Charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych

Metody oparte na mikroskopii sił atomowych umożliwiają scharakteryzowanie procesów biomolekularnych w skali nano z rozdzielczością morfologiczną, chemiczną lub strukturalną, otwierając ostatecznie nowe okno obserwacyjne w biologii. Metody jednocząsteczkowe umożliwiają sondowanie wysoce heterogenicznych układów, co jest szczególnie istotne dla zrozumienia agregacji białek. Łącząc pojedyncze cząsteczki z podejściami wstecznymi, możemy uzyskać podstawowe informacje o zachowaniu białek, ich powiązaniach z chorobami ludzkimi i zaprojektować interwencje farmakologiczne, które mogą być skuteczne.

Co więcej, metoda ta może być z powodzeniem stosowana do badania właściwości chemicznych i strukturalnych biomateriałów do dostarczania leków, zastosowań i innych celów biotechnologicznych. Początkowo ustawienie prawidłowych parametrów AFM dla wysokiej rozdzielczości może być trudne, a konfiguracja AFM podczas pomiaru agregatów fibrylarnych jest łatwa. Na 30 minut przed obrazowaniem AFM włącz system AFM i kliknij przycisk Setup and probe (konfiguracja i sonda).

W oknie wymiany sondy kliknij przycisk dalej, aby przygotować stopień ostrości Z. Wyłącz przełącznik wiązki AFM, jeśli jest włączony, i odblokuj zamki na jaskółczy ogon. Odłącz głowicę od systemu i w oknie wymiany sondy kliknij dalej.

Zamontuj wspornik AFM na uchwycie sondy. Podłącz głowicę do systemu i zablokuj zamki na jaskółczy ogon. Włącz przełącznik wiązki laserowej AFM i w oknie wymiany sondy kliknij przycisk Dalej.

W wyskakującym oknie kliknij nie, jeśli typ wspornika nie uległ zmianie, i wyreguluj pokrętła wyrównania optycznego, aby znaleźć wspornik. Ustaw ostrość na wsporniku i kliknij przycisk Dalej. W wyskakującym oknie kliknij przycisk tak, jeśli fokus znajduje się na wsporniku.

Użyj pokręteł wykrywającej wiązki laserowej, aby ustawić wiązkę laserową na końcu wspornika. Użyj odchylonych pokręteł wiązki laserowej, aby zmaksymalizować całkowity sygnał mierzony przez czterokwadrantową fotodiodę do co najmniej więcej niż jednego wolta. W oknie wymiany sondy kliknij przycisk Dalej i zamknij.

Po odczekaniu 15 minut, aż wspornik osiągnie stabilność termiczną, w razie potrzeby ponownie wyreguluj położenie odchylonej wiązki laserowej na fotodiodzie wrażliwej na położenie. Kliknij NCM sweep, wybierz żądaną amplitudę oscylacji, kliknij użyj fazy i kliknij auto. Dostrój wspornik blisko maksimum jego pierwszego swobodnego rezonansu oscylacji do około 300 kiloherców dla wspornika o stałej sprężystości 40 niutonów na metr.

Umieścić próbkę w uchwycie na próbkę. Kliknij obszar skanowania i ustaw rozdzielczość w zakresie od 256 na 256 do 1024 na 1024 pikseli, a następnie ustaw rozmiar skanowania i liczbę pikseli. Ustaw szybkość skanowania na 0,3 do jednego herca dla obszaru skanowania od jednego po jednym do pięciu mikrometrów do kwadratu.

Ustaw ostrość widok optyczny na próbce i kliknij podejście, aby zbliżyć się do powierzchni próbki. Następnie kliknij przycisk podnieś 100 mikrometrów, aby podnieść końcówkę AFM o 100 mikrometrów nad powierzchnię próbki i kliknij przycisk rozszerz na obrazie optycznym próbki. Kliknij pasek etapu koncentracji uwagi, aby ustawić ostrość widoku na powierzchni próbki, a następnie użyj strzałek, aby poruszać się w obszarze interesującej nas próbki.

Kliknij podejście, aby zazębić się z powierzchnią, a następnie kliknij skanowanie linii, aby sprawdzić, czy końcówka dobrze podąża za powierzchnią. W razie potrzeby dostosuj nastawę. Następnie kliknij skanowanie, aby rozpocząć obrazowanie powierzchni próbki, utrzymując stały reżim przemiany fazowej nieprzekraczającej delta 20 podczas obrazowania, aby uniknąć dużej siły obrazowania i zachować spójność między niezależnymi próbkami.

W przypadku obrazowania nanospektroskopii w podczerwieni na 30 do 60 minut przed analizą włącz system AFM IR i laser IR. Otwórz wbudowane oprogramowanie do sterowania instrumentem i kliknij plik i nowy, aby otworzyć nowy nano IR file. Kliknij przycisk inicjalizuj, aby uruchomić system AFM IR i otworzyć pokrywę instrumentu.

Zamontuj sondę pokrytą złotem silikonowym o promieniu nominalnym 30 nanometrów i stałej sprężystości 0,2 niutona na metr w systemie AFM IR, aby zmierzyć próbkę w trybie kontaktowym. Kliknij przycisk Załaduj w sekcji sondy AFM, a następnie przycisk Załaduj przycisk. Użyj strzałek ostrości na sondzie, aby ustawić ostrość kamery na wsporniku i użyj końcówki do krzyża nitkowego, aby umieścić krzyż nitkowy na końcu wspornika.

Obróć pokrętła sterujące położeniem lasera wykrywającego, aby ustawić laser na końcu wspornika. Obróć pokrętła lasera, aby wykryć i zmaksymalizować sumę zmierzoną przez czterokwadrantową fotodiodę do wartości większej niż trzy wolty. Obróć pokrętło odchylenia, aby wyregulować ugięcie wspornika do minus jednego wolta, a następnie kliknij przycisk Dalej.

Następnie zamknij pokrywę instrumentu. Użyj strzałek ostrości na sondzie, aby ustawić ostrość kamery na próbce i wskazówek do strzałek krzyża nitkowego, aby poruszać się w obszarze zainteresowania próbki. Kliknij Dalej i zaangażuj się.

W okienku mikroskopu wybierz wysokość dla morfologii, amplitudę drugą dla absorpcji podczerwieni i częstotliwość PLL, aby odwzorować końcówkę do rezonansu kontaktowego próbki. W sekcji Skanowanie AFM ustaw parametry, jak pokazano dla obrazowania AFM i kliknij skanowanie, aby uzyskać mapę morfologii. Po zakończeniu mapowania morfologii w oknie mikroskopu kliknij mapę wysokości, aby umieścić sondę na szczycie jednego agregatu.

W sekcji nano IR kliknij start IR, aby oświetlić próbkę laserem IR. Aby ustawić ostrość lasera na podczerwień na wsporniku, kliknij optymalizuj i wprowadź 1655 centymetrów jako liczbę falową. Kliknij dodaj i zeskanuj, aby określić pozycję lasera IR, a następnie kliknij aktualizuj i ok, aby wyrównać jego położenie z wspornikiem.

W sekcji ogólnej wprowadź liczbę falową, dla której oczekiwana jest wysoka absorbancja w polu względnym i wyłącz opcję filtra pasmowoprzepustowego. Kliknij start IR, a następnie sprawdź odczyt miernika i FFT odpowiedzi wspornika. W oknie FFT przesuń zielony kursor, aby odczytać częstotliwość rezonansową wspornika.

Typowa wartość FFT rezonansu wsporników wynosi około 200 kiloherców. Wprowadź wygenerowaną wartość częstotliwości rezonansowej w sekcji ogólnej w polu centrum częstotliwości i użyj okna częstotliwości 50 kiloherców. Kliknij okno strojenia impulsu laserowego, aby wybrać tryb wzmocnionego rezonansu i ustawić częstotliwość impulsów 222 kiloherców, zakres strojenia 50 kiloherców i cykl pracy lasera 5%Kliknij nabyć, aby przesunąć tętno lasera.

Użyj kursora, aby dostroić impuls laserowy do częstotliwości reakcji mechanicznej rozszerzalności cieplnej próbki pochłaniającej światło podczerwone. Następnie wybierz pętlę sprzężenia fazowego, aby monitorować rezonans kontaktowy między próbką a końcówką i kliknij zero. W przypadku innych właściwości chemicznych w skali nano należy śledzić rezonans kontaktowy podczas akwizycji widm, aby upewnić się, że przegrzanie i zmiękczenie nie ma wpływu na widmo próbki.

Wybierz opcję włącz, aby śledzić rezonans kontaktowy próbki do końcówki i wybierz wzmocnienie całkowe 0,5 i wzmocnienie proporcjonalne 10, a następnie kliknij OK.In oknie optymalizacji, kliknij długość fali i zeskanuj, aby zlokalizować laser IR dla co najmniej trzech liczb falowych odpowiadających głównym pasmom absorbancji próbki i dla co najmniej jednej liczby falowej dla każdego chipa lasera. Kliknij narzędzia, kalibrację tła IR i nowy, a następnie ustaw liczby falowe w zakresie od 1200 do 1800 centymetrów. Ustaw tła na średnią na jeden, cykl pracy 5%, a prędkość zamiatania na 100 centymetrów do kwadratu.

Kliknij przycisk acquire, aby zmierzyć tło lasera IR w celu normalizacji zmierzonych widm zlokalizowanych w skali nano, zapisz plik i zamknij okno. W ustawieniach widm podczerwieni wybierz rozdzielczość widma IR od jednego do czterech centymetrów i liczbę współśrednich co najmniej 64 razy. Następnie kliknij przycisk acquire, aby zmierzyć zlokalizowane widmo podczerwieni w skali nano w zakresie białek.

Aby uzyskać mapę chemiczną w rozdzielczości nano, wybierz 1655 centymetrów i obrazowanie w podczerwieni, a następnie kliknij skanuj w oknie skanowania AFM. Po zakończeniu mapowania zapisz pomiary. Następnie użyj wbudowanego oprogramowania do przetwarzania obrazu AFM, aby przeanalizować uzyskane mapy morfologii, rezonansu kontaktowego i chemii oraz zlokalizowane widma w skali nano.

Jest to krytyczny krok w celu uzyskania wysoce czystego roztworu monomerycznego, ponieważ obecność zagregowanych gatunków może skutkować słabą odtwarzalnością kinetyki i wprowadzić artefakty do pomiarów. Podstawowym czynnikiem skutecznego badania próbek biologicznych o dużej niejednorodności jest prawidłowe położenie substratów stałych. Osadzanie w sprayu mikroprzepływowym może być stosowane zamiast ręcznego w celu zachowania architektury i niejednorodności próbki.

Metody te torują drogę do odkrycia struktury chemicznej i właściwości poszczególnych biomolekuł oraz ich interakcji w fizjologicznym i natywnym środowisku ciekłym.