Name: Multipleksowane pomiary proteolizy siły pojedynczej cząsteczki za pomocą pęsety magnetycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj technikę pęset magnetycznych do badania proteolizy pojedynczych cząsteczek kolagenu przez metaloproteinazę macierzy. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustową analizę kinetyki enzymatycznej pod wpływem sił mechanicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface (A.R.D.), National Institutes of Health w ramach programu NIH Director's New Innovator Award 1-DP2-OD007078 (A.R.D.), William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (A.S.A.) oraz Stanford Cardiovascular Institute Younger Predoctoral Fellowship (J.C.). Autorzy dziękują Jamesowi Spudichowi za udostępnienie sprzętu mikroskopowego.

1. Przygotowanie komory przepływowej
<ol>
	<li>Kolebki szklane (#1.5, 22x22 mm i 22x40 mm, VWR) są czyszczone za pomocą sonikacji.
	<ol>
		<li>Umieść kolebki w niewielkim szklanym pojemniku, który pomieści kolebki i zmieści się w sonikatorze (patrz krok 2).</li>
		<li>Napełnij pojemnik izopropanolem i poddaj sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 20 minut.</li>
		<li>Wylej izopropanol i przepłucz kolebki obfitymi ilościami wody dejonizowanej uzyskanej z urządzenia Barnsted MilliQ lub podobnego urządzenia. Napełnij pojemnik wodą i poddaj sonikacji przez 20 minut.</li>
		<li>Po sonikacji wysusz kolebki strumieniem filtrowanego, wolnego od kurzu powietrza. Używaj tylko kolebek, które wydają się czyste (tzn. bez smug).</li>
		<li>Delikatnie opal kolebki płomieniem przez kilka sekund, aby oczyścić je z pozostałego kurzu i wilgoci: przesuń kolebki przez płomień gazowy wytworzony palnikiem Bunsena, uważając, aby nie zdeformować kolebki pod wpływem nadmiernego ciepła. Ten krok usuwa pozostałe zanieczyszczenia powierzchniowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą dwustronnej taśmy klejącej połącz dwie kolebki. Odetnij kawałek taśmy o długości ~3 cm i szerokości 0.3 cm. Przytwierdź taśmę do kolebki 22x40 mm, pozostawiając w środku kanał o szerokości 1.6 cm. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć kolebkę i upewnić się, że taśma prawidłowo przylega.</li>
</ol>
2. Konfiguracja i kalibracja pęset magnetycznych
<ol>
	<li>Pęsety magnetyczne skonfigurowano przy użyciu trwałych magnesów ziemioprzemagnesowych zgodnie z wcześniejszym opisem10,12. Zbudowano aluminiowy wspornik w kształcie litery L z otworem o średnicy 1 mm i zamontowano go na pionowym translokatorze osi z (Thorlabs), aby regulować wysokość pęset. Dwa trwałe magnesy ziemioprzemagnesowane przymocowano do wspornika po obu stronach otworu, aby stworzyć pułapkę magnetyczną (Rycina 1).</li>
	<li>Przygotowanie DNA: do kalibracji pęset magnetycznych wykorzystano DNA faga lambda znakowane na końcach 5' i 3' biotyną oraz digoksigeniną (IDT DNA, San Diego, CA).
	<ol>
		<li>Wymieszać 50 μL 4 nM λ-DNA z 2 μL 40 nM oligonukleotydu sprzężonego z biotyną i ogrzewać w 60 °C przez 10 minut. Następnie powoli chłodzić w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodać ligazę DNA zgodnie ze specyfikacją producenta i przeprowadzić ligację w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.</li>
		<li>Dodać 2 μL 400 nM oligonukleotydu sprzężonego z digoksigeniną i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.</li>
		<li>Dodać 1,5 μL 10 mM ATP i kontynuować ligację oligonukleotydu sprzężonego z digoksigeniną do λ-DNA przez 3 godziny.</li>
		<li>Usunąć nadmiar oligonukleotydów i ligazę DNA za pomocą filtrów wirowych 100 kDa (Microcon Ultracell YM-100). W celu usunięcia nadmiaru oligosów wystarczająca jest łącznie 1000-krotna wymiana buforu na bufor TE. Uwaga: ważne jest, aby nie stosować prędkości wirowania &gt;500xG, ponieważ doprowadzi to do pękania DNA.</li>
		<li>Przebadać próbkę DNA za pomocą elektroforezy na 0,7% żelu agarozy, aby upewnić się, że DNA nie uległo denaturacji ani pękaniu.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie DNA. Zaleca się użycie spektrometru UV-Vis Nanodrop (Thermo Scientific), ponieważ dostępna objętość próbki może być bardzo mała.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować komory przepływowe zgodnie z opisem w sekcji 1.</li>
	<li>W celu przytwierdzenia DNA do komory przepływowej dodać przeciwciało anty-digoksigeninowe (owcza IgG; 1 μg mL-1; Roche Bioscience, Manheim, Niemcy) i pozwolić mu przyprzylgnąć do szklanej powierzchni przez 15 minut.</li>
	<li>Spasywować powierzchnię komory przepływowej, aby zapobiec niespecyficznemu przywieraniu DNA, dodając 2 mg mL-1 BSA, 0,1% Tween-20 w 1x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.5.</li>
	<li>Dodać 50 pM funkcjonalizowanego λ-DNA i pozwolić mu przytwierdzić się do szkiełka nakrywki przez 15 minut.</li>
	<li>Wypłukać nadmiar DNA za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Dodać superparamagnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną (kuleczki 1 μm = 2 μg mL-1; kuleczki 2,8 μm = 20 μg mL-1) i pozwolić im przytwierdzić się do unieruchomionego DNA przez 15 minut.</li>
	<li>Wypłukać nadmiar kuleczek za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Kalibracja pęset magnetycznych
	<ol>
		<li>Przesunąć trwałe magnesy w pozycję oddaloną od powierzchni próbki (&gt;15 mm).</li>
		<li>Umieścić przygotowaną komorę przepływową w mikroskopie.</li>
		<li>Przesunąć trwałe magnesy w pozycję nad komorą przepływową.</li>
		<li>Wybrać płaszczyznę ogniskową kuleczek funkcjonalizowanych λ-DNA, ustawiając ostrość na kuleczkach z dala od obu szklanych powierzchni. Prawidłowa płaszczyzna ogniskowa to taka, w której pożądane kuleczki mają jasne centrum.</li>
		<li>Nagrać wideo ruchu kuleczek z częstotliwością 80 Hz lub większą przez 500 klatek.</li>
		<li>Przesunąć magnes bliżej powierzchni próbki. Dla odległości powyżej 5 mm przesuwać w przyrostach 1 mm. Dla odległości między 1 a 5 mm przesuwać w przyrostach 0,5 mm. Dla odległości mniejszych niż 1 mm przesuwać w przyrostach 0,25 mm.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.11.5 i 2.11.6 dla każdej nowej pozycji magnesu.</li>
		<li>Dla każdego zestawu danych śledzić centrum kuleczek za pomocą dopasowania gaussowskiego 2D.</li>
		<li>Obliczyć siłę poprzez fluktuacje Browna, korzystając z wzoru:</li>
	</ol>
	 <img alt="Wzór równowagi sił F=kBT*L/⟨x²⟩; mechanika statystyczna, fluktuacje termiczne." src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie kBT to termiczna energia Boltzmanna, L to długość λ-DNA, a &lt;x2&gt; to wariancja pozycji centroidu. 
	<ol start="10">
		<li>Potwierdzić dokładność sił, sprawdzając obliczenia siły poprzez dopasowanie lorentzowskie widma mocy w celu znalezienia częstotliwości odcięcia. Przyłożona siła jest powiązana z częstotliwością odcięcia zależnością:</li>
	</ol>
	 <img alt="Równanie dynamiki płynów, wzór F = 12π²μaf₀L, związane z analizą oporu przepływu." src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> 
	gdzie ƒ0 to częstotliwość odcięcia, a to promień kuleczki, a μ to lepkość cieczy12. </li>
</ol>
3. Mocowanie peptydów kolagenowych do komór przepływowych
Aby przedstawić konkretny przykład zastosowania naszej metodologii, opisujemy niedawne prace w naszym laboratorium, które charakteryzują proteolizę trymerycznego peptydowego modelu kolagenu. Przewidujemy, że to ogólne podejście może znaleźć szerokie zastosowanie w przypadku innych białek i polinukleotydów.
<ol>
	<li>Modelowy peptyd kolagenowy składa się z N-terminalny znacznik 6x His do oczyszczania, po którym następuje 5x myc znacznik, (GPP)10 Aby wymusić formowanie potrójnej helisy, zastosowano reszty 772-786 kolagenu α1 (GPQGIAGQRGVVGL), które tworzą miejsce rozpoznawania MMP-1, sekwencję foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) oraz C-terminalny KKCK w celu ułatwienia znakowania biotyną-maleimidem. Foldon pochodzi z białka fibrytyny bakteriofaga T4 i stabilizuje trimery modelu kolagenu po połączeniu z końcem N- lub Ckoniec13,14.</li>
	<li>Peptyd kolagenowy oraz białka MMP-1 wyekspresowano i oczyszczono zgodnie z wcześniejszym opisem4,15.</li>
	<li>Dodaj przeciwciałomyc (15 μg ml-1) do komórki przepływowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby umożliwić przeciwciałom anty-myc do przytwierdzenia do powierzchni komórki przepływowej.</li>
	<li>Pasywuj komórkę przepływową za pomocą 5 mg/ml, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu białek.-1 BSA w ten sam sposób, jak opisano w kroku 2.5.</li>
	<li>Dodaj 150 pM peptydu kolagenowego i pozwól mu przyłączyć się do przeciwciała za pomocą myc inkubować przez 45 minut.</li>
	<li>Wypłukać nadmiar kolagenu, używając buforu PBS.</li>
	<li>Dodaj superparamagnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną (1 μm kuleczki 2 μg ml-1i 2.8 μm koraliki = 20 μg ml-1) i pozostawić je na 45 minut w celu przywiązania do cząsteczek kolagenu. 1 μm kuleczki należy rozcieńczyć do pożądanego stężenia w PBS. 3 μm Kuleczki należy oddzielić od roztworu za pomocą silnych magnesów, a następnie ponownie rozpuścić w PBS. Proces ten należy powtórzyć 3 razy. Zauważyliśmy, że krok ten jest niezbędny do uzyskania 3 μm kuleczki do wiązania z unieruchomionym na powierzchni peptydem kolagenowym.</li>
</ol>
4. Analiza wymuszonej proteolizy
<ol>
	<li>Po zmontowaniu komórki przepływowej z peptydem kolagenowym i kuleczkami magnetycznymi, obrazuj komórkę w pułapce magnetycznej przy niskiej sile, około 1 pN. Z naszego doświadczenia wynika, że subpopulacja kuleczek czasami słabo przylega do powierzchni w sposób niespecyficzny. Przyłożenie niewielkiej siły zapewnia uwolnienie tych kuleczek.</li>
	<li>Dodaj aktywowany enzym do komórki przepływowej. W tym przypadku MMP-1 został uprzednio aktywowany poprzez dodanie 3,5 mM APMA (octan 4-aminofenylowego rtęciowego) i inkubowany w 37 °C przez 3 godziny. Aktywację zweryfikowano za pomocą SDS-PAGE.</li>
	<li>Natychmiast po ponownym wprowadzeniu komórki przepływowej do aparatu pęsety magnetycznej, zarejestruj wideo obejmujące kilka pól widzenia, co zazwyczaj pozwala uzyskać kilkaset przyczepionych kuleczek. Będzie to czas t = 0.</li>
	<li>Powtarzaj proces rejestrowania kilku pól widzenia (powracając do tego samego pola widzenia) w regularnych odstępach czasu, aż wszystkie kuleczki się odczepią lub aż proteoliza nie będzie już zauważalna.</li>
	<li>Analiza danych kinetycznych
	<ol>
		<li>Policz kuleczki w różnych polach widzenia w różnych punktach czasowych i oblicz ich średnią. Znormalizuj liczbę kuleczek, dzieląc średnią liczbę kuleczek w każdym punkcie czasowym przez liczbę kuleczek w t = 0. Zapewnia to możliwość porównania szybkości proteolizy z różnych eksperymentów, ponieważ absolutna liczba kuleczek będzie różnić się od doświadczenia do doświadczenia.</li>
		<li>Przedstaw ten stosunek jako funkcję czasu. W tym przypadku dopasowaliśmy go do funkcji wykładniczego zaniku z dodatkiem stałej.</li>
	</ol>
	 <img alt="Wzór na zanik wykładniczy, f(t)=ae^(-bt)+c, stosowany w modelowaniu matematycznym i analizie." src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3"> 
	gdzie ƒ(t) to stosunek kuleczek przyczepionych (lub nieproteolizowanych cząsteczek kolagenu), t to czas, a to frakcja kuleczek przyczepionych za pomocą wiązania kolagenowego, b to stała szybkości zaniku, a c to frakcja kuleczek przyczepionych niespecyficznie. 
	<ol start="3">
		<li>Ten sam eksperyment powtórz przy różnych wartościach siły i stężeniach MMP-1, aby wyjaśnić wpływ siły na proteolizę kolagenu przez MMP-1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Powyższy protokół opisuje nowatorskie zastosowanie pęset magnetycznych (Rysunek 1) do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną. Kalibrację pęset dla kulek o średnicach 1 μm i 3 μm przeprowadzono, wykorzystując zarówno amplitudę obserwowanych fluktuacji Browna, jak i obliczenie częstotliwości spadkowej (roll-off frequency) dla różnych pozycji magnesu (Rysunek 2). W eksperymentach z proteolizy pod wpływem siły układ jest analogiczny, z wyjątkiem zastąpienia DNA kolagenem (Rysunki 3, 4). Znormalizowaną liczbę pozostałych kulek można przedstawić jako funkcję czasu, aby wyznaczyć szybkość proteolizy (Rysunek 5); proces ten można powtarzać dla różnych stężeń enzymu i różnych sił.
<img alt="Schemat pęsety magnetycznej, DNA lambda rozciągnięte siłą, powierzchnia pokryta BSA, układ eksperymentalny." src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat procesu kalibracji pułapki magnetycznej (nie w skali). Dwa stałe magnesy ziem rzadkich wytwarzają pole magnetyczne, które oddziałuje na superparamagnetyczną kuleczkę. Przesuwanie magnesu w górę i w dół reguluje przyłożoną siłę. Obrazy kuleczek są rejestrowane za pomocą konwencjonalnego mikroskopu w jasnym polu, przy czym światło przechodzi przez otwór między dwoma magnesami. Wstawka: Obraz wykonany obiektywem powietrznym 40x. Ostre, okrągłe punkty odpowiadają kuleczkom przytwierdzonym do powierzchni szkiełka podstawowego. Obiekty poza ogniskowaniem to kuleczki oderwane od powierzchni.
<img alt="Wykres siła-odległość, wpływ pola magnetycznego na cząstki o rozmiarach 1,0 µm i 2,8 µm; wynik analizy danych." src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2. Wykresy skalibrowanej siły w funkcji odległości magnesu od powierzchni próbki dla kulek o średnicach 1 μm (lewo) i 2,8 μm (prawo). Dane dopasowano do funkcji empirycznej <img alt="Równanie równowagi statycznej; siła=a/(x^2+bx+c); wzór z fizyki; analiza matematyczna." src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation4">, gdzie x oznacza odległość od magnesu. Dla kulek 1 μm a = 31,8, b= 5,61 oraz c = 4,39, a dla kulek 3 μm a = 140, b = 3,10 oraz c = 1,86. Wartości te są charakterystyczne dla naszego konkretnego urządzenia i geometrii eksperymentalnej; każde urządzenie powinno być kalibrowane indywidualnie. Słupki błędów dla każdego punktu reprezentują ~10% zmienności siły przyłożonej do poszczególnych kulek, wynikającą ze zmienności ich rozmiaru. Przyłożona siła jest proporcjonalna do objętości kulek, a objętość kulek różni się o ~9% względem średniej (zgodnie ze specyfikacją producenta).
<img alt="Macierz nanoprętów magnetycznych, równowaga statyczna, schemat, wyrównane dipole w zewnętrznym polu magnetycznym." src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Układ testu proteolizy wymuszonej siłowo (Nie w skali). Model trimeru kolagenu jest przytwierdzony do powierzchni szkiełka podstawowego za pomocą konjugacji myc/anty-myc. Superparamagnetyczne koraliki pokryte streptawidyną są przyłączone do trimerów kolagenu poprzez wiązanie biotyna-streptawidyna. Aktywne MMP-1 przecina kolagen w czasie, co powoduje odrywanie się koralików od powierzchni i ich przemieszczanie się poza płaszczyznę ogniskowania.
<img alt="Schemat procesu dyfuzji z rozprzestrzenianiem się cząsteczek w czasie w odstępach od t0 do tf." src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Schematyczny rysunek proteolizy w funkcji czasu. Rysunek przedstawia pole widzenia próbki w czasie, w którym zachodzi proteoliza. Z czasem MMP-1 przecina kolagen, a kuleczki odrywają się i oddalają od płaszczyzny ogniskowania pod wpływem pola magnetycznego.
<img alt="wykres szybkości degradacji kolagenu; słupki błędów; czas w minutach; analiza kinetyczna stabilności kolagenu" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Szybkości proteolizy zależą od przyłożonej siły16. Przedstawiono dane zebrane dla 1,0 pN (3 μM MMP-1; czarny), 6,2 pN (3 μM MMP-1; czerwony) oraz 13 pN (0,2 μM MMP-1; magenta). Szybkości proteolizy (parametry dopasowania) wynoszą: 0,22 ± 0,02 min-1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min-1 (6,2 pN) oraz 2,08 ± 0,18 min-1 (13 pN). Frakcja kulek niepoddanych proteolizie w późnych punktach czasowych (&gt; 15 minut) pozostaje w przybliżeniu stała na poziomie ~0,25 w różnych eksperymentach. Słupki błędów odpowiadają statystyce Poissona odzwierciedlającej liczbę obserwacji w każdym punkcie czasowym. Błąd w każdym punkcie czasowym dla n kulek wynosi n1/2. Błąd frakcji przyłączonych kulek obliczono metodą propagacji błędów. W eksperymentach dla 1,0 pN i 6,2 pN zastosowano kulek o średnicy 1 μm, a w eksperymentach dla 13 pN zastosowano kulek o średnicy 2,8 μm.

<ol><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+cancer+be+reversed+by+engineering+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).</li>
<li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).</li>
<li>Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+structure+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibrin structure and wound healing.</a> J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).</li>
<li>Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Load+Induces+a+100-Fold+Increase+in+the+Rate+of+Collagen+Proteolysis+by+MMP-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).</li>
<li>Zareian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+collagen%2Fenzyme+mechanochemistry+in+native+tissue+with+dynamic%2C+enzyme-induced+creep%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep.</a> Langmuir. 26, (2010).</li>
<li>Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+bovine+pericardium+accelerates+enzymatic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation.</a> Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).</li>
<li>Jesudason, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+regulate+elastase+activity+and+binding+site+availability+in+lung+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin.</a> Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+determination+of+unbinding+force%2C+off+rate+and+energy+barrier+for+protein-ligand+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction.</a> Micron. 38, 446-461 (2007).</li>
<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers in cell biology.</a> Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Frank, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+short+collagen-like+triple+helices+by+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering.</a> J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).</li>
<li>Stetefeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+stabilization+at+atomic+level%3A+crystal+structure+of+designed+%28GlyProPro%2910foldon%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon.</a> Structure. 11, 339-346 (2003).</li>
<li>Chung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+unwinds+triple-helical+collagen+prior+to+peptide+bond+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis.</a> EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).</li>
<li>Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+the+specific+adhesion+of+cells+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Models for the specific adhesion of cells to cells.</a> Science. 200, 618-627 (1978).</li>
<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSelvin%2C+PR+%22Single-molecule+techniques%3A+a+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22, 292-299 (2006).</li>
<li>Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+ligand-receptor+complexes+using+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers.</a> Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoenzymatic+cleavage+of+the+ultralarge+vascular+protein+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor.</a> Science. 324, 1330-1334 (2009).</li>
<li>Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).</li>
<li>del Rio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+single+talin+rod+molecules+activates+vinculin+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding.</a> Science. 323, 638-641 (2009).</li>
<li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers%3A+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół opisuje nowe zastosowanie klasycznej techniki pojedynczych cząsteczek. Pincety magnetyczne umożliwiają prowadzenie analiz pojedynczych cząsteczek o średniej i wysokiej przepustowości w sposób kosztowo efektywny. Jednakże, jak w przypadku wszystkich technik eksperymentalnych, istnieją wyzwania i potencjalne problemy.
Ograniczenia pęset magnetycznych
W porównaniu z pułapką optyczną rozdzielczość przestrzenna i czasowa aparatury MT jest niska. Co więcej...

<table><tbody><tr><td>Szkiełko nakrywkowe nr 1,5 (22x22)</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Kryszka szkiełkowa nr 1,5 (22x40)</td><td>VWR</td><td>48393-048</td><td></td></tr><tr><td>DNA lambda</td><td>Invitrogen</td><td>25250-010</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>Invitrogen</td><td>15224-041</td><td></td></tr><tr><td>Microcon Ultracel YM-100</td><td>Millipore</td><td>42413</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-digoksigenina</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11-333-089-001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Przeciw-&lt;em&gt;myc&lt;/em&gt; Przeciwciało</td><td>Invitrogen</td><td>46-0603</td><td></td></tr><tr><td>Seryjny albuminy wołowej</td><td>Sigma</td><td>B4287-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>658.01D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne T1 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>658.01D</td><td></td></tr><tr><td>Octan p-aminofenylortęci</td><td>Calbiochem</td><td>164610</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-maleimid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B1267</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotyd znakowany biotyną</td><td>DNA firmy IDT</td><td>Synteza na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Oligo znakowane digoksigeniną</td><td>DNA marki IDT</td><td>Synteza na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Gen peptydu kolagenu</td><td>DNA 2.0</td><td>Synteza na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>cDNA MMP-1</td><td>Harvardzka Baza Danych Plazmidów</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tłumacz z</td><td>Thorlabs</td><td>MTS50</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik serwo dla tłumacza</td><td>Thorlabs</td><td>TDC001</td><td></td></tr></tbody></table>

multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Generowanie i wykrywanie sił mechanicznych jest powszechnym aspektem fizjologii komórki, mającym bezpośredni związek z przerzutowaniem nowotworów1, aterogenezą2 oraz gojeniem ran3. W każdym z tych przykładów komórki zarówno wywierają siłę na swoje otoczenie, jak i jednocześnie enzymatycznie przebudowują macierz zewnątrzkomórkową (ECM). Wpływ sił na ECM stał się zatem obszarem znacznego zainteresowania ze względu na jego prawdopodobne znaczenie biologiczne i medyczne4-7.
	Techniki pojedynczych cząsteczek, takie jak pułapkowanie optyczne8, mikroskopia sił atomowych9 oraz pęsety magnetyczne10,11, pozwalają badaczom badać funkcję enzymów na poziomie molekularnym poprzez wywieranie sił na pojedyncze białka. Wśród tych technik pęsety magnetyczne (MT) wyróżniają się niskim kosztem i wysoką przepustowością. MT wywierają siły w zakresie ~1-100 pN i mogą zapewniać milisekundową rozdzielczość czasową, co czyni je odpowiednimi do badania mechanizmów enzymatycznych na poziomie pojedynczych cząsteczek12. W niniejszej pracy opisujemy wysoce równoległy test MT służący do badania wpływu siły na proteolizę pojedynczych cząsteczek białek. Przedstawiamy konkretny przykład proteolizy trymerycznego peptydu kolagenu przez metaloproteinazę macierzy 1 (MMP-1); jednak test ten można łatwo dostosować do badania innych substratów i proteaz.

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Generowanie i detekcja sił mechanicznych jest powszechnym aspektem fizjologii komórki, mającym bezpośredni związek z przerzutowaniem nowotworów1, aterogenezą2 ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie wpływu obciążenia mechanicznego na proteolityczne cięcie pojedynczych białek w sposób wysoce równoległy i efektywny kosztowo. W niniejszej demonstracji badane jest cięcie kolagenu przez metaloproteinazę macierzy 1; w pierwszym kroku do szkiełka nakrywkowego celi przepływowej mocowane są uchwyty do kolagenu, a następnie do poszczególnych cząsteczek kolagenu przytwierdza się magnetyczne kulki o rozmiarach mikrometrycznych. Drugim krokiem jest montaż celi przepływowej w aparaturze do pęset magnetycznych oraz sprawdzenie, czy z powierzchni szkiełka nakrywkowego usunięto kulki przyłączone nieswoiście.Następnie proteazę dodaje się do komór przepływowych. Ostatnim krokiem jest określenie szybkości proteolizy poprzez monitorowanie odrywania się kulek w czasie rzeczywistym. Poprzez pomiar szybkości odrywania się kulek przy różnych stężeniach proteazy i siłach, możliwe jest wyprowadzenie standardowych zoologicznych parametrów kinetycznych przy użyciu minimalnych ilości substratu i proteazy.Dodatkowo technika ta dostarcza unikalnych informacji na temat wpływu siły mechanicznej na szybkość proteolizy oraz na zmiany strukturalne w białku substrato

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wielowarstwowe pomiary siłowych proteolizy pojedynczych cząsteczek za pomocą szczypiec magnetycznych

Pęseta magnetyczna, potężna technika manipulacji pojedynczymi cząsteczkami, może być dostosowana do bezpośrednich pomiarów skrętu (przy użyciu konfiguracji zwanej pęsetą magnetyczną swobodnie orbitującą) i momentu obrotowego (przy użyciu konfiguracji określanej jako pęseta magnetyczna) w makrocząsteczkach biologicznych. Podano wytyczne dotyczące wykonywania takich pomiarów, w tym zastosowania do badania DNA i związanych z nim włókien nukleotywo-białkowych.

Pęseta magnetyczna do pomiaru skrętu i momentu obrotowego

Zgłoszono platformę jednocząsteczkowych pęsety magnetycznej do manipulowania G-quadruplexami, która pozwala na badanie stabilności i regulacji G4 przez różne białka.

Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami G-kwadrupleksów za pomocą pęsety magnetycznej

Opisano wysoce równoległą metodę pomiaru specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół ten demonstruje technikę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej NdeI. Metodę można łatwo zmodyfikować w celu zbadania dowolnego procesu, który prowadzi do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA.

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Ten protokół demonstruje użycie pęsety magnetycznej do badania interakcji między telomerowymi białkami wiążącymi DNA (Telomer Repeat-binding Factor 1 [TRF1] i TRF2) a długimi telomerami ekstrahowanymi z komórek ludzkich. Opisano w nim etapy przygotowawcze do telomerów i telomerowych czynników wiążących powtórzenia, wykonywanie eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach oraz metody gromadzenia i analizy danych.

Analiza telomerowych oddziaływań białko-DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej

Ilustrujemy zastosowanie osiowych pęset optycznych o stałej sile do badania właściwości mechanicznych krótkich cząsteczek DNA. Poprzez rozciąganie DNA wzdłuż osi minimalizujemy zawady steryczne oraz artefakty występujące w konwencjonalnej manipulacji bocznej, co pozwala nam badać cząsteczki DNA o długości nawet ~100 nm.

Rozciąganie krótkich sekwencji DNA za pomocą osiowych pęset optycznych o stałej sile

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Pęsety optyczne były używane do badania fałdowania RNA poprzez rozciąganie pojedynczych cząsteczek od ich końców 5' i 3'. Tutaj opisano typowe procedury syntezy cząsteczek RNA do pęsety, kalibracji instrumentu i metod manipulowania pojedynczymi cząsteczkami.

Nanomanipulacja pojedynczymi cząsteczkami RNA za pomocą pęsety optycznej

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Poznaj technikę pęset magnetycznych do badania proteolizy pojedynczych cząsteczek kolagenu przez metaloproteinazę macierzy. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustową analizę kinetyki enzymatycznej pod wpływem sił mechanicznych.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Przeglądaj więcej filmów