Name: Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj zastosowanie plazmonicznych pęset do monitorowania dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia badanie zmian konformacyjnych bez konieczności stosowania fluoroforów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.Z. dziękuje za wsparcie ze strony Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC DTP) (BB/T0083690/1). Autorzy potwierdzają finansowanie z Brytyjsko-Indyjskiej Inicjatywy Edukacyjnej i Badawczej (UKIERI). M.R. docenia wsparcie ze strony Towarzystwa Królewskiego i Fundacji Wolfsona.

<ol><li>Peter Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+single-molecule+enzymatic+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Sizing up single-molecule enzymatic conformational dynamics.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1118-1143 (2014).</li>
<li>Mazal, H., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+methods+to+study+the+dynamics+of+proteins+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET methods to study the dynamics of proteins at work.</a> Curr Opin Biomed Eng. 12, 8-17 (2019).</li>
<li>Ritchie, D. B., Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the structural dynamics of proteins and nucleic acids with optical tweezers.</a> Curr Opin Str Biol. 34, 43-51 (2015).</li>
<li>Neupane, K., Solanki, A., Sosova, I., Belov, M., Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+metastable+structures+formed+by+small+oligomers+of+%CE%B1-Synuclein+probed+by+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diverse metastable structures formed by small oligomers of α-Synuclein probed by force spectroscopy.</a> PLoS One. 9 (1), e86495(2014).</li>
<li>Hughes, M. L., Dougan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+pulling+polyproteins%3A+a+review+of+single+molecule+force+spectroscopy+using+the+AFM+to+study+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">The physics of pulling polyproteins: a review of single molecule force spectroscopy using the AFM to study protein unfolding.</a> Rep Prog Phys. 79 (7), 076601-076601 (2016).</li>
<li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li>
<li>Schmid, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopores%3A+a+versatile+tool+to+study+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanopores: a versatile tool to study protein dynamics.</a> Essays Biochem. 65 (1), 93-107 (2021).</li>
<li>Van Meervelt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+conformational+changes+and+controlled+orientation+of+native+proteins+inside+a+protein+nanoreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-time conformational changes and controlled orientation of native proteins inside a protein nanoreactor.</a> J Am Chem Soc. 139 (51), 18640-18646 (2017).</li>
<li>Awasthi, S., Ying, C., Li, J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+the+size+and+shape+of+single+%CE%B1-Synuclein+oligomers+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of the size and shape of single α-Synuclein oligomers in solution.</a> ACS Nano. 17 (13), 12325-12335 (2023).</li>
<li>Sµnchez-Rico, C., Von Vithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluorophore+attachment+on+protein+conformation+and+dynamics+studied+by+spFRET+and+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of fluorophore attachment on protein conformation and dynamics studied by spFRET and NMR spectroscopy.</a> Chemistry. 23 (57), 14267-14277 (2017).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+fluorescent+labeling+affect+the+binding+kinetics+of+proteins+with+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectr%22%5BJournal%5D)">How does fluorescent labeling affect the binding kinetics of proteins with intact cells.</a> Biosens Bioelectr. 66, 412-416 (2015).</li>
<li>Berkovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+limit+of+protein+elastic+response+is+tether+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Rate limit of protein elastic response is tether dependent.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (36), 14416-14421 (2012).</li>
<li>Dahmardeh, M., Mirzaalian Dastjerdi, H., Mazal, H., Köstler, H., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-supervised+machine+learning+pushes+the+sensitivity+limit+in+label-free+detection+of+single+proteins+below+10+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Self-supervised machine learning pushes the sensitivity limit in label-free detection of single proteins below 10 kDa.</a> Nat Meth. 20 (3), 442-447 (2023).</li>
<li>Becker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+description+for+optical+mass+measurement+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photon%22%5BJournal%5D)">A quantitative description for optical mass measurement of single biomolecules.</a> ACS Photon. 10 (8), 2699-2710 (2023).</li>
<li>Houghtaling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+shape%2C+volume%2C+and+dipole+moment+of+individual+proteins+freely+transiting+a+synthetic+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Estimation of shape, volume, and dipole moment of individual proteins freely transiting a synthetic nanopore.</a> ACS Nano. 13 (5), 5231-5242 (2019).</li>
<li>Plesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+translocation+of+proteins+through+solid+state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast translocation of proteins through solid state nanopores.</a> Nano Lett. 13 (2), 658-663 (2013).</li>
<li>Schmid, S., Stömmer, P., Dietz, H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+electro-osmotic+trap+for+the+label-free+study+of+single+proteins+and+their+conformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanopore electro-osmotic trap for the label-free study of single proteins and their conformations.</a> Nat Nanotechnol. 16 (11), 1244-1250 (2021).</li>
<li>Shi, X., Verschueren, D. V., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+delivery+of+single+DNA+molecules+into+a+plasmonic+nanopore+for+label-free+optical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Active delivery of single DNA molecules into a plasmonic nanopore for label-free optical sensing.</a> Nano Lett. 18 (12), 8003-8010 (2018).</li>
<li>Verschueren, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+optical+detection+of+DNA+translocations+through+plasmonic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free optical detection of DNA translocations through plasmonic nanopores.</a> ACS Nano. 13 (1), 61-70 (2019).</li>
<li>Verschueren, D., Shi, X., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-optical+tweezing+of+single+proteins+in+plasmonic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Meth%22%5BJournal%5D)">Nano-optical tweezing of single proteins in plasmonic nanopores.</a> Small Meth. 3 (5), 1800465(2019).</li>
<li>Peri, S. S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+low+affinity+binding+interactions+between+natural+killer+cell+inhibitory+receptors+and+targeting+ligands+with+a+self-induced+back-action+actuated+nanopore+electrophoresis+%28SANE%29+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of low affinity binding interactions between natural killer cell inhibitory receptors and targeting ligands with a self-induced back-action actuated nanopore electrophoresis (SANE) sensor.</a> Nanotechnology. 32 (4), 045501(2020).</li>
<li>Leong, I. W., Tsutsui, M., Yokota, K., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+gradient+control+of+translocation+dynamics+in+a+solid-state+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Salt gradient control of translocation dynamics in a solid-state nanopore.</a> Anal Chem. 93 (49), 16700-16708 (2021).</li>
<li>Juan, M. L., Righini, M., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+nano-optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photon%22%5BJournal%5D)">Plasmon nano-optical tweezers.</a> Nat Photon. 5 (6), 349-356 (2011).</li>
<li>Juan, M. L., Gordon, R., Pang, Y., Eftekhari, F., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-induced+back-action+optical+trapping+of+dielectric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">Self-induced back-action optical trapping of dielectric nanoparticles.</a> Nat Phys. 5 (12), 915-919 (2009).</li>
<li>Pang, Y., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+of+12+nm+dielectric+spheres+using+double-nanoholes+in+a+gold+film%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical trapping of 12 nm dielectric spheres using double-nanoholes in a gold film.</a> Nano Lett. 11 (9), 3763-3767 (2011).</li>
<li>Pang, Y., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+of+a+single+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical trapping of a single protein.</a> Nano Lett. 12 (1), 402-406 (2012).</li>
<li>Kotnala, A., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+high-efficiency+trapping+of+nanoparticles+in+a+double+nanohole+optical+tweezer%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantification of high-efficiency trapping of nanoparticles in a double nanohole optical tweezer.</a> Nano Lett. 14 (2), 853-856 (2014).</li>
<li>Booth, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+dynamic+polarizability+of+macromolecules+for+single-molecule+optical+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Modelling of the dynamic polarizability of macromolecules for single-molecule optical biosensing.</a> Sci Rep. 12 (1), 1995(2022).</li>
<li>Yousefi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+monitoring+of+in+situ+Iron+loading+into+single%2C+native+ferritin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical monitoring of in situ Iron loading into single, native ferritin proteins.</a> Nano Lett. 23 (8), 3251-3258 (2023).</li>
<li>Yousefi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Flexibility+and+Disassembly+Kinetics+of+Single+Ferritin+Molecules+Using+Optical+Nanotweezers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural Flexibility and Disassembly Kinetics of Single Ferritin Molecules Using Optical Nanotweezers.</a> ACS Nano. 18 (24), 15617-15626 (2024).</li>
<li>Peters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscape+of+conformational+changes+for+a+single+unmodified+protein%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biosens%22%5BJournal%5D)">Energy landscape of conformational changes for a single unmodified protein.</a> NPJ Biosens. 1 (1), 14-14 (2024).</li>
<li>Peters, M., McIntosh, D., Branzan Albu, A., Ying, C., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+tracking+of+proteins+through+plasmon-enhanced+interference%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanosci+Au%22%5BJournal%5D)">Label-free tracking of proteins through plasmon-enhanced interference.</a> ACS Nanosci Au. 4 (1), 69-75 (2024).</li>
<li>Ying, C., et al. Watching single unmodified enzymes at work. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYing%2C+C+%22arXiv%22">arXiv</a>. , (2021).</li>
<li>Yang-Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+small+molecule+activator+binding+to+single+PR65+protein%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biosensing%22%5BJournal%5D)">Direct observation of small molecule activator binding to single PR65 protein.</a> NPJ Biosensing. 2 (1), 1-10 (2025).</li>
<li>Yang, W., van Dijk, M., Primavera, C., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIB-milled+plasmonic+nanoapertures+allow+for+long+trapping+times+of+individual+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">FIB-milled plasmonic nanoapertures allow for long trapping times of individual proteins.</a> iScience. 24 (11), 103237(2021).</li>
<li>Koya, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+plasmonic+nanocavities+for+optical+trapping-assisted+biosensing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Optical+Mater%22%5BJournal%5D)">Novel plasmonic nanocavities for optical trapping-assisted biosensing applications.</a> Adv Optical Mater. 8 (7), 1901481(2020).</li>
<li>Goswami, A., Umashankar, R., Gupta, A. K., Aravindan, S., Rao, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microstructured+surface+using+the+FIB%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromanufact%22%5BJournal%5D)">Development of a microstructured surface using the FIB.</a> J Micromanufact. 1 (1), 53-61 (2018).</li>
<li>Onuta, T. D., Waegele, M., DuFort, C. C., Schaich, W. L., Dragnea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+field+enhancement+at+cusps+between+adjacent+nanoapertures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical field enhancement at cusps between adjacent nanoapertures.</a> Nano Lett. 7 (3), 557-564 (2007).</li>
<li>Al-Ani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+PEG-thiol+derivatives+on+controlling+cellular+and+bacterial+interactions+with+gold+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Surf+Sci%22%5BJournal%5D)">The influence of PEG-thiol derivatives on controlling cellular and bacterial interactions with gold surfaces.</a> Appl Surf Sci. 462, 980-990 (2018).</li>
<li>Schuler, B., Hofmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+spectroscopy+of+protein+folding+dynamics-expanding+scope+and+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule spectroscopy of protein folding dynamics-expanding scope and timescales.</a> Curr Opin Str Biol. 23 (1), 36-47 (2013).</li>
<li>Kopac, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+corona%2C+understanding+the+nanoparticle-protein+interactions+and+future+perspectives%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Protein corona, understanding the nanoparticle-protein interactions and future perspectives: A critical review.</a> Int J Biol Macromol. 169, 290-301 (2021).</li>
<li>Li, X., Guo, W., Xu, R., Song, Z., Ni, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+mechanism+between+gold+nanoparticles+and+proteins%3A+Lysozyme%2C+trypsin%2C+pepsin%2C+%CE%B3-globulin%2C+and+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochim+Acta+A+Mol+Biomol+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">The interaction mechanism between gold nanoparticles and proteins: Lysozyme, trypsin, pepsin, γ-globulin, and hemoglobin.</a> Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 272, 120983(2022).</li>
<li>Emilsson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongly+stretched+protein+resistant+poly%28ethylene+glycol%29+brushes+prepared+by+grafting-To%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Inter%22%5BJournal%5D)">Strongly stretched protein resistant poly(ethylene glycol) brushes prepared by grafting-To.</a> ACS Appl Mater Inter. 7 (14), 7505-7515 (2015).</li>
<li>Theil, E. C., Liu, X. S., Tosha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gated+pores+in+the+ferritin+protein+nanocage%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Gated pores in the ferritin protein nanocage.</a> Inorg Chim Acta. 361 (4), 868-874 (2008).</li>
<li>Theil, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferritin+iron+entry+and+exit+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The ferritin iron entry and exit problem.</a> Inorg Chim Acta. 297 (1), 242-251 (2000).</li>
<li>Takahashi, T., Kuyucak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+threefold+and+fourfold+channels+in+Ferritin+D%3Ddeduced+from+electrostatic+calculations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Functional properties of threefold and fourfold channels in Ferritin D=deduced from electrostatic calculations.</a> Biophys J. 84 (4), 2256-2263 (2003).</li>
<li>Gemeinhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+single+proteins+secreted+from+living+cells+via+iSCAT+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iSCAT microscopy.</a> J Vis Exp. (141), e58486(2018).</li>
<li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nat Comm. 5 (1), 4495(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowym krokiem w protokole jest upewnienie się, że komora przepływowa nie przecieka przed umieszczeniem jej w scenie, która powinna być wcześniej przetestowana na zewnątrz uchwytu przy wysokim natężeniu przepływu. Wyciek po zamontowaniu próbki może uszkodzić elementy optyczne, w szczególności dolną soczewkę. 
Wyrównanie może z czasem dryfować od optymalnej pozycji podczas eksperymentu, powodując zmienność sygnału ze względu na czułość plazmonicznej pęsety. W takim przypadku należy ponownie wyrównać za pomocą kontrolek piezoelektrycznych do maksymalnej transmisji i minimalnego odchylenia standardowego linii bazowej, ponieważ hałaśliwa linia bazowa obniża jakość danych. Należy zwrócić uwagę na skrupulatne notowanie czasu wyrównywania, aby wyeliminować ryzyko mylenia ingerencji użytkownika w zdarzenie pułapkowania. Jeśli wystąpi poważne dryfowanie, delikatnie wyrównaj stolik, aby zminimalizować ryzyko uwolnienia białka i zanotuj czas regulacji.
Modyfikacje i zmiany w prezentowanej technice mogą być dokonywane w oparciu o konkretne potrzeby eksperymentalne. Na przykład stolik z kontrolowaną temperaturą może pomóc schłodzić/podgrzać próbkę zgodnie z życzeniem, zamiast używać ogrzewania laserowego w celu zwiększenia temperatury31,33. Inne techniki, na przykład interferometryczna mikroskopia rozpraszania (iSCAT), mogą zapewnić interferencję białka w polu rozpraszania DNH, uzyskując dodatkowy sygnał proporcjonalny do polaryzowalności białka, co jest związane z wielkością cząstek47,48.
Plazmoniczne pęsety są czysto czasową techniką wykrywania, ponieważ dane są rejestrowane przez APD (detektor jednopikselowy). Technika ta nie dostarcza bezpośrednich informacji na temat zmian strukturalnych białka, takich jak to, które regiony białka są zaangażowane w zmianę konformacyjną lub gdzie ligand lub inne białko może wiązać się z białkiem. Dodatkowo technika ta jest ograniczona do zakresu czasowego >1 μs ze względu na częstotliwość próbkowania karty akwizycji danych (1 MHz). Biorąc pod uwagę częstotliwość Nyquista, gdzie najwyższy możliwy zakres to połowa szybkości akwizycji, w tym przypadku 2 μs w idealnych warunkach.
W tym protokole opisaliśmy proces konfiguracji eksperymentu z plazmoniczną pęsetą w celu uwięzienia pojedynczego białka i monitorowania zmian w jego dynamice konformacyjnej w czasie. Technikę tę można opracować na dowolnym mikroskopie zbudowanym w domu lub komercyjnym. W przeciwieństwie do metod opartych na fluorescencji lub tetheringu, takich jak smFRET i pęseta optyczna, technika ta może wychwytywać białka bez etykiet lub uwięzi i nadal osiągać czułość pojedynczej cząsteczki. Warunki roztworu mogą być zmieniane podczas wychwytywania białka za pomocą systemu mikroprzepływowego, co pozwala na monitorowanie w czasie rzeczywistym wpływu różnych roztworów na białko. Cechy te sprawiają, że plazmoniczne pęsety są obiecującym narzędziem w dziedzinie biofizyki i biodetekcji, szczególnie w przypadku białek, które konwencjonalne techniki mają trudności z zbadaniem w ich rodzimych stanach. Przyszłe zastosowania będą koncentrować się na dekodowaniu dynamiki konformacyjnej bardziej dynamicznych białek, takich jak białka wewnętrznie nieuporządkowane i białka zawierające wewnętrznie nieuporządkowane regiony oraz białka błonowe, których dynamika i równomierna struktura wymykają się obecnym technikom.

Obecne techniki jednocząsteczkowe do badania dynamiki konformacji białek obejmują metody oparte na znakowaniu, takie jak transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET)1,2, podejścia oparte na tetheringu, takie jak pęseta optyczna3,4i mikroskopia sił atomowych (AFM)5, techniki oparte na interferencjach, takie jak mikroskopia rozpraszania interferencyjnego (iSCAT)6, lub techniki oparte na nanofluidyce, takie jak nanopores7,8,9. Chociaż te metody mają wiele zalet; Kilka kluczowych ograniczeń uniemożliwia im dostarczenie danych na temat dynamiki konformacji niezmodyfikowanych białek. FRET i pęsety optyczne wymagają znakowania fluoroforem lub przywiązania do powierzchni, co może wpływać na właściwości biofizyczne białek10,11,12. iSCAT, choć technicznie nie wymaga znakowania, wymaga również interakcji między białkiem a powierzchnią, aby zaobserwować zakłócenia generowane między nimi, które potencjalnie wpływają na właściwości białek. Ponadto, ograniczony stosunkiem sygnału do szumu, iSCAT może wykrywać tylko białka >40 kDa z powodu szumów sprzętu i fluktuacji tła przypominających plamki13. Chociaż ten limit rozmiaru można złagodzić za pomocą uczenia maszynowego, komponenty bufora są ograniczone, ponieważ mogą wpływać na właściwości optyczne, powodując zaszumienie danych13,14. Nanopory charakteryzują się krótkimi czasami translokacji białek przez pory (zwykle w granicach 5 μs), co sprawia, że nie są w stanie wykryć wolniejszej dynamiki konformacji15,16, chociaż badania nad złagodzeniem tych ograniczeń, takie jak użycie origami DNA w pułapce elektroosmotycznej nanoporowej17 lub włączenie plazmoniki18,19,20,21. Dodatkowo, wysokie stężenia soli, zwykle około 1 M, mogą zmniejszyć przydatność danych do pracy in vivo15,22. Idealna technika jednocząsteczkowa do charakterystyki białek powinna monitorować białka w czasie rzeczywistym i rejestrować dynamikę konformacyjną przez dłuższy czas (tj. milisekundy) bez konieczności modyfikacji warunków białka lub nienatywnego roztworu.
Plazmoniczne pęsety są podobne do konwencjonalnych pincet optycznych, w tym sensie, że wykorzystują światło do zatrzymywania materii. Plazmoniczne pęsety wykorzystują jednak zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmoniczny (LSPR) do wzmocnienia pola elektrycznego o kilka rzędów wielkości, aby wygenerować siłę gradientu wystarczająco silną, aby uwięzić pojedyncze nanocząstki23. Dodatkowo, uwięziona cząstka odgrywa aktywną rolę w zwiększaniu wytrzymałości pułapki, znanej jako samoindukowane pułapkowanie wsteczne (SIBA) dla struktur nanoaperturowych24. To pułapkowanie SIBA pozwala na wychwytywanie małych cząstek o niskiej mocy (tj. miliwatów) o średnicy zaledwie kilku nanometrów, takich jak białka25,26,27. Uwięzienie pojedynczych cząsteczek białka w obszarze hotspotu powoduje zmianę lokalnego współczynnika załamania światła (białko n >n woda), zmieniając rozpraszanie światła w oparciu o polaryzowalność cząsteczki, na którą wpływa objętość białka, anizotropia kształtu i indeks załamania światła28. Następnie fotodioda lawinowa (APD) wykrywa te informacje, aby monitorować kolejne zmiany w rozpraszaniu światła. Co więcej, plazmoniczne pęsety umożliwiają monitorowanie uwięzionych białek w czasie rzeczywistym bez znakowania, uwięzi i trudnych warunków roztworu przez długi czas (tj. od minut do godzin)29, spełniając kryteria idealnej techniki pojedynczej cząsteczki dla białek. Wykorzystując strukturę podwójnej nanodziury (DNH), plazmoniczne nanotpęsety wykazały swoją zdolność do wychwytywania różnych białek i wyjaśniania z nich kluczowych informacji, w tym przejść konformacyjnych29, kinetyka demontażu30, krajobrazy energetyczne31, śledzenie dyfuzji32 oraz wiązanie ligandów33,34. Oprócz struktur DNH, wykazano, że alternatywne geometrie struktur zatrzymują cząstki o małych rozmiarach35,36. W niniejszym protokole przedstawiono podstawowe kroki konfiguracji i uruchomienia plazmonicznej pęsety ze zintegrowanym systemem mikroprzepływowym. Mamy nadzieję, że ten protokół przyczyni się do zwiększenia dostępności i zrozumienia plazmonicznej pęsety dla badaczy, szczególnie tych zajmujących się biologią strukturalną i biofizyką.

<table><tbody><tr><td>100x Obiektyw (NA = 1,25)</td><td>Olympus</td><td>PLN100XO</td><td>Czysty olej tylko za pomocą chusteczki do czyszczenia soczewek jednym ruchem</td></tr><tr><td>12-1 obrotowy dwukierunkowy zawór mikroprzepływowy</td><td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/2-drogowy zawór elektromagnetyczny</td><td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Obiektyw (NA = 0,1)</td><td>Olympus</td><td>PLN4XP</td><td></td></tr><tr><td>Wiatrówka</td><td>RS Komponenty</td><td>666-6772</td><td></td></tr><tr><td>Fotodioda lawinowa (APD)</td><td>Thorlabs</td><td>APD120A/M</td><td>Nie przesycić, szerokość pasma 50 MHz, czułość na ładunki elektrostatyczne</td></tr><tr><td>Dioda laserowa</td><td>Butterfly Thorlabs</td><td>FPL852S</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie sprzężone z ładunkiem (kamera)</td><td>Hikrobot</td><td>MV-CE200-10UC</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie krystalizujące</td><td>VWR</td><td>216-0065</td><td></td></tr><tr><td>Karta akwizycji danych&nbsp;</td><td>Instrumenty krajowe</td><td>USB-6361</td><td>Częstotliwość próbkowania 2 MHz</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Adhesive Research Inc</td><td>ARcare92712</td><td>Wytnij odpowiedni kształt dla komórki przepływowej za pomocą wycinarki laserowej</td></tr><tr><td>Tylko okap</td>na<td>etanol</td><td></td><td></td>, używaj rękawic</tr><tr><td>Kolimator Fibreport</td><td>Thorlabs</td><td>PAF2-A7B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do mikroskopu szklanego (grubość 0,17 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka półfalowa</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP10M-980</td><td></td></tr><tr><td>Ideal-tek 120 mm, stal nierdzewna, pęseta prosta</td><td>RS Components</td><td>282-7472</td><td>Do trzymania próbki i odklejania taśmy dwustronnej</td></tr><tr><td>Isopropanol (IPA)</td><td></td><td></td> <td>Tylko okap wyciągowy, używaj rękawiczek</td></tr><tr><td>Chusteczka do czyszczenia soczewek</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>Metrosil szybko powielające się części silikonowe A i B</td><td>Metrodent</td><td>MSILR/1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe (75 mm x 26 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modułowy system pęset optycznych</td><td>Thorlabs</td><td>OTKB/M-CUSTOM</td><td></td></tr><tr><td>Olej do obiektywów</td><td>Olympus</td><td></td><td>Używaj rękawiczek, przechowuj między 2oC-8oC</td></tr><tr><td>Montaż lasera fotodiodowego</td><td>Thorlabs</td><td>CLD1015</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik piezoelektryczny</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td>MDT693B</tr><tr><td>Stolik piezoelektryczny</td><td>Thorlabs</td><td>Nanomax 300</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka planowklęsła (f = -50 mm)</td><td>Soczewka płaskowypukła Thorlabs</td><td>LC1715-B</td><td></td></tr><tr><td>(f = 150 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-B</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka płaskowypukła (f = 60 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>LA1134-B</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy) metylowy tiol (PEG-tiol) 800 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>729108</td><td>Przechowywać między 2oC-8oC</td></tr><tr><td>rurka PTFE (ID: 0,18 mm)</td><td>Vici Jour</td><td>JR-T-6805-M25</td><td></td></tr><tr><td>Rurka PTFE (ID: 0,8 mm)</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-21942-72</td><td></td></tr><tr><td>SEM-FIB</td><td>Belka poprzeczna Zeiss</td><td>550</td><td>Źródło jonów galu</td></tr><tr><td>Krótki przepust lustro dichroiczne 805 nm</td><td>Thorlabs</td><td>DMSP805</td><td></td></tr><tr><td>Srebrne lustro</td><td>Thorlabs</td><td>PF-10-03-P01</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>Weller Erem 120 mm pęseta płaska, zaokrąglona ze stali nierdzewnej</td><td>RS Components</td><td>176-1150</td><td>Do przytrzymywania szkła nakrywkowego i peelingu kleju z komory przepływowej</td></tr></tbody></table>

monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety

Monitoring Conformational Dynamics of Single Unmodified Proteins using Plasmonic Nanotweezers

Obecne techniki jednocząsteczkowe do charakteryzowania białek zazwyczaj wymagają etykiet, uwięzi lub użycia nienatywnych warunków roztworu. Takie zmiany mogą zmienić biofizykę białek i zmniejszyć użyteczność pozyskanych danych. Plazmoniczne pęsety to technika wykorzystująca zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonowy (LSPR) na nanostrukturach złota w celu wzmocnienia pola elektrycznego w ograniczonym obszarze hotspotu. To ulepszenie pola pozwala na wykorzystanie niskich mocy lasera do wychwytywania pojedynczych nanocząstek znacznie mniejszych niż konwencjonalne pęsety optyczne, o średnicy zaledwie kilku nanometrów, takich jak pojedyncze białka. Uwięzienie pojedynczych cząsteczek białka w obszarze hotspotu indukuje zmianę lokalnego współczynnika załamania światła (białko n >n woda), zmieniając rozpraszanie światła jako produkt polaryzacji cząsteczki, na którą wpływa jej objętość, anizotropia kształtu i współczynnik załamania światła. Fotodioda lawinowa (APD) zbiera kolejne zmiany w rozpraszaniu światła. Zmiany te można następnie przeanalizować w celu określenia zmian w uwięzionej cząsteczce, w tym jej wielkości, globalnej konformacji i dynamiki zmian konformacyjnych w czasie. Włączenie mikrofluidyki do systemu pozwala na kontrolowane zmiany środowiskowe i monitorowanie w czasie rzeczywistym ich późniejszego wpływu na cząsteczkę. W tym protokole demonstrujemy kroki wychwytywania pojedynczych cząsteczek białka, zmiany warunków środowiskowych ich roztworu i monitorowania odpowiadających im zmian konformacyjnych za pomocą systemu plazmonicznej pęsety.

Po akwizycji danych można przeprowadzić analizę danych surowych przy użyciu kodu MATLAB w celu wygenerowania przebiegów z danych surowych zebranych przez APD. Rysunek 3 przedstawia przykładowy przebieg pułapkowania, obejmujący linię bazową przed pułapkowaniem oraz zdarzenie pułapkowania, w którym obserwuje się dużą zmianę transmitancji (ΔT/T0) i odchylenie standardowe przed wyłączeniem lasera na około 5 s i jego ponownym włączeniem. Znaczna redukcja odchylenia standardowego i powrót transmitancji do poziomów zbliżonych do linii bazowej wskazują na uwolnienie białka. Dryf liniowy jest usuwany z przebiegu za pomocą funkcji MATLAB detrend.m, a następnie do przebiegu po usunięciu trendu dodawana jest średnia wartość danych. Okazyjnie konieczne jest usuwanie trendu z przebiegu, ponieważ układ dryfuje w czasie, co powoduje liniowy spadek transmitancji (patrz szary przebieg na Rysunku 3). Niewielkie zmiany w przebiegach linii bazowej przed i po pułapkowaniu wynikają z regulacji stolika w celu optymalizacji linii bazowej przy minimalnym odchyleniu standardowym, co przedstawiono na Rysunku 4A. Czasami w przebiegu widoczne są cząsteczki białek bez ich pułapkowania, co określa się mianem białek przelatujących. Białka przelatujące objawiają się jako gwałtowna zmiana transmitancji, podobna do typowego pułapkowania (Rysunek 4B), ale o znacznie krótszym czasie trwania, jak pokazano na Rysunku 4A. Gęstość widmowa mocy (PSD) stanowi kolejną metodę analizy potwierdzającą pułapkowanie białka poprzez określenie mocy sygnału przy różnych częstotliwościach. Ruchy konformacyjne białek są zazwyczaj widoczne w zakresie &gt;1 µs w metodach spektroskopii pojedynczych cząsteczek40. Rysunek 4C pokazuje, że w porównaniu z linią bazową, pułapkowanie białka prowadzi do wyższej mocy sygnału, przynajmniej w zakresie 10 kHz (&gt; 100 µs). Podkreśla to również znaczenie wyrównania stolika do zoptymalizowanej linii bazowej, ponieważ niewłaściwa linia bazowa mogłaby zwiększyć szum przy częstotliwościach między 50-500 Hz, czyli w zakresie częstotliwości pokrywającym się z ruchami konformacyjnymi białek.
<img alt="Wykres napięcia APD pokazujący uwalnianie białka z filtrowaniem sygnału i usuwaniem trendu przy wielu częstotliwościach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Pełny zapis przechwytywania pojedynczego białka. Reprezentatywny zapis dla pełnego cyklu pułapkowania, obejmujący linię bazową, przechwycenie białka oraz jego uwolnienie. Skoki w zapisie przed i po przechwyceniu wynikają z wyrównania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces detekcji białek za pomocą czujnika nanoporowego; wykresy sygnału napięcia i wykres analizy częstotliwości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Typowe zdarzenia w zapisach sygnału. (A) Przykłady wyrównania od złej do dobrej linii bazowej oraz białka przechodzącego w pobliżu punktu gorącego (hotspot). (B) Zapis uwięzienia obrazujący proces od linii bazowej, gdy punkt gorący DNH jest pusty, do momentu uwięzienia białka. (C) Wykres gęstości widmowej mocy (PSD) dla dobrej i złej linii bazowej przedstawionych w (A) oraz białka uwięzionego w (B). Wyższe wartości PSD wskazują na większy szum przy określonych częstotliwościach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Większość zdarzeń przechwytywania przebiega według tego samego ogólnego schematu, co sygnał przedstawiony na Ryc. 3, choć podczas eksperymentów mogą wystąpić sporadyczne problemy. W większości doświadczeń białko powinno zostać uwolnione ręcznie poprzez wyłączenie lasera po zakończeniu pożądanego etapu eksperymentu. W niektórych przypadkach białko może jednak opuścić pułapkę bez interwencji, co pokazano na Ryc. 5A. Odwrotnie, czasami białka mogą pozostać w miejscu przechwytywania nawet po wyłączeniu lasera, co prawdopodobnie wynika z przylegania białka do próbki. Przyleganie to skutkuje szumami w sygnale po ponownym włączeniu i wyłączeniu lasera (patrz Ryc. 5B). Prawdopodobieństwo wystąpienia tego zjawiska zależy od białka, ponieważ niektóre z nich są bardziej podatne na adsorpcję powierzchniową41,42. Zastosowanie powłoki, takiej jak PEG-tiol, może zmniejszyć ryzyko przylegania białek39,43. Jeśli nie jest to celowe, np. w przypadku badania oddziaływań białko-białko, kolejnym problemem może być podwójne przechwytywanie, w którym drugie białko zostaje uwięzione po pierwszym. Charakteryzuje się to kolejnym gwałtownym wzrostem transmisji, podobnym do pierwszego przechwycenia, oraz zmianą odchylenia standardowego (patrz Ryc. 5C). 
<img alt="Wykres napięcie-czas eksperymentu wychwytywania białek; przefiltrowane sygnały wskazują dynamikę białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Przykłady niepożądanych zdarzeń wychwytywania. (A) Niezamierzone uwolnienie białka z punktu zapalnego (hotspot) DNH. (B) Przykład białka, które utknęło na powierzchni próbki w punkcie zapalnym DNH. (C) Skok śladu występuje, gdy drugie białko zostaje wychwycone, podczas gdy pierwsze nadal pozostaje w punkcie zapalnym DNH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Reprezentatywny eksperyment przeprowadzony na in situ ładowanie żelaza do cząsteczki apo-ferrytyny demonstruje zastosowanie plazmonicznych nanopincet jako narzędzia do badania dynamiki konformacyjnej białek29Ferrytyna jest białkiem transportującym żelazo, które występuje w dwóch stanach: apoferrytynie, która nie zawiera żelaza, oraz holoferrytynie, która jest nasycona żelazem.44,45Żelazo dwuwartościowe dostaje się do białka poprzez kanały trójskładnikowe, gdzie zostaje utlenione do żelaza trójwartościowego i zmagazynowane w rdzeniu białka.46. Rysunek 6A przedstawia typowy ślad wychwytywania apoferrytyny z roztworem żelaza(II) infundowanym przez ponad 20 min podczas wychwytywania białka. Ślady o czasie trwania 20 s, pobrane wzdłuż całego przebiegu w punktach b-e, dają wgląd w zmiany zachodzące w białku w czasie. W Rysunek 6Bapoferrytyna jest uwięziona w standardowym buforze PBS i nie obserwuje się żadnych istotnych zmian w sygnale. Rysunek 6C, D wykazują fluktuacje odchylenia standardowego (S.D.) śladów, które są spowodowane ładowaniem żelaza do białka poprzez jego kanały trzykrotne, co prowadzi do powstania stanu bardziej dynamicznego (apo-), w którym kanały są otwarte, oraz stanu bardziej zwartego (holo-) z zamkniętymi kanałami. Po wypełnieniu cząsteczki ferrytyny żelazem przeszła ona w holoformę, co skutkowało stabilnym śladem uwięzienia, jak pokazano w Rycina 6EFunkcje gęstości prawdopodobieństwa (PDF) w Ryciny 6B-E dodatkowo obrazują zmiany zachodzące w białku pod wpływem różnych warunków roztworu w czasie.
<img alt="Wykres napięcia w funkcji czasu przedstawiający proces ładowania żelazem; dane eksperymentalne przefiltrowane przy 100 Hz, 1 kHz PDF." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: In situ ładowanie żelazem uwięzionej apoferrytyny. (A) Pełny ślad transmisji DNH z uwięzioną cząsteczką apoferrytyny, po czym wstrzyknięto roztwór żelaza dwuwartościowego do miejsca uwięzienia, aby zaobserwować zmiany konformacyjne ferrytyny związane z ładowaniem żelaza. (B) 20-sekundowy ślad uwięzienia apoferrytyny przed dotarciem roztworu żelaza dwuwartościowego do punktu krytycznego. (C, D) 20-sekundowe ślady uwięzienia po wystawieniu cząsteczki apoferrytyny na działanie roztworu żelaza dwuwartościowego. Segmenty niebieskie i fioletowe oznaczają odpowiednio wyższe i niższe S.D. śladu, wskazując na elastyczne i sztywne konformacje ferrytyny. (E) 20-sekundowy ślad uwięzienia po wystawieniu apoferrytyny na działanie roztworu żelaza dwuwartościowego przez &gt;20 minut. Wykresy funkcji gęstości prawdopodobieństwa (PDF) po prawej stronie pokazują rozkład transmisji i są zakodowane kolorami odpowiadającymi segmentom niebieskim i fioletowym. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Próbka złota DNH zamontowana w wydrukowanej w technologii 3D celi przepływowej. Próbka jest umieszczana w specjalnym gnieździe i przytwierdzana do celi przepływowej za pomocą dwustronnej taśmy klejącej PET. Oznaczono kluczowe parametry i powiązane pomiary dla projektu naszej celi przepływowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-1%20Sample%20mounted%20in%20flow%20cell_amended.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Tył celi przepływowej z zamontowaną próbką złotego DNH i oznakowaną wewnętrzną ścianką. Próbka jest uszczelniona w celi przepływowej za pomocą silikonu powielającego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-2%20Inner%20wall%20of%20hole%20in%20flow%20cell.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 3: Schemat celi przepływowej z zamontowanym złotym DNH z opisanymi otworami wlotowymi i wylotowymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-3%20Intake%20and%20outtake%20holes.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Plazmoniczne pęsety wykorzystują zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonów w nanostrukturach złota, aby uwięzić pojedyncze nanocząsteczki, w tym białka, w polu optycznym o skali nanometrowej. Zmiany w rozproszonym sygnale ujawniają obecność białka i dynamikę konformacyjną, umożliwiając monitorowanie bez modyfikacji fluoroforu lub wiązania powierzchni.

Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety

Current single-molecule techniques to characterize proteins typically require labels, tethers, or the use of non-native solution conditions. Such changes ...

Badania te mają na celu uzyskanie wglądu w białka bezznacznikowe na poziomie pojedynczej cząsteczki w czasie rzeczywistym, ze szczególnym uwzględnieniem białek, które są trudne do zbadania przy użyciu obecnych technik lub mają znaczenie dla choroby. Plazmoniczne pęsety wykazały ostatnio swoją zdolność do monitorowania dynamiki konformacji po związaniu się z małymi cząsteczkami, sprawdzania kinetyki demontażu i wyjaśniania krajobrazów energii swobodnej, a wszystko to na poziomie pojedynczej cząsteczki. Obecnie żadna ustalona technika charakteryzacji białek nie jest w stanie zbadać dynamiki konformacyjnej białek jednocząsteczkowych bez znaczników.Uważa się, że plazmoniczne pęsety mają potencjał, aby wypełnić tę niszę w tej dziedzinie. Ta wyjątkowa zaleta pomaga nam badać związek między zmianą konformacyjną białek a ich funkcjami biologicznymi i implikacjami dla rozwoju choroby. Przyszłe badania będą koncentrować się na białkach wewnętrznie nieuporządkowanych i błonowych, ponieważ wiele z nich jest związanych z kilkoma chorobami, takimi jak choroba Alzheimera, Parkinsona i różne nowotwory.Aby rozpocząć, umieść próbkę pokrytą PEG-tiolem w wydrukowanej w 3D komórce przepływowej za pomocą prostej pęsety, upewniając się, że warstwa złota jest skierowana do góry. Odklej jedną stronę przezroczystej plastikowej osłony taśmy dwustronnej PET. Ostrożnie umieść taśmę na próbce i komorze przepływowej, upewniając się, że nanostruktury i otwory wlotowe/wylotowe w komorze przepływowej pozostają odsłonięte.Za pomocą zaokrąglonej pęsety delikatnie dociśnij krawędzie taśmy, aby zapewnić jej przyleganie do komory przepływowej i próbki. Odklej drugą stronę taśmy i delikatnie umieść szkiełko pokrywy na próbce. Użyj zaokrąglonej pęsety, aby docisnąć krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby zapewnić jego przyczepność.W procesie tym w komorze przepływowej powstaje kanał cieczy o wysokości 50 mikrometrów i objętości 3,5 mikrolitra. Za pomocą małej końcówki do pipety wymieszać równe części roztworu A i roztworu B powielającego silikonu na szkiełku mikroskopowym w stosunku jeden do jednego lub określonym przez producenta. Wypełnij szczeliny między szkiełkiem nakrywkowym a komorą przepływową mieszanym silikonem powielającym, delikatnie wciskając go pod szkiełko nakrywkowe.Przytrzymaj komorę przepływową do góry nogami i ostrożnie nałóż duplikujący silikon wokół wewnętrznej ścianki otworu. Delikatnie przesuń silikon na widoczne krawędzie stopionej krzemionki pod spodem próbki, pozostawiając próbkę do wyschnięcia z warstwą złota skierowaną do góry, aż powielający silikon całkowicie stwardnieje. Po sprawdzeniu, czy wszystkie komponenty są prawidłowo podłączone, załaduj interfejs użytkownika systemu mikroprzepływowego na komputer.Kliknij ikonę odtwarzania obok rozdzielacza i przewodu MUX, które sterują odpowiednio zaworem obrotowym 12 przez jeden i zaworem trzydrogowym przez dwa, aby otworzyć ich odpowiednie interfejsy. Aby ominąć zawór trójdrogowy przez dwukierunkowy, włącz port pierwszy przewodu. Aby zamontować komórkę przepływową w plazmonicznej pęsetie, przymocuj rurki wlotowe i wylotowe do odpowiednich części celi przepływowej.Umieść komórkę przepływową na czystej tkance ze złotą warstwą skierowaną do góry. Wlej bufor do komory przepływowej z dużym natężeniem przepływu około 0,3 mililitra na minutę. Sprawdź, czy płyn przemieszcza się po próbce wewnątrz komory przepływowej i czy żaden płyn nie jest widoczny na zewnątrz lub na spodzie.Nałóż jedną lub dwie krople olejku immersyjnego na obiektyw 100X. Umieść komórkę przepływową w plazmonicznym stoliku pęsety ze złotą warstwą skierowaną w dół. Zabezpiecz komorę przepływową za pomocą metalowych klipsów nad magnesami i zablokuj scenę, aby utrzymać ją na miejscu.Włącz źródło białego światła. Otwórz oprogramowanie aparatu i dostosuj czas ekspozycji i wzmocnienie, aż nanostruktury staną się widoczne. Włącz laser ze stosunkowo dużą mocą i ręcznie wyreguluj oś Z, aż plamka lasera będzie widoczna.Włącz sterownik piezoelektryczny i wybierz odpowiednie ustawienia dla portu komunikacyjnego i maksymalnego napięcia. Ustaw wartości osi X, Y i Z na połowę maksymalnego napięcia, aby umożliwić lepsze wyrównanie stolika we wszystkich kierunkach. Dopasuj plamkę lasera do jednej z podwójnych struktur nanootworów lub DNH za pomocą pokręteł sterujących osi X, Y i Z głównego stopnia.Upewnij się, że fotodioda lawinowa lub APD jest włączona. Delikatnie zamknij obudowę do plazmonicznej pęsety. Otwórz oprogramowanie powiązane z nagrywaniem APD, takie jak domowy interfejs użytkownika LabVIEW. Edytuj nazwę pliku i ustaw częstotliwość odcięcia na jeden kiloherc.Następnie określ żądaną ścieżkę do pliku, w którym pliki zostaną zapisane. Wyłącz źródło światła białego i ponownie włącz laser. Po ustawieniu mocy lasera na odpowiednim poziomie, użyj piezoelektrycznych elementów sterujących, aby wyregulować osie X, Y i Z, aż sygnał APD będzie tak wysoki, jak to możliwe.Unikanie nasycenia APD i minimalne odchylenie standardowe śladu. Następnie wyłącz laser, aby zachować żywotność nanostruktur. Uruchom jednostkę sterującą pompy strzykawkowej i interfejs użytkownika dystrybutora, aby ustawić zawór i pobrać żądaną ilość białka.Korzystając z mikroprzepływowego interfejsu użytkownika, wlej roztwór białkowy z szybkością przepływu podobną do szybkości odciągania. Kontynuuj infuzję z tą szybkością, aż roztwór białka dotrze do komórki przepływowej. Następnie ustaw natężenie przepływu na odpowiednią wartość do zalewkowania i poczekaj, aż ścieżka się ustabilizuje.Sprawdzić, czy objętość i czas na pompie strzykawkowej są zgodne z oczekiwanymi wartościami. Aby zarejestrować dane sygnału APD, dostosuj osie X, Y i Z zgodnie z potrzebami za pomocą interfejsu użytkownika kontrolera piezoelektrycznego. Po zaobserwowaniu dużej zmiany w transmisji i odchyleniu standardowym, zanotuj czas, w którym to nastąpi dla przyszłego sortowania danych. Jeśli białko musi zostać uwolnione w ramach eksperymentu, wyłącz laser na około pięć sekund, a następnie włącz go ponownie.Ślad powinien charakteryzować się dużą zmianą transmisji i znacznie mniejszym odchyleniem standardowym, co wskazuje na powrót do stanu wyjściowego. Po zakończeniu eksperymentu wyłącz laser. Wyjmij komórkę przepływową ze stolika trójosiowego i odłącz rurkę układu mikroprzepływowego.Umieść komórkę przepływową na czystej tkance ze złotą warstwą skierowaną do góry. Za pomocą skalpela ostrożnie odetnij klej pod szkiełkiem pokrywy, a następnie delikatnie go zdejmij i wyrzuć. Trzymaj kuwetę przepływową pod kątem, tak aby warstwa złota była nadal skierowana do góry i użyj zaokrąglonej pęsety, aby ostrożnie usunąć klej ze spodu komory przepływowej, aby uwolnić próbkę.Za pomocą prostej pęsety podnieś próbkę i dokładnie spłucz ją izopropanolem. Wysuszyć próbkę za pomocą pistoletu pneumatycznego. Reprezentatywny eksperyment przeprowadzony na obciążeniu in-situ żelazem do cząsteczki apoferrytyny demonstruje zastosowanie plazmonicznej pęsety jako narzędzia do badania dynamiki konformacji białek.Ślad transmisji apoferrytyny pozostaje stabilny, gdy jest uwięziony w roztworze PBS, co wskazuje na brak istotnych zmian konformacyjnych. Po wystawieniu na działanie roztworu żelaza wahania odchyleń standardowych śladu wzrosły, co wskazuje na dynamiczne zmiany strukturalne związane z obciążeniem żelazem. Po 20 minutach ekspozycji na żelazo ślad transmisji ustabilizował się, wskazując na przejście apoferrytyny do jej holoformy.Wykresy funkcji gęstości prawdopodobieństwa wykazały zmianę rozkładu napięcia po obciążeniu żelazem, co dodatkowo wspiera konformacyjne przejście od apoferrytyny do holoferrytyny.

monitoring-conformational-dynamics-single-unmodified-proteins-using

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Wykazano, że pęsety plazmoniczne oraz nanostruktury kryształów fotonicznych zapewniają istotną poprawę wydajności i kontroli orientacji w optycznym chwytaniu mikro- i nanocząstek.

Wykorzystanie plazmonicznych i fotonicznych nanostruktur krystalicznych do usprawnionej manipulacji mikro- i nanocząsteczkami

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Pęsety optyczne były używane do badania fałdowania RNA poprzez rozciąganie pojedynczych cząsteczek od ich końców 5' i 3'. Tutaj opisano typowe procedury syntezy cząsteczek RNA do pęsety, kalibracji instrumentu i metod manipulowania pojedynczymi cząsteczkami.

Nanomanipulacja pojedynczymi cząsteczkami RNA za pomocą pęsety optycznej

Przedstawiono tutaj proces produkcji mikroprocesorów, który wykorzystuje plazmoniczną pęsetę. Mikroczip umożliwia obrazowanie uwięzionej cząstki w celu zmierzenia maksymalnych sił wychwytywania.

Pułapkowanie plazmoniczne i uwalnianie nanocząstek w środowisku monitorowania

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Opisujemy zastosowanie nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji procesu samoorganizacji białek w agregaty oligomeryczne i fibryle amyloidowe, co jest ściśle związane z powstawaniem i rozwojem szerokiego zakresu ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych

Ten protokół przedstawia kompletny eksperymentalny przepływ pracy do badania interakcji RNA-białko za pomocą pęsety optycznej. Przedstawiono kilka możliwych konfiguracji eksperymentalnych, w tym połączenie pęsety optycznej z mikroskopią konfokalną.

Pęseta optyczna do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Obecny protokół opisuje wygodne podejście do integracji optycznego pułapkowania i powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana (SERS) do manipulowania plazmonicznymi nanocząstkami w celu czułego wykrywania molekularnego. Bez środków agregujących, laser pułapkujący gromadzi plazmoniczne nanocząstki w celu wzmocnienia sygnałów SERS docelowych analitów do pomiarów spektroskopowych in situ.

Optyczne pułapkowanie nanocząstek plazmonicznych do charakterystyki spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo in situ

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Poznaj zastosowanie plazmonicznych pęset do monitorowania dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia badanie zmian konformacyjnych bez konieczności stosowania fluoroforów.

Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety

Przeglądaj więcej filmów