Multipleksowane pomiary proteolizy siły pojedynczej cząsteczki za pomocą pęsety magnetycznej

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie wpływu obciążenia mechanicznego na proteolityczne rozszczepienie pojedynczych białek w wysoce równoległy i opłacalny sposób. W tej demonstracji w pierwszym kroku bada się rozszczepienie kolagenu przez metaloproteinazę matrycową jeden, trymery do kolagenu są przymocowane do szklanego szkiełka nakrywkowego komórki przepływowej, a następnie dołącza się kulki magnetyczne o wielkości mikrometra do poszczególnych cząsteczek kolagenu. Drugim krokiem jest zamontowanie komory przepływowej w aparacie pęsety magnetycznej i sprawdzenie, czy niespecjalnie przymocowane kulki zostały usunięte z powierzchni szkiełka nakrywkowego.

Następnie proteaza jest dodawana do komórek przepływowych. Ostatnim krokiem jest określenie szybkości proteolizy poprzez monitorowanie odklejania się kulek w czasie rzeczywistym. Mierząc szybkość odrywania się koralików przy różnych stężeniach i siłach proteazy, możliwe jest wyprowadzenie standardowych zoologicznych parametrów kinetycznych przy użyciu niewielkich ilości substratu i proteazy.

Ponadto technika ta dostarcza unikalnych informacji na temat wpływu siły mechanicznej na szybkość proteolizy oraz na zmiany strukturalne w białku substratowym, które towarzyszą rozszczepieniu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak optyczne ślady T i mikroskopia sił atomowych, jest to, że technika ta jest wysoka przepustowość i opłacalna. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat efektywnej siły oddziałującej na proteolityczne rozszczepienie pojedynczych białek, oprzyrządowanie i techniki mogą być stosowane do szerokiego zakresu problemów biofizycznych, w tym wpływu siły na fałdowanie białek i potwierdzanie.

Przygotowanie komory przepływowej należy rozpocząć od oczyszczenia szkiełek nakrywkowych za pomocą sonikacji. Dodaj szkiełka nakrywkowe do małego szklanego pojemnika, który może je pomieścić, który mieści się w atorze. Napełnij pojemnik izopropanolem i sonikuj w kąpieli przez 20 minut izopropanol i spłucz szkiełka nakrywkowe dużą ilością wody dejonizowanej.

Napełnij pojemnik wodą i sonikuj przez 20 minut. Po wysuszeniu sonikacji pokrywa ślizga się w strumieniu przefiltrowanego, wolnego od pyłu powietrza. Sprawdź szkiełka nakrywkowe i używaj tylko tych, które są wolne od smug.

Delikatnie podpal szkiełka okładki przez kilka sekund, aby oczyścić je z pozostałego kurzu i wilgoci, przesuwając pokrywę. Prześlizguje się przez płomień gazowy wytwarzany przez palnik Bunsena, uważając, aby nie wypaczyć szkiełka nakrywkowego z powodu nadmiernego ciepła. Ten etap usuwa resztki zanieczyszczeń powierzchniowych.

Następnie użyj dwustronnej taśmy klejącej, aby połączyć ze sobą dwie szkiełka nakrywkowe. Najpierw przecinając taśmę na około trzy centymetry długości i 0,3 centymetra szerokości, przymocuj taśmę do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 na 40 milimetrów, pozostawiając kanał o wymiarach 1,6 centymetra pośrodku. Za pomocą końcówki pipety delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że taśma prawidłowo przylega

Pęseta magnetyczna została skonstruowana przez to laboratorium przy użyciu aluminiowego wspornika L z otworkiem o średnicy jednego milimetra i zamontowana na pionowym translatorze Z w celu modulacji wysokości pęsety. Dwa trwałe magnesy ziem rzadkich zostały przymocowane do wspornika po obu stronach otworu, aby utworzyć gradient pola magnetycznego. Właściwa kalibracja pułapki magnetycznej jest niezbędna do tej procedury.

Aby zapewnić sukces, używamy dwóch różnych metod, jak opisano w tej sekcji. Aby skalibrować pułapkę magnetyczną Do kalibracji należy użyć wcześniej przygotowanego DNA z faga Lambda, znakowanego na jego pięciu pierwszych i trzech pierwszych końcach biotyną i dtlenem, zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Aby najpierw przymocować DNA do komórki przepływowej, napełnij ją tlenem anty-D i roztworem przeciwciał i pozwól przeciwciału przylegać do powierzchni szkła przez 15 minut.

Następnie zjedz powierzchnię komórki przepływowej, aby zapobiec niespecyficznemu przywieraniu DNA, dodając roztwór BSA do komórki przepływowej. Należy pamiętać, że dla tego etapu i wszystkich kolejnych etapów objętość odczynnika dodawanego do kuwety przepływowej powinna być co najmniej dwukrotna. Objętość komory przepływowej, która w tej demonstracji wynosi 75 mikrolitrów, inkubuje się w komorze przepływowej w temperaturze pokojowej przez 45 minut.

Po powtórzeniu tego kroku dodaj 50 pikolomolowców funkcjonalizowanego DNA lambda i pozwól mu przyłączyć się do szkiełka nakrywkowego przez 15 minut, zmyj nadmiar DNA jednym XPBS. Na koniec dodaj super paramagnetyczne kulki pokryte streptawidyną i pozwól im przyczepić się do unieruchomionego DNA przez 15 minut. W tej demonstracji używane są koraliki o wielkości 2,8 mikrometra.

Zmyj nadmiar koralików jednym XPBS. Następnie wykonaj kalibrację pęsety magnetycznej, przesuwając magnesy trwałe do pozycji oddalonej od powierzchni próbki. Następnie umieść przygotowaną komórkę przepływową w mikroskopie.

Przesuń magnesy trwałe na miejsce nad komorą przepływową. Wybierz płaszczyznę ogniskową kulek funkcjonalizowanych Lambda DNA, skupiając się na kulkach z dala od obu powierzchni szkła. Prawidłowa płaszczyzna ogniskowa to taka, w której pożądane koraliki mają jasny środek.

Obejrzyj film przedstawiający ruch koralików, który jest większy o 80 Hz dla 500 klatek. Przesuń magnes bliżej powierzchni próbki i nagraj film przedstawiający ruch ściegu w każdej pozycji. W przypadku odległości większych niż pięć milimetrów przesuwaj się w krokach co jeden milimetr dla odległości od jednego do pięciu milimetrów.

Poruszaj się w krokach co 0,5 milimetra dla odległości mniejszych niż jeden milimetr, poruszaj się w krokach co 0,25 milimetra Dla każdego zestawu danych śledź środek ściegów za pomocą dopasowania Gaussa 2D. Obliczanie siły za pomocą fluktuacji Browna zgodnie z opisem w procedurze pisemnej. Potwierdź dokładność sił, sprawdzając obliczenia siły za pomocą widma mocy Pasowanie Lian.

Aby znaleźć częstotliwość staczania, zależność między przyłożoną siłą a częstotliwością staczania można znaleźć w tekście przed przyłączeniem peptydu kolagenowego do komórek przepływowych, ekspresji i oczyszczenia peptydu kolagenowego i białek MMP one. Rozpocznij od dodania roztworu przeciwciała anty mic do komórki przepływowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby umożliwić anty mic przyczepienie się do powierzchni komórki przepływowej, zjedz komórkę przepływową, aby zapobiec niespecyficznemu przyłączeniu białek przy użyciu pięciu miligramów na mililitr. BSA Dodać 150 peptydów kolagenu pikomolarnego i pozwolić mu przyłączyć się do przeciwciała za pomocą M ttag przez 45 minut.

Zmyj nadmiar kolagenu za pomocą buforu PBS przed dodaniem kulek o wielkości 2,8 mikrometra do komórki przepływowej. Należy je oddzielić od paciorkowca i powleczonego roztworu kulki za pomocą silnych magnesów, a następnie ponownie zawiesić w PBS. Proces ten należy powtórzyć trzy razy.

Ten krok jest niezbędny, aby kulki o wielkości 2,8 mikrometra związały się z unieruchomionym powierzchniowo peptydem kolagenowym. Następnie dodaj super paramagnetyczne kulki pokryte streptawidyną streptavid i pozwól im przyczepić się do cząsteczek kolagenu przez 45 minut. Po zmontowaniu komórki przepływowej z peptydem kolagenowym i kulkami magnetycznymi, zobrazuj komórkę przepływową w pułapce magnetycznej.

Pod wpływem małej siły subpopulacja koralików jest czasami słaba, przylega do powierzchni w niespecyficzny sposób. Zastosowanie niewielkiej siły zapewnia, że te koraliki zostaną uwolnione. Dodaj aktywowany enzym do komórki przepływowej.

W tym przypadku MMP one został wstępnie aktywowany przez dodanie 3,5 milimolowego PMA A i inkubowany w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Gdy tylko komórka przepływowa zostanie ponownie wprowadzona do pęsety magnetycznej, nagraj film obejmujący kilka pól widzenia, zwykle uzyskując kilkaset dołączonych koralików. Miara ta odpowiada czasowi równemu zero.

Powtórz ten sam proces rejestrowania kilku pól widzenia w regularnych punktach czasowych, aż wszystkie kulki oderwą się lub nie będzie można dostrzec dalszej proteolizy. Pęseta magnetyczna została skalibrowana na koraliki o wielkości jednego mikrometra i 2,8 mikrometra. Korzystając zarówno z wielkości obserwowanych fluktuacji Browna, jak i obliczenia częstotliwości staczania się przy różnych pozycjach magnesów w eksperymentach z wymuszoną proteolizą, znormalizowaną liczbę pozostałych kulek można wykreślić jako funkcję czasu, aby znaleźć szybkość proteolizy.

Proces ten można powtarzać dla różnych stężeń i sił enzymów. Szybkość proteolizy zależy od przyłożonej siły. Szybkość proteolizy określono na poziomie jednego niutona piko 6,2 niutona Pico i 13 niutonów Pico.

Frakcja koralików niepro leży dłużej niż 15 minut, pozostaje w przybliżeniu stała na poziomie 0,25 w różnych eksperymentach. W naszym przypadku test pozwolił nam zmierzyć sprawność katalityczną MMP one w funkcji przyłożonej siły. Analizując dane, stwierdziliśmy, że potrójna helisa kolagenu musi się miejscowo rozwinąć przed proteolizą.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Ważne jest, aby pamiętać, że aby uzyskać dobrą istotność statystyczną danych, wymagane jest co najmniej 30 do 50 koralików na paliwo widoku. Nie zapominaj, że PMA może być bardzo niebezpieczny, a środki ostrożności, takie jak rękawiczki, fartuchy laboratoryjne i maska na twarz, powinny być zawsze używane podczas wykonywania tego eksperymentu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć wpływ siły na proteolityczne rozszczepienie pojedynczych białek za pomocą pęsety magnetycznej. Pęseta magnetyczna jest doskonałym narzędziem do zrozumienia eksperymentów biofizycznych na pojedynczych cząsteczkach. Technikę tę można rozszerzyć na inne kombinacje proteaz i substratów.

Ponadto podobne techniki można wykorzystać do zrozumienia dynamiki strukturalnej białek, a także do zrozumienia innych białek, które wiążą lub modyfikują RNA i/lub DNA.