Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety
March 21st, 2025
Plazmoniczne pęsety wykorzystują zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonów w nanostrukturach złota, aby uwięzić pojedyncze nanocząsteczki, w tym białka, w polu optycznym o skali nanometrowej. Zmiany w rozproszonym sygnale ujawniają obecność białka i dynamikę konformacyjną, umożliwiając monitorowanie bez modyfikacji fluoroforu lub wiązania powierzchni.
Badania te mają na celu uzyskanie wglądu w białka bezznacznikowe na poziomie pojedynczej cząsteczki w czasie rzeczywistym, ze szczególnym uwzględnieniem białek, które są trudne do zbadania przy użyciu obecnych technik lub mają znaczenie dla choroby. Plazmoniczne pęsety wykazały ostatnio swoją zdolność do monitorowania dynamiki konformacji po związaniu się z małymi cząsteczkami, sprawdzania kinetyki demontażu i wyjaśniania krajobrazów energii swobodnej, a wszystko to na poziomie pojedynczej cząsteczki. Obecnie żadna ustalona technika charakteryzacji białek nie jest w stanie zbadać dynamiki konformacyjnej białek jednocząsteczkowych bez znaczników.
Uważa się, że plazmoniczne pęsety mają potencjał, aby wypełnić tę niszę w tej dziedzinie. Ta wyjątkowa zaleta pomaga nam badać związek między zmianą konformacyjną białek a ich funkcjami biologicznymi i implikacjami dla rozwoju choroby. Przyszłe badania będą koncentrować się na białkach wewnętrznie nieuporządkowanych i błonowych, ponieważ wiele z nich jest związanych z kilkoma chorobami, takimi jak choroba Alzheimera, Parkinsona i różne nowotwory.
Aby rozpocząć, umieść próbkę pokrytą PEG-tiolem w wydrukowanej w 3D komórce przepływowej za pomocą prostej pęsety, upewniając się, że warstwa złota jest skierowana do góry. Odklej jedną stronę przezroczystej plastikowej osłony taśmy dwustronnej PET. Ostrożnie umieść taśmę na próbce i komorze przepływowej, upewniając się, że nanostruktury i otwory wlotowe/wylotowe w komorze przepływowej pozostają odsłonięte.
Za pomocą zaokrąglonej pęsety delikatnie dociśnij krawędzie taśmy, aby zapewnić jej przyleganie do komory przepływowej i próbki. Odklej drugą stronę taśmy i delikatnie umieść szkiełko pokrywy na próbce. Użyj zaokrąglonej pęsety, aby docisnąć krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby zapewnić jego przyczepność.
W procesie tym w komorze przepływowej powstaje kanał cieczy o wysokości 50 mikrometrów i objętości 3,5 mikrolitra. Za pomocą małej końcówki do pipety wymieszać równe części roztworu A i roztworu B powielającego silikonu na szkiełku mikroskopowym w stosunku jeden do jednego lub określonym przez producenta. Wypełnij szczeliny między szkiełkiem nakrywkowym a komorą przepływową mieszanym silikonem powielającym, delikatnie wciskając go pod szkiełko nakrywkowe.
Przytrzymaj komorę przepływową do góry nogami i ostrożnie nałóż duplikujący silikon wokół wewnętrznej ścianki otworu. Delikatnie przesuń silikon na widoczne krawędzie stopionej krzemionki pod spodem próbki, pozostawiając próbkę do wyschnięcia z warstwą złota skierowaną do góry, aż powielający silikon całkowicie stwardnieje. Po sprawdzeniu, czy wszystkie komponenty są prawidłowo podłączone, załaduj interfejs użytkownika systemu mikroprzepływowego na komputer.
Kliknij ikonę odtwarzania obok rozdzielacza i przewodu MUX, które sterują odpowiednio zaworem obrotowym 12 przez jeden i zaworem trzydrogowym przez dwa, aby otworzyć ich odpowiednie interfejsy. Aby ominąć zawór trójdrogowy przez dwukierunkowy, włącz port pierwszy przewodu. Aby zamontować komórkę przepływową w plazmonicznej pęsetie, przymocuj rurki wlotowe i wylotowe do odpowiednich części celi przepływowej.
Umieść komórkę przepływową na czystej tkance ze złotą warstwą skierowaną do góry. Wlej bufor do komory przepływowej z dużym natężeniem przepływu około 0,3 mililitra na minutę. Sprawdź, czy płyn przemieszcza się po próbce wewnątrz komory przepływowej i czy żaden płyn nie jest widoczny na zewnątrz lub na spodzie.
Nałóż jedną lub dwie krople olejku immersyjnego na obiektyw 100X. Umieść komórkę przepływową w plazmonicznym stoliku pęsety ze złotą warstwą skierowaną w dół. Zabezpiecz komorę przepływową za pomocą metalowych klipsów nad magnesami i zablokuj scenę, aby utrzymać ją na miejscu.
Włącz źródło białego światła. Otwórz oprogramowanie aparatu i dostosuj czas ekspozycji i wzmocnienie, aż nanostruktury staną się widoczne. Włącz laser ze stosunkowo dużą mocą i ręcznie wyreguluj oś Z, aż plamka lasera będzie widoczna.
Włącz sterownik piezoelektryczny i wybierz odpowiednie ustawienia dla portu komunikacyjnego i maksymalnego napięcia. Ustaw wartości osi X, Y i Z na połowę maksymalnego napięcia, aby umożliwić lepsze wyrównanie stolika we wszystkich kierunkach. Dopasuj plamkę lasera do jednej z podwójnych struktur nanootworów lub DNH za pomocą pokręteł sterujących osi X, Y i Z głównego stopnia.
Upewnij się, że fotodioda lawinowa lub APD jest włączona. Delikatnie zamknij obudowę do plazmonicznej pęsety. Otwórz oprogramowanie powiązane z nagrywaniem APD, takie jak domowy interfejs użytkownika LabVIEW. Edytuj nazwę pliku i ustaw częstotliwość odcięcia na jeden kiloherc.
Następnie określ żądaną ścieżkę do pliku, w którym pliki zostaną zapisane. Wyłącz źródło światła białego i ponownie włącz laser. Po ustawieniu mocy lasera na odpowiednim poziomie, użyj piezoelektrycznych elementów sterujących, aby wyregulować osie X, Y i Z, aż sygnał APD będzie tak wysoki, jak to możliwe.
Unikanie nasycenia APD i minimalne odchylenie standardowe śladu. Następnie wyłącz laser, aby zachować żywotność nanostruktur. Uruchom jednostkę sterującą pompy strzykawkowej i interfejs użytkownika dystrybutora, aby ustawić zawór i pobrać żądaną ilość białka.
Korzystając z mikroprzepływowego interfejsu użytkownika, wlej roztwór białkowy z szybkością przepływu podobną do szybkości odciągania. Kontynuuj infuzję z tą szybkością, aż roztwór białka dotrze do komórki przepływowej. Następnie ustaw natężenie przepływu na odpowiednią wartość do zalewkowania i poczekaj, aż ścieżka się ustabilizuje.
Sprawdzić, czy objętość i czas na pompie strzykawkowej są zgodne z oczekiwanymi wartościami. Aby zarejestrować dane sygnału APD, dostosuj osie X, Y i Z zgodnie z potrzebami za pomocą interfejsu użytkownika kontrolera piezoelektrycznego. Po zaobserwowaniu dużej zmiany w transmisji i odchyleniu standardowym, zanotuj czas, w którym to nastąpi dla przyszłego sortowania danych. Jeśli białko musi zostać uwolnione w ramach eksperymentu, wyłącz laser na około pięć sekund, a następnie włącz go ponownie.
Ślad powinien charakteryzować się dużą zmianą transmisji i znacznie mniejszym odchyleniem standardowym, co wskazuje na powrót do stanu wyjściowego. Po zakończeniu eksperymentu wyłącz laser. Wyjmij komórkę przepływową ze stolika trójosiowego i odłącz rurkę układu mikroprzepływowego.
Umieść komórkę przepływową na czystej tkance ze złotą warstwą skierowaną do góry. Za pomocą skalpela ostrożnie odetnij klej pod szkiełkiem pokrywy, a następnie delikatnie go zdejmij i wyrzuć. Trzymaj kuwetę przepływową pod kątem, tak aby warstwa złota była nadal skierowana do góry i użyj zaokrąglonej pęsety, aby ostrożnie usunąć klej ze spodu komory przepływowej, aby uwolnić próbkę.
Za pomocą prostej pęsety podnieś próbkę i dokładnie spłucz ją izopropanolem. Wysuszyć próbkę za pomocą pistoletu pneumatycznego. Reprezentatywny eksperyment przeprowadzony na obciążeniu in-situ żelazem do cząsteczki apoferrytyny demonstruje zastosowanie plazmonicznej pęsety jako narzędzia do badania dynamiki konformacji białek.
Ślad transmisji apoferrytyny pozostaje stabilny, gdy jest uwięziony w roztworze PBS, co wskazuje na brak istotnych zmian konformacyjnych. Po wystawieniu na działanie roztworu żelaza wahania odchyleń standardowych śladu wzrosły, co wskazuje na dynamiczne zmiany strukturalne związane z obciążeniem żelazem. Po 20 minutach ekspozycji na żelazo ślad transmisji ustabilizował się, wskazując na przejście apoferrytyny do jej holoformy.
Wykresy funkcji gęstości prawdopodobieństwa wykazały zmianę rozkładu napięcia po obciążeniu żelazem, co dodatkowo wspiera konformacyjne przejście od apoferrytyny do holoferrytyny.
Przegląd
To badanie eksploruje zastosowanie plazmonicznych nanoszczypiec do monitorowania w czasie rzeczywistym białek bez oznaczników na poziomie pojedynczych cząsteczek. Technika ta pozwala na badanie dynamiki konformacyjnej białek bez konieczności modyfikacji fluoroforów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Biochemia
Tło
- Obecne techniki mają trudności z badaniem dynamiki białek bez oznaczników na poziomie pojedynczych cząsteczek.
- Plazmoniczne nanoszczypce wykorzystują lokalizowaną rezonansową plazmonowo-powierzchniową.
- Pozwała na monitorowanie zmian konformacyjnych białek i zdarzeń wiązania.
- Mają zastosowanie w badaniach nad chorobami takimi jak Alzheimera i Parkinsona.
Cel badania
- Zbadanie związku między zmianami konformacyjnymi białek a funkcjami biologicznymi.
- Wypełnienie luki w technikach badania białek bez oznaczników.
- Skupienie się na białkach intrinsycznie nieuporządkowanych i membranowych, związanych z chorobami.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek w komorze przepływowej wydrukowanej w 3D.
- Zastosowanie mikrosystemów do kontroli napływu białek.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym interakcji białek przy użyciu plazmonicznych nanoszczypiec.
- Zbieranie danych za pomocą rejestracji diody fotoavalancha (APD).
Główne wyniki
- Skuteczna obserwacja dynamiki konformacyjnej białek na poziomie pojedynczych cząsteczek.
- Zdolność do obserwacji kinetyki wiązania i dezorganizacji.
- Dostarczenie wglądu w krajobrazy energii wolnej białek.
- Podkreślenie potencjału dla przyszłych badań nad białkami związanymi z chorobami.
Wnioski
- Plazmoniczne nanoszczypce są obiecującym narzędziem do badania białek bez oznaczników.
- Mogą dostarczyć krytycznych informacji na temat zachowania białek związanych z chorobami.
- Przyszłe badania rozszerzą ich zastosowanie na różne wymagające białka.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Plasmonic nanotweezers enable real-time, label-free monitoring of single protein conformational dynamics, addressing a critical gap in early discovery and mechanistic de-risking. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports portfolio decisions for disease-relevant proteins, including those implicated in neurodegeneration and cancer. The approach offers enterprise R&D teams a scalable, non-perturbative method for interrogating protein function under native conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of conformational changes in unmodified proteins at the single-molecule level.
- Supports mechanistic de-risking by linking structural dynamics to biological function and disease relevance.
- Facilitates target validation for proteins previously inaccessible to label-dependent techniques.
- Provides real-time data on protein-ligand interactions and assembly/disassembly kinetics.
Screening & Assay Development
- Delivers quantitative, label-free readouts of protein conformational states for assay standardization.
- Enables reproducible monitoring of protein responses to environmental or compound perturbations.
- Supports development of screening platforms for challenging targets such as intrinsically disordered or membrane proteins.
- Allows for rapid adaptation to new protein systems without re-engineering labeling strategies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant protein targets implicated in neurodegenerative and oncologic pathways.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical model selection.
- Enables risk-adjusted advancement by revealing conformational biomarkers and dynamic signatures.
- Supports translational biomarker identification through real-time monitoring of protein state transitions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven interrogation of protein dynamics, supporting both early-stage target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on protein structure-function relationships and pathway engagement.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for compound or condition screening in native-like environments.
- Analytics: Generates high-resolution, time-resolved data on conformational changes and kinetic profiles.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease models by tracking protein state changes relevant to pathology.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free platform adaptable to diverse protein targets and workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-molecule protein analysis without the need for labeling or non-native conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by providing actionable, real-time data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on dynamic structural insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plasmonics, microfluidics, and single-molecule biophysics.
- Demands specialized instrumentation including gold nanostructures, APD detection, and microfluidic control.
- Necessitates cross-team standardization for data acquisition and analysis protocols.
- Adaptable to a range of protein systems but may require optimization for specific targets.
- Limited by the need for precise environmental control and potential throughput constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:26
Mounting the PEG Coated Sample into a Flow Cell
3:12
Preparing Microfluidics System and Mounting the Flow Cell into Plasmonic Nanotweezers
4:33
Locating Nanostructures on Sample
5:34
Optimally Aligning the Laser with the Desired Nanostructure and Infusing Proteins into the Flow Cell
6:59
Collecting Data and Unmounting the Sample
8:29
Results
