie zawsze są statyczne i mają na nie wpływ metoda tworzenia, rozmiar sferoidy i lepkość zewnątrzkomórkowa, wpływając na niejednorodność sferoidów29. Aby poprawić odtwarzalność i dostępność danych na temat sferoidów, opracowano bazę wiedzy MISpheroID26, identyfikując linię komórkową, pożywkę hodowlaną, metodę tworzenia i rozmiar sferoid jako minimalne informacje dla powtarzalnego wyniku. W związku z tym przeprowadzono szczegółowe porównanie wielu metod o wysokiej przepustowości (SphericalPlate 5D, mikroformy wyprodukowane w laboratorium i formy do mikrotkanek) i nisko osadzonych (tj. 96-dołkowe płytki Biofloat i Lipidure, zarówno bez rusztowań, jak i na rusztowaniach) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 i Tabela 1), w tym rozmiar studni (biorąc pod uwagę oszacowanie maksymalnego rozmiaru sferoidy), użyte materiały eksploatacyjne, czas przygotowania i możliwość monitorowania sferoid bez transportu je do naczyń mikroskopowych. To ostatnie umożliwia długoterminowe badania, podczas gdy sferoidy wytworzone metodami wysokoprzepustowymi często skutkują eksperymentami końcowymi. Wszystkie metody, z wyjątkiem siatek płytki 5DspheriPlate, nie powodują niepożądanej autofluorescencji, co umożliwia ich bezpośrednie zastosowanie w mikroskopii.</silna>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> 
Rysunek 1: Wyjaśnienie metod tworzenia sferoidów. Metody o wysokiej przepustowości, takie jak SphericalPlate 5D, która zintegrowała opatentowane mikrodołki w płytce, podczas gdy produkowane w laboratorium mikroformy i formy MicroTissue wykorzystują stemple do wytwarzania wielu mikrostudzienek w agarozie (niebieskiej). Płytki o niskim przyleganiu, takie jak Lipidure (Amsbio) i Biofloat (Sarstedt), wykorzystują nieprzylegającą powłokę, która hamuje przyleganie do powierzchni komórki i sprzyja samoagregacji komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Płyta sferyczna 5D</td>
			<td>Mikroformy własnej produkcji</td>
			<td>Mikrotkanka</td>
			<td>Niskie metody mocowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba sferoid/studzienkę </td>
			<td>750</td> szt.
			<td>Rok 1589</td>
			<td>Rozdział 81</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnica studni</td>
			<td>90 μm</td>
			<td>400 μm</td>
			<td>800 μm</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość kultury</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inne materiały eksploatacyjne</td>
			<td>/</td>
			<td>7 ml 3% agarozy</td>
			<td>500 μL 2% agarozy</td>
			<td>/ *</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas przygotowania</td>
			<td>Czas trwania: 10 min</td>
			<td>2 h + 3 dni adaptacji mediów</td>
			<td>0,5 h + 15 min adaptacja mediów</td>
			<td>10–30 min + 1 h suszenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitoring</td>
			<td>tak</td>
			<td>Nie**</td>
			<td>tak</td>
			<td>tak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescencyjny</td>
			<td>tak</td>
			<td>Nie</td>
			<td>Nie</td>
			<td>Nie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wielokrotnego użytku</td>
			<td>Nie</td>
			<td>tak</td>
			<td>tak</td>
			<td>Nie**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Koszt</td>
			<td rowspan="2">€€ </td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: Powłoka i Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>€€: Komercyjna płytka 96-dołkowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*Niektóre linie komórkowe wymagają dodania ECM (np. 2%–5% Matrigel), aby utworzyć zwarte sferoidy. </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">**Powłoka nadaje się do ponownego użycia aż do wyczerpania. Jednak każda płyta będzie zużywać niewielką ilość nośnika, a z czasem może gromadzić się kurz. Regularnie potrzebna jest sterylizacja filtra. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
&gt;Tabela 1: Porównanie wielu metod tworzenia sferoidów29. "Monitorowanie": możliwość monitorowania sferoidy bez konieczności przenoszenia do naczynia mikroskopowego. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€€: 150-500€ , €€€€: &gt;500€
Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia bezpośrednie monitorowanie kluczowych aspektów biologicznych sferoid, w tym śmierci komórki, żywotności, proliferacji, metabolizmu, lepkości, a nawet właściwości mechanicznych30. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) zapewnia dodatkowy wymiar ilościowy do badania interakcji sond fluorescencyjnych w ich (mikro)środowisku31,32,33,34, umożliwiając rozdzielczość nakładających się widm emisji według różnych okresów eksploatacji emisji35,36 oraz sondowanie metabolizmu komórkowego w oparciu o wewnętrzną autofluorescencję komórkową. Tak więc tak szeroko rozpowszechnione komórkowe związki autofluorescencyjne, jak fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD(P)H), mononukleotyd flawinowy (FMN), dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), protoporfiryna IX i inne mogą być mierzone za pomocą jedno- i dwufotonowego FLIM i służyć jako wewnętrzne "czujniki" katabolizmu glukozy, fosforylacji oksydacyjnej (OxPhos) i zapewniają ogólny przegląd stanu redoks komórki. NAD(P)H występuje w wolnych formach cytoplazmatycznych lub mitochondrialnych związanych z białkami37,38. Podobnie, stopień utlenienia FAD jest fluorescencyjny z dłuższą żywotnością wolnej postaci. Mikroskopie NAD(P)H i FAD zwykle obejmują wzbudzony dwufotonowy FLIM, mający na celu zapobieganie fotouszkodzeniom próbki39. Często "optyczne obrazowanie metaboliczne" FLIM można połączyć z użyciem sond barwnikowych, genetycznie kodowanych bioczujników, mikroskopii obrazowania czasu życia fosforescencji (PLIM) i pomiarów opartych na intensywności ratiometrycznej w celu zapewnienia pełniejszego obrazu metabolizmu sferoidów lub organoidów, natlenienia, proliferacji i żywotności komórek29,30,31. Ponadto FLIM można również połączyć z metodą rezonansowego transferu energii Förstera (FRET) w celu pomiaru zmienności fluoroforu dawcy w czasie życia w bliskim kontakcie z akceptorem w celu zbadania wiązania leku z jego domeną docelową33,40,41.
Pozyskane obrazy FLIM są zazwyczaj analizowane w celu obliczenia czasu życia piksel po pikselu. Obecnie istnieją co najmniej 3 popularne strategie stosowane w celu uzyskania czasu życia fluorescencji: półilościowe "szybkie FLIM"42 (czasami określane jako "tau sense"43,44), dopasowanie krzywej zaniku, przy użyciu jedno-, dwu- lub trzywykładniczego dopasowania oraz podejście "bez dopasowania" z transformacją wskazową i analizą wykresu wskazowego. W zależności od dostawcy, do obsługi zmierzonych danych FLIM można użyć dostarczonego oprogramowania (LAS X, Symphotime, SPCImage itp.) lub oprogramowania typu open source (np. FLIMfit45, FLIMJ46 lub inne47). Zazwyczaj oprogramowanie dostarczane przez dostawcę jest przydatne do wstępnej analizy danych, podczas gdy rozwiązania typu open source mogą zapewnić dokładniejsze badania za pomocą np. wykresów wskazowych i wizualizacji 3D.
Pomimo użyteczności i atrakcyjności FLIM jako metody badania sferoid, dostępnych jest bardzo niewiele protokołów eksperymentalnych, a także ogólny brak wiedzy na temat wyboru najodpowiedniejszej metody formowania dla udanych eksperymentów z użyciem mikroskopii wieloparametrycznej na żywo z udziałem FLIM. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe porównanie powszechnie stosowanych protokołów tworzenia sferoidów w oparciu o ich morfologię, żywotność i natlenienie za pomocą niedawno zwalidowanego i scharakteryzowanego nanoczujnika tlenu dalekiej czerwieni i bliskiej podczerwieni (NIR) (MMIR1). Nanocząstka kationowa jest impregnowana dwoma barwnikami reporterowymi, referencyjnym O 2-niewrażliwym aza-BODIPY (wzbudzenie 650 nm, emisja 675 nm) i NIR O2 czuła metaloporfiryna, PtTPTBPF (wzbudzenie 620 nm, emisja 760 nm). MMIR1 umożliwia analizę gradientów tlenu w czasie rzeczywistym na konwencjonalnym mikroskopie fluorescencyjnym (przy użyciu analizy ratiometrycznej) lub mikroskopie czasu życia fosforescencji (PLIM) bez wprowadzania toksyczności komórkowej i pozwalając na stabilne sygnały, długoterminowe monitorowanie i multipleksowanie25,29. W zależności od potrzeby barwienia barwnikami lub nanoczujnikami, przepustowości sferoidy lub typu ogniwa, można wybrać najbardziej odpowiedni protokół tworzenia. Ponieważ badania żywotności i natlenienia sferoid są istotne dla badań nad rakiem i sferoidami pochodzącymi z komórek macierzystych, przedstawione protokoły zawierają również przykłady i oczekiwane typowe wyniki NAD(P)H-FLIM i FAD-FLIM z tymi modelami. Prezentowane potoki obrazowania i analizy są ukierunkowane na najpopularniejsze platformy mikroskopii FLIM oparte na zliczaniu pojedynczych fotonów skorelowane w czasie.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Dostępne również w</td></tr><tr><td>pipetach serologicznych Sigma 10 ml</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, sterylne</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning i innych firmach.</td></tr><tr><td>12-dołkowy szkiełko komorowe, wyjmowane</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Dostępne również w Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific i innych</td></tr><tr><td>probówkach wirówkowych 15 ml</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>Mikroformy 3D na szalce Petriego</td><td>Mikrotkanka</td><td>Z764000-6EA</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, sterylne</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>ChemLab</td><td>CL02.0537.5000</td><td></td></tr><tr><td>Biofloat</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.400</td><td>Dostępna na rynku powlekana 96-dołkowa płytka do tworzenia sferoidów</td></tr><tr><td>Calcein Green-AM</td><td>Tebubio</td><td>AS-89201</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CellSens Dimension</td><td>Olympus</td><td>version 3</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen z ludzkiego łożyska, typ IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Do przygotowania 0,07 mg/ml kolagenu i 0,03 mg/ml naczyń mikroskopowych pokrytych poli-D-lizyną</td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop FLIM</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td>Mikroskop odwrócony Stellaris 8 Falcon z laserem światła białego, detektory HyD X, klimat / komora kontrolna T (OkoLab), obiektyw 25x/0,95 W</td></tr><tr><td>D(+)-glukoza</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>Przygotuj 1 M roztwór podstawowy, 1:100 do przygotowania pożywki obrazowej (stężenie końcowe 10 mM)</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Eagle's (DMEM), bez czerwieni fenolowej, glukozy, pirogronianu i glutaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>Do przygotowania pożywki</td></tr> obrazowej <tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;( FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>Dostępny również w Sigma. Przed użyciem należy go dezaktywować termicznie.</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 10 mM)</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki raka jelita grubego HCT116</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>wersja 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>wersja 4.6.1.27508</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Dostępny również w firmie Sigma. Stosować w rozcieńczeniu 1:100.</td></tr><tr><td>Lipidure-CM5206</td><td>Amsbio</td><td>AMS.52000034GB1G</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A, wymaga dodania 1 mM pirogronianu sodu i 10 mM HEPES</td><td>VWR</td><td>392-0420</td><td>Standardowa pożywka wzrostowa dla komórek HCT116</td></tr><tr><td>Mikrowzorzyste stemple PDMS drukowane w 3D</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Dostarczone przez Centrum Technologii Mikrosystemów, prof. dr Jan Vanfleteren, Uniwersytet w Gandawie</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemlab</td><td>CL00.1429.100</td><td></td></tr><tr><td>Komora do płukania Neubauer</td><td>Sondy O2 Fisher Scientific</td><td>15980396</td><td></td></tr>: <tr><td>MMIR1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pełną charakterystykę, walidację i niektóre aplikacje można znaleźć pod adresem: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher scientific</td><td>Gibco18912014</td><td>Rozpuść tabletkę PBS w 500 ml wody destylowanej.</td></tr><tr><td>Pióro Strep :P enicylina (10 000 U/ml) / streptomycyna (10 000 &mu; g/mL) 100x roztwór</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Dostępny również w firmie Sigma. Stosować w rozcieńczeniu 1:100.</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>Do przygotowania 0,07 mg/ml kolagenu i 0,03 mg/ml naczyń mikroskopowych pokrytych poli-D-lizyną</td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25535-16-4</td><td>Barwienie śmierci komórkowej użyj 1 &mikro; g / ml w 1h inkubacji</td></tr><tr><td>filtr strzykawkowy PVDF 0,22 i mikro; m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 1mM)</td></tr><tr><td>SphericalPlate 5D 24-well</td><td>Kugelmeiers</td><td>SP5D-24W</td><td></td></tr><tr><td>sterylny petridish</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych (25 cm&sup2; )</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych (75 cm&sup2;)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka w kształcie litery U VWR</td><td></td><td>10062-900</td><td>Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one i innych firmach</td></tr><tr><td>Ultrapure Agarose</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>Inne rodzaje agarozy, takie jak agaroza o niskiej temperaturze topnienia (A-9414, Sigma), agaroza do rutynowego użytku (A-9539, Sigma)</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny szerokokątny</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny IX81, z silnikowym sterowaniem osią Z, CoolLED pE4000 (16 kanałów, 365-770 nm), kamera cMOS ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu), szklana płyta grzewcza Okolab, oprogramowanie CellSens Dimension v.3 i obiektywy pneumatyczne 4x/0,13 UPlanFLN i 40x/0,6 LUCPlanFLN. (Opcjonalnie, do obrazowania w wysokiej rozdzielczości) 60x/1,0 LUMPLFLN woda</td></tr></tbody></table>

produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (flim) sferoid wielokomórkowych

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe są popularnym modelem mikroagregatów 3D do odtwarzania mikrośrodowiska guza, testowania i optymalizacji terapii lekowych oraz używania bio- i nanosensorów w kontekście 3D. Ich łatwość produkcji, przewidywalna wielkość, wzrost oraz obserwowane gradienty składników odżywczych i metabolitów są ważne dla podsumowania mikrośrodowiska komórek niszowych 3D. Jednak niejednorodność sferoidów i zmienność ich metod produkcji mogą wpływać na ogólny metabolizm komórek, żywotność i odpowiedź na leki. Utrudnia to wybór najodpowiedniejszej metodologii, biorąc pod uwagę wymagania dotyczące wielkości, zmienności, potrzeb biofabrykacji i wykorzystania jako modele tkanek 3D in vitro w biologii komórek macierzystych i nowotworowych. W szczególności produkcja sferoidów może wpływać na ich kompatybilność z ilościowymi mikroskopami żywymi, takimi jak optyczne obrazowanie metaboliczne, mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), monitorowanie niedotlenienia sferoidalnego za pomocą nanoczujników lub żywotność. W tym miejscu przedstawiono szereg konwencjonalnych protokołów tworzenia sferoid, podkreślając ich kompatybilność z żywymi mikroskopami szerokokątnymi, konfokalnymi i dwufotonowymi. Przedstawiono również proces obrazowania uzupełniającego do analizy z multipleksowaną autofluorescencją FLIM oraz z wykorzystaniem różnych typów sferoidów nowotworowych i komórek macierzystych.

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

W niniejszej pracy przedstawiamy i porównujemy metody tworzenia sferoidów, które można wykorzystać do analizy metabolizmu komórkowego i dystrybucji tlenu za pomocą mikroskopii żywych komórek. W ostatnich latach mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji była szeroko stosowana do badania biomarkerów metabolicznych, takich jak NADPH i FAD w żywych komórkach, a kilka fluorescencyjnych nanocząstek zostało opracowanych w celu zwielokrotnienia takich pomiarów z obrazowaniem natlenienia komórek i tkanek. Wielokomórkowe sferoidy, organoidy i narządy na chipie mogą replikować złożone, podobne do in vivo mikrośrodowisko, minimalizując potrzebę badań na zwierzętach.W przypadku produkcji sferoidów pokazujemy różne metody formowania, mogą wahać się od niskiej do wysokiej przepustowości. Podkreślają również ich dostępność optyczną, kompatybilność z mikroskopem obrazowania fluorescencyjnego czasu życia oraz możliwość włączenia elementów macierzy zewnątrzkomórkowej. Tak więc, mimo że modele 3D in vitro zapewniają lepszy kontekst w porównaniu z hodowlami 2D, ich wysoka zmienność, niska odtwarzalność i niekompletna sprawozdawczość eksperymentalna pozostają problemem.Parametry takie jak rozmiar sferoidy, skład składników odżywczych, lepkość zewnątrzkomórkowa, a nawet metody tworzenia sferoid mogą prowadzić do zwiększonej heterogeniczności komórkowej. Dzięki temu protokołowi dążymy do harmonizacji i standaryzacji metod produkcji sferoidów, podkreślając kluczowe aspekty ważne dla ciągłej i wieloparametrycznej analizy sferoid przy użyciu mikroskopii FLIM.

production-multi-parameter-live-cell-fluorescence-lifetime-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) stało się kluczową techniką obrazowania środowiska i oddziaływań specyficznych białek oraz barwników w żywych komórkach. FLIM fluorescencyjnych rotorów molekularnych umożliwia mapowanie lepkości w żywych komórkach.

Obrazowanie czasu życia fluorescencji rotorów molekularnych w żywych komórkach

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Przedstawiona metoda polega na jednoosiowym rozciąganiu miękkich hydrożeli 3D osadzonych w gumie silikonowej, umożliwiając jednocześnie mikroskopię konfokalną na żywo. Przedstawiono charakterystykę zewnętrznych i wewnętrznych szczepów hydrożelu, a także wyrównanie włókien. Opracowane urządzenie i protokół mogą oceniać reakcję komórek na różne reżimy szczepów.

Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo

Poznaj metody produkcji sferoid wielokomórkowych do analizy metabolizmu komórek i rozkładu tlenu przy użyciu mikroskopii FLIM. Technika ta umożliwia badanie biomarkerów metabolicznych w żywych komórkach 3D.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Przeglądaj więcej filmów