Name: Charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Poznaj nanospektroskopię w podczerwieni i mikroskopię sił atomowych do badania agregacji białek związanej z chorobami neurodegeneracyjnymi. Te metody umożliwiają wizualizację samoorganizacji białek na poziomie pojedynczych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (SNF) za wsparcie finansowe (grant numer P2ELP2_162116 i P300P2_171219), Darwin College, programowi Erasmus+ za wsparcie finansowe (numer grantu 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) oraz badaniom prowadzącym do tych wyników, które otrzymały finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) za pośrednictwem grantu ERC PhysProt (numer umowy) 337969), Newman Foundation (T.P.J.K.) oraz Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. i T.P.J.K.).

1. Testy agregacyjne na czytnikach płytek fluorescencyjnych
UWAGA: Opisany tutaj protokół jest przykładem jak badać agregację dowolnego białka lub peptydu za pomocą kinetyki chemicznej. W szczególności opisano zoptymalizowany protokół badania agregacji peptydu Aβ42, który bierze udział w wystąpieniu i progresji choroby Alzheimera58,59. Podobny protokół można dostosować i przyjąć do badania agregacji dowolnego białka lub peptydu.
<ol>
	<li>Otrzymać wysoce czysty roztwór monomeryczny Aβ42 za pomocą technik chromatografii jonowymiennej i chromatografii wykluczającej wielkość w celu rozróżnienia frakcji białkowych zawierających Aβ42 i wyizolowania frakcji monomerycznej od innych zagregowanych form Aβ42 otrzymano58,59.</li>
	<li>Rozcieńczyć peptyd Aβ42 w 20 mM buforze fosforanu sodu, 200 μM EDTA przy pH 8,058 do pożądanego stężenia końcowego w zakresie 1−5 μM, w 1,5 ml probówek o niskim stopniu wiązania. Próbki pobrane do pomiarów AFM nie powinny zawierać barwnika fluorescencyjnego stosowanego w teście agregacji (tioflawina T, ThT), ponieważ może on wprowadzać artefakty podczas osadzania próbki do analizy AFM. W ten sposób należy przygotować trzy egzemplarze dwóch identycznych roztworów: i) pierwszy zawierający monomeryczny Aβ42, aby śledzić proces agregacji przez AFM; ii) drugi zawierający monomeryczny Aβ42 z dodatkiem 20 μM ThT jako znacznik do monitorowania kinetyki agregacji. 
	UWAGA: Ważne jest, aby wykonać kroki 1.1 i 1.2 na lodzie. Procedura ta ma na celu zapewnienie, że monomeryczny roztwór Aβ42 nie agreguje się, dopóki nie zostanie zainicjowany w czytniku płytek. Podczas obchodzenia się z próbkami konieczne jest staranne pipetowanie, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, które mogą mieć wpływ na próbkę białka.</li>
	<li>Pobrać pipetą 80 μl każdej próbki do każdej studzienki z 96-dołkowej, półpowierzchniowej płytki z czarnego polistyrenu z przezroczystym dnem i niewiążącymi powierzchniami.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę folią, aby zminimalizować parowanie próbki w trakcie agregacji.</li>
	<li>Wyrównać temperaturę czytnika płytek do 37 °C.</li>
	<li>Skonfiguruj protokół agregacji, aby odczytywać pomiary fluorescencji w stałych odstępach czasu, przy długości fali wzbudzenia 440 nm i długości fali emisji 480 nm. Agregacja powinna być inicjowana w warunkach spoczynku.</li>
	<li>Włóż płytkę do czytnika płytek. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas obchodzenia się z płytką, aby upewnić się, że agregacja nie zostanie uruchomiona przed uruchomieniem czytnika płytek. Użyj ustawień regulacji wzmocnienia, aby zapewnić optymalny odczyt fluorescencji każdej próbki.</li>
	<li>Rozpocznij pomiar. 
	UWAGA: Eksperyment agregacji jest zakończony, gdy krzywa sigmoidalna fluorescencji ThT osiągnie plateau58.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki do pomiarów AFM i nano-IR
<ol>
	<li>Przyklej najwyższej jakości krążek miki klasy V1 do wysokiej jakości magnetycznego dysku ze stali nierdzewnej za pomocą zakładek samoprzylepnych lub taśmy dwustronnej.</li>
	<li>Wytrawiaj mikę, umieszczając kawałek taśmy klejącej na powierzchni miki i ściągając wierzchnią warstwę miki. Ta procedura pozwoli uzyskać czystą, atomowo płaską powierzchnię, odpowiednią do osadzania próbki. 
	UWAGA: Wytrawiona powierzchnia musi być jednolita i gładka. 
	UWAGA: Nie dotykaj ani nie oddychaj bezpośrednio nad świeżo wytrawioną miką, ponieważ spowoduje to wprowadzenie artefaktów.</li>
	<li>Wstrzymaj/zatrzymaj pomiar czytnika płytek, aby zebrać punkt zainteresowania w czasie podczas procesu agregacji białka.</li>
	<li>Usunąć folię uszczelniającą i zebrać 10 μl porcji próbek bez ThT ze studzienki do probówek o niskim stopniu wiązania o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Umieścić 10 μl próbki na świeżo wytrawionej mice. W przypadku pomiarów AFM-IR próbki należy umieścić na świeżo usuniętym złotym podłożu.</li>
	<li>Inkubować roztwór na mice przez 1 minutę, aby umożliwić fizsorbcję. 
	UWAGA: Dłuższy czas inkubacji pozwoliłby na lepsze wchłanianie na powierzchni, ale może wywołać sztuczną samoorganizację i samoorganizację25. Aby uniknąć tych efektów, można zastosować osadzanie w sprayu25.</li>
	<li>Spłucz trzykrotnie 1 ml ultraczystej wody.</li>
	<li>Wysuszyć pod delikatnym strumieniem azotu, aby zmierzyć próbkę w środowisku powietrznym.</li>
</ol>
3. Obrazowanie AFM morfologii agregatów białkowych
UWAGA: Pomiary morfologii mogą być wykonywane zarówno w trybie kontaktowym, jak i dynamicznym, w poniższych krokach opisano ten drugi, ponieważ zmniejsza siły boczne, aby zmierzyć morfologię 3D próbki z wysoką rozdzielczością. Pomiary AFM-IR będą wykonywane w trybie kontaktowym w celu poprawy stosunku sygnału do szumu AFM-IR.
<ol>
	<li>Włącz system AFM co najmniej 30 minut przed pomiarami, aby system osiągnął stabilność termiczną. Kliknij Konfiguracja, a następnie Sonda. W oknie Zmiana sondy kliknij Dalej, aby przygotować Z, Focus Stage.</li>
	<li>Wyłącz przełącznik wiązki AFM (jeśli jest włączony). Odblokuj zamki na jaskółczy ogon, odłącz głowicę od systemu i w oknie Wymiana sondy kliknij Dalej.</li>
	<li>Zamontuj wspornik AFM na uchwycie sondy. Podłącz głowicę do systemu i zablokuj zamki na jaskółczy ogon. 
	UWAGA: Optymalne wsporniki do badania próbek biologicznych w trybie dynamicznym AFM mają stałą sprężystości w zakresie od 2−40 N m-1 do promienia wierzchołka w zakresie 2−8 nm14.</li>
	<li>Włącz przełącznik wiązki laserowej AFM i w oknie Zmiana sondy kliknij Dalej.</li>
	<li>W wyskakującym okienku kliknij Nie, jeśli typ wspornika się nie zmienił. Wyreguluj pokrętła wyrównania optycznego, aby znaleźć wspornik. Dostosuj ostrość do wspornika i kliknij Dalej.</li>
	<li>W wyskakującym okienku kliknij Tak, jeśli fokus znajduje się na wsporniku.</li>
	<li>Ustaw wiązkę laserową na końcu wspornika za pomocą pokręteł kontrolujących położenie lasera detekcyjnego. Zmaksymalizuj całkowity sygnał mierzony przez fotodiodę czterokwadrantową do co najmniej >1 V za pomocą pokręteł kontrolujących położenie odchylonej wiązki laserowej na fotodiodzie czułej na położenie (PSPD). W oknie Zmiana sondy kliknij Dalej, a następnie Zamknij.</li>
	<li>Odczekaj 15 minut, aż wspornik osiągnie stabilność termiczną. W razie potrzeby wyreguluj położenie odchylonej wiązki laserowej na PSPD.</li>
	<li>Kliknij NCM SWEEP, wybierz żądaną amplitudę oscylacji, kliknij Użyj fazy, kliknij auto i dostrój wspornik blisko maksimum jego pierwszego swobodnego rezonansu oscylacji, który wynosi około 300 kHz dla wspornika o stałej sprężystości 40 N m-1. 
	UWAGA: Dostrojenie wspornika do maksimum jego swobodnego rezonansu zapewnia większą stabilność pomiarów14.</li>
	<li>Umieścić próbkę w uchwycie na próbkę. Dobierz odpowiednie parametry obrazowania. Typowa częstotliwość skanowania wynosi 0,3–1,0 Hz dla obszaru skanowania od 1 x 1 μm2 do 5 x 5 μm2. Typowa wymagana rozdzielczość wynosi od 256 x 256 do 1024 x 1024 pikseli. Kliknij Obszar skanowania, aby wybrać rozmiar skanowania i liczbę pikseli.</li>
	<li>Ustaw ostrość widok optyczny na próbce. Kliknij Podejście, aby zbliżyć się do powierzchni próbki. Po zakończeniu podejścia kliknij Lift 100 μm, aby podnieść końcówkę AFM 100 μm ponad powierzchnię próbki. Kliknij przycisk Expand (Rozwiń) na obrazie optycznym próbki. Kliknij pasek Focus Stage (Etap ostrości), aby ustawić ostrość widoku na powierzchni próbki.</li>
	<li>Użyj strzałek, aby poruszać się w regionie interesującej Cię próbki. Zaangażuj powierzchnię, naciskając przycisk Podejdź. Kliknij przycisk Line Scan i sprawdź, czy końcówka dobrze podąża za powierzchnią, w razie potrzeby dostosuj nastawę.</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie powierzchni próbki, naciskając przycisk Skanuj. Podczas obrazowania, aby uniknąć dużej siły obrazowania i zachować spójność w niezależnych próbkach, utrzymuj stały reżim przemiany fazowej nieprzekraczający Δ20°42.</li>
	<li>Wprowadź nazwę pliku i wybierz katalog bazowy, w którym zostanie zapisany pozyskany obraz.</li>
</ol>
4. Pomiary nanospektroskopii w podczerwieni agregatów białkowych
<ol>
	<li>Włącz system AFM-IR i laser na podczerwień (IR)60 30−60 min przed pomiarami stabilizacji termicznej. Typowymi laserami dla instrumentów AFM-IR są optyczne oscylatory parametrów (OPO) i kwantowe lasery kaskadowe (QCL).</li>
	<li>Otwórz wbudowane oprogramowanie, aby sterować instrumentem. Kliknij plik, a następnie nowy, aby otworzyć nowy plik nanoIR. Naciśnij przycisk inicjalizacji, aby uruchomić system AFM-IR.</li>
	<li>Otwórz pokrywę przyrządu i zamontuj w systemie AFM-IR sondę pokrytą złotem krzemowym o promieniu nominalnym 30 nm i stałej sprężystości 0,2 N/m, aby zmierzyć próbkę w trybie kontaktowym.</li>
	<li>Kliknij Load w sekcji Sonda AFM, a następnie dalej. W sekcji ostrości na sondzie kliknij strzałki, aby ustawić ostrość kamery na wsporniku. W przykładowym ruchu XY w przekroju użyj strzałek, aby umieścić powietrze poprzeczne na końcu wspornika.</li>
	<li>Obróć pokrętła sterujące położeniem lasera wykrywającego, aby ustawić laser na końcu wspornika. Obróć pokrętła laserowe, aby wykryć i zmaksymalizować sumę zmierzoną przez czterokwadrantową fotodiodę do wartości >3 V. Obróć pokrętło odchylenia, aby wyregulować ugięcie wspornika na -1 V, a następnie kliknij dalej. Zamknij pokrywę instrumentu.</li>
	<li>W sekcji Ustawianie ostrości na próbce użyj strzałek, aby ustawić ostrość kamery na próbce. Następnie, w sekcji ruchu XY próbki, użyj strzałek, aby przesunąć się w obszarze zainteresowania próbki i kliknij na podejście i włącz się.</li>
	<li>W oknie mikroskopu wybierz jako dane wejściowe interesujące nas kanały, aby odwzorować właściwości biofizyczne próbki. W szczególności wybierz wysokość dla morfologii, amplitudę 2 dla absorpcji podczerwieni i częstotliwość PLL, aby odwzorować rezonans kontaktowy końcówka-próbka.</li>
	<li>W sekcji Skanowanie AFM w oknie kontrolnym użyj podobnych parametrów jak w sekcji 3 (tj. szybkość skanowania 0,1−1,0 Hz, od 256 x 256 do 1024 x 1024 pikseli). Jako wartość wzmocnień należy wybrać w zależności od chropowatości próbki: całkę I = 1−10 i proporcjonalną P = 10−30. Następnie kliknij skanowanie, aby uzyskać mapę morfologii. 
	UWAGA: Morfologia może być podobnie mierzona w trybie dynamicznego stukania, ale pomiary AFM-IR są tutaj wykonywane w trybie kontaktowym, aby uzyskać wyższy stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Po zakończeniu mapowania morfologii, w oknie mikroskopu kliknij mapę wysokości, aby umieścić sondę na szczycie jednego agregatu. Następnie w sekcji nanoIR w oknie sterowania kliknij uruchom IR, aby oświetlić próbkę laserem IR.</li>
	<li>Aby ustawić ostrość lasera na podczerwień na wsporniku, kliknij optymalizację. W tym oknie wpisz liczbę falową, w której próbka będzie miała wysoką absorbancję i kliknij przycisk dodaj. W przypadku białka typowa wartość to 1655 cm-1. Kliknij skanowanie, aby znaleźć pozycję lasera IR i kliknij aktualizację, aby wyrównać jego położenie z wspornikiem. Zamknij okno.</li>
	<li>W sekcji ogólnej ustawienia nanoIR wpisz liczbę falową, w której spodziewana jest wysoka absorbancja w polu względnym. Następnie wyłącz opcję Band Pass Filter i spójrz na odczyt licznika oraz na szybką transformację Fouriera (FFT) odpowiedzi wspornikowej. W oknie FFT przesuń zielony kursor, aby odczytać częstotliwość rezonansową wspornika. Typowa wartość FFT rezonansu wsporników wynosi około 300 kHz. Zapisz tę wartość częstotliwości rezonansowej w sekcji ogólnej w środkowym polu częstotliwości i użyj okna częstotliwości 50 kHz. 
	UWAGA: Wybierz moc lasera, która jest wystarczająco niska, aby nie nasycić odczytu miernika i nie spowodować zniekształceń w odpowiedzi wspornika oraz nie przegrzać próbki.</li>
	<li>Kliknij okno dostrajania impulsu laserowego, aby skorzystać z trybu wzmocnionego rezonansu. Wybierz centrum częstotliwości 300 kHz, zakres strojenia 50 kHz i cykl pracy lasera 5%. Kliknij na nabycie, aby przesunąć tętno lasera. Za pomocą kursora na wykresie dostosuj impuls laserowy do częstotliwości reakcji mechanicznej rozszerzalności cieplnej próbki pochłaniającej światło podczerwone. Następnie wybierz opcję PLL, aby monitorować rezonans kontaktowy między próbką a końcówką. Naciśnij przycisk zerowania w oknie PLL i zaznacz opcję włącz, aby śledzić rezonans kontaktowy końcówki próbki. Wybierz wzmocnienie całkowe I = 0,5 i wzmocnienie proporcjonalne P = 10. Zamknij okno.</li>
	<li>Otwórz ponownie okno optymalizacyjne i znajdź pozycję lasera IR dla co najmniej 3 liczb falowych odpowiadających głównym pasmom absorbancji próbki (pasmo amidowe I-II-III) i dla co najmniej jednej liczby falowej dla każdego chipa lasera.</li>
	<li>Kliknij Narzędzia | Kalibracja tła IR | Nowy. W oknie wybierz interesujący nas obszar spektroskopowy (1800−1200 cm-1 do badania próbek białek); wybierz tę samą częstość impulsów, jak określono w kroku 4.12 i cykl pracy 5%; Kliknij na Szybka akwizycja i wybierz prędkość lasera, typowy zakres dla kwantowego lasera kaskadowego wynosi od 20−500 cm-1. Kliknij pobierz, aby zmierzyć tło lasera IR. To widmo tła zostanie wykorzystane do normalizacji mierzonych widm zlokalizowanych w nanoskali. Zamknij okno. 
	UWAGA: Jeśli szybki tryb laserowy i wzmocniony rezonans nie jest dostępny, pomiń krok 4.12 i wybierz widma schodkowe zamiast szybkich zarówno w oknie akwizycji widm tła, jak i podczerwieni. Nie zostanie jednak osiągnięta czułość pojedynczego agregatu.</li>
	<li>W ustawieniach widm IR wybierz rozdzielczość widma IR między 1−4 cm-1 a liczbą współśrednich co najmniej 64x. Kliknij na acquire, aby zmierzyć zlokalizowane widmo IR w nanoskali w zakresie białek (1800−1200 cm-1).</li>
	<li>Aby uzyskać mapę chemiczną w rozdzielczości nanoskali, wybierz opcję obrazowania w podczerwieni, wybierz liczbę falową będącą przedmiotem zainteresowania (np. 1655 cm-1 dla pasma amidowego I) i kliknij skanuj w oknie skanowania AFM.</li>
	<li>Po zakończeniu mapowania przejdź do pliku i zapisz pomiary. Do analizy uzyskanych map morfologii, rezonansu kontaktowego i chemii, a także widm zlokalizowanych w nanoskali, należy skorzystać z wbudowanego oprogramowania do przetwarzania obrazów AFM. Widma i obrazy można zapisać jako pliki .csv lub .axz w celu dalszej szczegółowej analizy za pomocą komercyjnego oprogramowania.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie obrazów i analiza wymiarów przekroju poprzecznego
<ol>
	<li>Spłaszcz surowe obrazy14,17,19,41,42,59 przy użyciu wbudowanego oprogramowania do przetwarzania obrazów AFM lub oprogramowania komercyjnego. 
	UWAGA: Agregaty powinny być zamaskowane w obliczeniach, aby uniknąć artefaktów analizy i niedoszacowania ich zmierzonej wysokości.</li>
	<li>Spłaszcz obraz o 0 kolejności dopasowania płaszczyzny odejmowania.</li>
	<li>Spłaszcz obraz według płaszczyzny, a następnie linia po linii w 1. kolejności regresji, drugi krok jest powtarzany, aż zostanie osiągnięta płaska linia bazowa w profilu liniowym obrazu.</li>
	<li>Jeśli próbka jest bardzo zatłoczona, zawiera wyjątkowo wysokie agregaty lub występuje artefakt łuku skanera, spłaszcz obraz, używając dopasowania 2. kolejności regresji.</li>
	<li>Zmierz wysokość i szerokość agregatu od profilu linii prostopadłego do osi włókien14,17,19,41,42,59.</li>
	<li>Zmierz długość włókienka równolegle do osi włókienka14,17,19,41,42,59.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pierwszym krytycznym krokiem w tym protokole jest przygotowanie białek monomerycznych, takich jak w przypadku roztworu Aβ42 opisanego w krokach 1.1 i 1.2. Konieczne jest rozpoczęcie procesu agregacji od wysoce czystego, monomerycznego roztworu, ponieważ obecność gatunków oligomerycznych lub zagregowanych może skutkować słabą odtwarzalnością kinetyki agregacji58 i indukować artefakty w pomiarach AFM (np. gatunki fibrylarne będą widoczne na początkowych etapach agregacji), co może prowadzić do błędn...

Ponad 40 milionów ludzi na całym świecie cierpi obecnie na choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera (AD)1 i Parkinsona (PD)2. Mówiąc bardziej ogólnie, ponad pięćdziesiąt patologii jest związanych na poziomie molekularnym z nieprawidłowym fałdowaniem i agregacją białek, procesem, który prowadzi do proliferacji nierozpuszczalnych agregatów białek fibrylarnych, znanych jako złogi amyloidu3,4. Molekularne pochodzenie neurodegeneracji i jej powiązania ze zmianami konformacyjnymi białek prowadzącymi do powstawania amyloidu pozostają jednak niejasne, w dużej mierze ze względu na wysoki poziom heterogeniczności, przejściowy charakter i nanoskalowe wymiary patologicznych agregatów4,5.
Wysoce udane badania struktur białkowych w ciągu ostatnich kilku dekad opierały się głównie na użyciu masowych metod, w tym krystalografii rentgenowskiej, mikroskopii krioelektronowej i spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego5,6,7,8,9. W tej klasie technik spektroskopia w podczerwieni (IR) stała się czułym narzędziem analitycznym do odkrywania właściwości chemicznych układów biologicznych, takich jak białka8. Metody IR pozwalają na ilościowe określenie drugorzędowych i czwartorzędowych zmian strukturalnych białek podczas ich nieprawidłowego fałdowania i agregacji. Ponadto, w celu dalszego rozszyfrowania na poziomie mikroskopowym szczegółów mechanistycznych związanych ze złożonymi krajobrazami swobodnej energii białek podczas ich agregacji, dużym postępem było opracowanie narzędzi kinetyki chemicznej, które rozszerzają się na złożone szlaki samoorganizacji, w tym tworzenie włókienek amyloidowych5,6,7,10,11,12. Jednak metody spektroskopowe dostarczają jedynie uśrednionych informacji na temat niejednorodnego zespołu gatunków obecnych w roztworze lub biorących udział w określonych krokach mikroskopowych, co sprawia, że badanie właściwości biofizycznych poszczególnych zagregowanych gatunków stanowi wyzwanie na poziomie nanoskali13,14.
W ostatnich dziesięcioleciach pojawiło się kilka technik mikroskopowych z możliwością operowania na skalach mniejszych niż limit dyfrakcji światła. Ta klasa metod obejmuje mikroskopię elektronową (EM) i mikroskopię sił atomowych (AFM). Podczas gdy skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) dostarczają dwuwymiarowych (2D) obrazów próbki, AFM pojawiła się w ostatnich dziesięcioleciach jako potężna i wszechstronna technika badania trójwymiarowych (3D) morfologii, a także nanomechanicznych właściwości próbki o rozdzielczości subnanometrowej13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Uzasadnieniem badania agregacji białek za pomocą AFM jest to, że podejście to umożliwia badanie morfologii poszczególnych gatunków obecnych w solution13,14,16,17,19,20,21,25,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37. W szczególności, monitorując próbkę w funkcji czasu, AFM umożliwia badanie ewolucji morfologii gatunku w próbce, co umożliwia śledzenie i wizualizację ścieżek powstawania amyloidu23,25,38,39,40,41,42. Ponadto AFM umożliwia ilościowe określenie parametrów strukturalnych, takich jak wysokości i długości przekrojów poprzecznych poszczególnych gatunków występujących w solution13,19,30,31,32,33,34,35, 36,37,40,43,44,45,46,47,48. Jednak badanie pojedynczej właściwości biofizycznej, takiej jak morfologia, często nie wystarcza w przypadku badania heterogenicznych i złożonych systemów biologicznych. Same metody obrazowania AFM, SEM lub TEM nie ujawniają łatwo właściwości chemicznych heterogenicznych gatunków agregatów amyloidowych w nanoskali.
Ostatnio dokonano znacznego postępu w analizie heterogenicznych próbek biologicznych w tej skali, dzięki opracowaniu i zastosowaniu w dziedzinie agregacji białek w nanospektroskopii w podczerwieni (AFM-IR)24,26,38,42,49,50,51,52. Ta innowacyjna metoda wykorzystuje połączenie rozdzielczości przestrzennej AFM (~1−10 nm) z mocą analizy chemicznej IR. Technika AFM-IR opiera się na pomiarze efektu rezonansu indukowanego fototermicznie napędzanego laserem IR oraz na pomiarze rozszerzalności cieplnej badanej próbki za pomocą końcówki AFM. Próbka może być oświetlona laserem IR bezpośrednio od góry lub od dołu w całkowitym odbiciu wewnętrznym, podobnie jak w konwencjonalnej spektroskopii w podczerwieni24,42,52,53. Laser IR może być impulsowany z typowymi częstotliwościami rzędu setek kiloherców (1−1000 kHz) i dostrojony w szerokim zakresie spektralnym, zwykle w zakresie 1000−3300 cm-1. Chociaż źródło lasera obejmuje obszar o średnicy ~30 μm, rozdzielczość przestrzenna techniki AFM-IR jest określana nominalnie przez średnicę końcówki AFM, która wykrywa lokalną rozszerzalność cieplną systemu. AFM-IR doskonale nadaje się do badania próbek biologicznych, ponieważ sygnał IR jest proporcjonalny do ich grubości do 1−1,5 μm, a wynikowe widma IR są na ogół zgodne z odpowiednimi widmami transmisji FTIR13,54,55. Z tego powodu można łatwo zastosować sprawdzone metody analizy w spektroskopii, takie jak badanie przesunięć chemicznych, zmiany kształtu pasma i dekonwolucji za pomocą analizy drugiej pochodnej52. Ogólnie rzecz biorąc, łącząc rozdzielczość przestrzenną AFM z możliwościami rozpoznawania chemicznego spektroskopii w podczerwieni, AFM-IR umożliwia jednoczesne uzyskanie szerokiego zakresu właściwości morfologicznych, mechanicznych i chemicznych próbki w nanoskali.
Tutaj ilustrujemy protokół charakteryzujący proces agregacji białek, który wykorzystuje połączenie testów fluorescencyjnych in vitro, obrazowania AFM o wysokiej rozdzielczości i AFM-IR w nanoskali. To połączone podejście przyniosło już doskonałe wyniki w badaniu właściwości chemicznych i strukturalnych pojedynczych mikrokropel tworzonych przez agregaty białkowe, w badaniu separacji faz białkowych ciecz-ciecz oraz w badaniu niejednorodności i właściwości biofizycznych poszczególnych zagregowanych gatunków w nanoskali23,26,38,45,50,53,56,57.

<table><tbody><tr><td>System AFM-IR</td><td>Anasys Instruments</td><td>nanoIR 2 lub 3</td><td>Systemy do pomiaru rozszerzalności cieplnej w trybie kontaktowym i rezonansowym</td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowy polistyren o połowie powierzchni/przezroczysty polistyren NBS Microplate Corning</td><td></td><td>3881</td><td></td></tr><tr><td>Corning Microplate Aluminiowa taśma uszczelniająca</td><td>Corning</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronne krążki samoprzylepne</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGG3347N</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>415-101</td><td>Czytnik płytek</td></tr><tr><td>Mica Disc 10mm V1</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGF7013</td><td></td></tr><tr><td>Park NX10 System AFM</td><td>Park Systems</td><td>N/A</td><td>Mikroskop sił atomowych</td></tr><tr><td>Platypus Ultra-Flat Gold Chips</td><td>Platypus Technologies</td><td>AU.1000.SWTSG</td><td></td></tr><tr><td>PPP-NCHR-10 wsporniki</td><td>Park Systems</td><td>PPP-NCHR-10</td><td></td></tr><tr><td>Probówki białkowe LowBind, 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>Wsporniki pokryte złotem</td><td>silikonowym Anasys Instruments</td><td>PR-EX-nIR2</td><td></td></tr><tr><td>SPM Krążki do próbek 12mm</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGF7001</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Zjawisko nieprawidłowego fałdowania i agregacji białek powoduje powstawanie wysoce heterogenicznych agregatów białkowych, które są związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroby Alzheimera i Parkinsona. W szczególności wykazano, że agregaty o niskiej masie cząsteczkowej, oligomery amyloidowe, mają ogólne właściwości cytotoksyczne i są zaangażowane jako neurotoksyny w wielu formach demencji. Ilustrujemy zastosowanie metod opartych na mikroskopii sił atomowych (AFM) w celu sprostania trudnemu zadaniu, jakim jest scharakteryzowanie morfologicznych, strukturalnych i chemicznych właściwości tych agregatów, które są trudne do zbadania przy użyciu konwencjonalnych metod strukturalnych lub masowych metod biofizycznych ze względu na ich niejednorodność i przejściowy charakter. Mikroskopia skaningowa jest obecnie w stanie badać morfologię agregatów amyloidowych z rozdzielczością poniżej nanometrów. Pokazujemy tutaj, że nanospektroskopia w podczerwieni (IR) (AFM-IR), która jednocześnie wykorzystuje wysoką rozdzielczość AFM i moc rozpoznawania chemicznego spektroskopii IR, może pójść dalej i umożliwić scharakteryzowanie właściwości strukturalnych poszczególnych agregatów białkowych, a tym samym dać wgląd w mechanizmy agregacji. Ponieważ opisywane przez nas podejście może być również zastosowane do badań interakcji zespołów białkowych z małymi cząsteczkami i przeciwciałami, może ono dostarczyć podstawowych informacji do opracowania nowych związków terapeutycznych do diagnozowania lub leczenia chorób neurodegeneracyjnych.

Reprezentatywny przebieg czasowy agregacji Aβ42, zmierzony za pomocą analizy fluorescencji ThT, przedstawiono na Rysunku 1. Proces agregacji jest zazwyczaj charakteryzowany przez krzywą sigmoidalną, w której początkowo obserwuje się fazę lag, po której następuje gwałtowna faza wzrostu, aż do momentu osiągnięcia przez krzywą plateau w stanie równowagi stacjonarnej6,7,58. Niezbędne jest zapewnienie za...

Opisujemy zastosowanie nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji procesu samoorganizacji białek w agregaty oligomeryczne i fibryle amyloidowe, co jest ściśle związane z powstawaniem i rozwojem szerokiego zakresu ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Metody oparte na mikroskopii sił atomowych umożliwiają scharakteryzowanie procesów biomolekularnych w skali nano z rozdzielczością morfologiczną, chemiczną lub strukturalną, otwierając ostatecznie nowe okno obserwacyjne w biologii. Metody jednocząsteczkowe umożliwiają sondowanie wysoce heterogenicznych układów, co jest szczególnie istotne dla zrozumienia agregacji białek. Łącząc pojedyncze cząsteczki z podejściami wstecznymi, możemy uzyskać podstawowe informacje o zachowaniu białek, ich powiązaniach z chorobami ludzkimi i zaprojektować interwencje farmakologiczne, które mogą być skuteczne.Co więcej, metoda ta może być z powodzeniem stosowana do badania właściwości chemicznych i strukturalnych biomateriałów do dostarczania leków, zastosowań i innych celów biotechnologicznych. Początkowo ustawienie prawidłowych parametrów AFM dla wysokiej rozdzielczości może być trudne, a konfiguracja AFM podczas pomiaru agregatów fibrylarnych jest łatwa. Na 30 minut przed obrazowaniem AFM włącz system AFM i kliknij przycisk Setup and probe (konfiguracja i sonda).W oknie wymiany sondy kliknij przycisk dalej, aby przygotować stopień ostrości Z. Wyłącz przełącznik wiązki AFM, jeśli jest włączony, i odblokuj zamki na jaskółczy ogon. Odłącz głowicę od systemu i w oknie wymiany sondy kliknij dalej.Zamontuj wspornik AFM na uchwycie sondy. Podłącz głowicę do systemu i zablokuj zamki na jaskółczy ogon. Włącz przełącznik wiązki laserowej AFM i w oknie wymiany sondy kliknij przycisk Dalej.W wyskakującym oknie kliknij nie, jeśli typ wspornika nie uległ zmianie, i wyreguluj pokrętła wyrównania optycznego, aby znaleźć wspornik. Ustaw ostrość na wsporniku i kliknij przycisk Dalej. W wyskakującym oknie kliknij przycisk tak, jeśli fokus znajduje się na wsporniku.Użyj pokręteł wykrywającej wiązki laserowej, aby ustawić wiązkę laserową na końcu wspornika. Użyj odchylonych pokręteł wiązki laserowej, aby zmaksymalizować całkowity sygnał mierzony przez czterokwadrantową fotodiodę do co najmniej więcej niż jednego wolta. W oknie wymiany sondy kliknij przycisk Dalej i zamknij.Po odczekaniu 15 minut, aż wspornik osiągnie stabilność termiczną, w razie potrzeby ponownie wyreguluj położenie odchylonej wiązki laserowej na fotodiodzie wrażliwej na położenie. Kliknij NCM sweep, wybierz żądaną amplitudę oscylacji, kliknij użyj fazy i kliknij auto. Dostrój wspornik blisko maksimum jego pierwszego swobodnego rezonansu oscylacji do około 300 kiloherców dla wspornika o stałej sprężystości 40 niutonów na metr.Umieścić próbkę w uchwycie na próbkę. Kliknij obszar skanowania i ustaw rozdzielczość w zakresie od 256 na 256 do 1024 na 1024 pikseli, a następnie ustaw rozmiar skanowania i liczbę pikseli. Ustaw szybkość skanowania na 0,3 do jednego herca dla obszaru skanowania od jednego po jednym do pięciu mikrometrów do kwadratu.Ustaw ostrość widok optyczny na próbce i kliknij podejście, aby zbliżyć się do powierzchni próbki. Następnie kliknij przycisk podnieś 100 mikrometrów, aby podnieść końcówkę AFM o 100 mikrometrów nad powierzchnię próbki i kliknij przycisk rozszerz na obrazie optycznym próbki. Kliknij pasek etapu koncentracji uwagi, aby ustawić ostrość widoku na powierzchni próbki, a następnie użyj strzałek, aby poruszać się w obszarze interesującej nas próbki.Kliknij podejście, aby zazębić się z powierzchnią, a następnie kliknij skanowanie linii, aby sprawdzić, czy końcówka dobrze podąża za powierzchnią. W razie potrzeby dostosuj nastawę. Następnie kliknij skanowanie, aby rozpocząć obrazowanie powierzchni próbki, utrzymując stały reżim przemiany fazowej nieprzekraczającej delta 20 podczas obrazowania, aby uniknąć dużej siły obrazowania i zachować spójność między niezależnymi próbkami.W przypadku obrazowania nanospektroskopii w podczerwieni na 30 do 60 minut przed analizą włącz system AFM IR i laser IR. Otwórz wbudowane oprogramowanie do sterowania instrumentem i kliknij plik i nowy, aby otworzyć nowy nano IR file. Kliknij przycisk inicjalizuj, aby uruchomić system AFM IR i otworzyć pokrywę instrumentu.Zamontuj sondę pokrytą złotem silikonowym o promieniu nominalnym 30 nanometrów i stałej sprężystości 0,2 niutona na metr w systemie AFM IR, aby zmierzyć próbkę w trybie kontaktowym. Kliknij przycisk Załaduj w sekcji sondy AFM, a następnie przycisk Załaduj przycisk. Użyj strzałek ostrości na sondzie, aby ustawić ostrość kamery na wsporniku i użyj końcówki do krzyża nitkowego, aby umieścić krzyż nitkowy na końcu wspornika.Obróć pokrętła sterujące położeniem lasera wykrywającego, aby ustawić laser na końcu wspornika. Obróć pokrętła lasera, aby wykryć i zmaksymalizować sumę zmierzoną przez czterokwadrantową fotodiodę do wartości większej niż trzy wolty. Obróć pokrętło odchylenia, aby wyregulować ugięcie wspornika do minus jednego wolta, a następnie kliknij przycisk Dalej.Następnie zamknij pokrywę instrumentu. Użyj strzałek ostrości na sondzie, aby ustawić ostrość kamery na próbce i wskazówek do strzałek krzyża nitkowego, aby poruszać się w obszarze zainteresowania próbki. Kliknij Dalej i zaangażuj się.W okienku mikroskopu wybierz wysokość dla morfologii, amplitudę drugą dla absorpcji podczerwieni i częstotliwość PLL, aby odwzorować końcówkę do rezonansu kontaktowego próbki. W sekcji Skanowanie AFM ustaw parametry, jak pokazano dla obrazowania AFM i kliknij skanowanie, aby uzyskać mapę morfologii. Po zakończeniu mapowania morfologii w oknie mikroskopu kliknij mapę wysokości, aby umieścić sondę na szczycie jednego agregatu.W sekcji nano IR kliknij start IR, aby oświetlić próbkę laserem IR. Aby ustawić ostrość lasera na podczerwień na wsporniku, kliknij optymalizuj i wprowadź 1655 centymetrów jako liczbę falową. Kliknij dodaj i zeskanuj, aby określić pozycję lasera IR, a następnie kliknij aktualizuj i ok, aby wyrównać jego położenie z wspornikiem.W sekcji ogólnej wprowadź liczbę falową, dla której oczekiwana jest wysoka absorbancja w polu względnym i wyłącz opcję filtra pasmowoprzepustowego. Kliknij start IR, a następnie sprawdź odczyt miernika i FFT odpowiedzi wspornika. W oknie FFT przesuń zielony kursor, aby odczytać częstotliwość rezonansową wspornika.Typowa wartość FFT rezonansu wsporników wynosi około 200 kiloherców. Wprowadź wygenerowaną wartość częstotliwości rezonansowej w sekcji ogólnej w polu centrum częstotliwości i użyj okna częstotliwości 50 kiloherców. Kliknij okno strojenia impulsu laserowego, aby wybrać tryb wzmocnionego rezonansu i ustawić częstotliwość impulsów 222 kiloherców, zakres strojenia 50 kiloherców i cykl pracy lasera 5%Kliknij nabyć, aby przesunąć tętno lasera.Użyj kursora, aby dostroić impuls laserowy do częstotliwości reakcji mechanicznej rozszerzalności cieplnej próbki pochłaniającej światło podczerwone. Następnie wybierz pętlę sprzężenia fazowego, aby monitorować rezonans kontaktowy między próbką a końcówką i kliknij zero. W przypadku innych właściwości chemicznych w skali nano należy śledzić rezonans kontaktowy podczas akwizycji widm, aby upewnić się, że przegrzanie i zmiękczenie nie ma wpływu na widmo próbki.Wybierz opcję włącz, aby śledzić rezonans kontaktowy próbki do końcówki i wybierz wzmocnienie całkowe 0,5 i wzmocnienie proporcjonalne 10, a następnie kliknij OK.In oknie optymalizacji, kliknij długość fali i zeskanuj, aby zlokalizować laser IR dla co najmniej trzech liczb falowych odpowiadających głównym pasmom absorbancji próbki i dla co najmniej jednej liczby falowej dla każdego chipa lasera. Kliknij narzędzia, kalibrację tła IR i nowy, a następnie ustaw liczby falowe w zakresie od 1200 do 1800 centymetrów. Ustaw tła na średnią na jeden, cykl pracy 5%, a prędkość zamiatania na 100 centymetrów do kwadratu.Kliknij przycisk acquire, aby zmierzyć tło lasera IR w celu normalizacji zmierzonych widm zlokalizowanych w skali nano, zapisz plik i zamknij okno. W ustawieniach widm podczerwieni wybierz rozdzielczość widma IR od jednego do czterech centymetrów i liczbę współśrednich co najmniej 64 razy. Następnie kliknij przycisk acquire, aby zmierzyć zlokalizowane widmo podczerwieni w skali nano w zakresie białek.Aby uzyskać mapę chemiczną w rozdzielczości nano, wybierz 1655 centymetrów i obrazowanie w podczerwieni, a następnie kliknij skanuj w oknie skanowania AFM. Po zakończeniu mapowania zapisz pomiary. Następnie użyj wbudowanego oprogramowania do przetwarzania obrazu AFM, aby przeanalizować uzyskane mapy morfologii, rezonansu kontaktowego i chemii oraz zlokalizowane widma w skali nano.Jest to krytyczny krok w celu uzyskania wysoce czystego roztworu monomerycznego, ponieważ obecność zagregowanych gatunków może skutkować słabą odtwarzalnością kinetyki i wprowadzić artefakty do pomiarów. Podstawowym czynnikiem skutecznego badania próbek biologicznych o dużej niejednorodności jest prawidłowe położenie substratów stałych. Osadzanie w sprayu mikroprzepływowym może być stosowane zamiast ręcznego w celu zachowania architektury i niejednorodności próbki.Metody te torują drogę do odkrycia struktury chemicznej i właściwości poszczególnych biomolekuł oraz ich interakcji w fizjologicznym i natywnym środowisku ciekłym.

characterizing-individual-protein-aggregates-infrared

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano montaż bliskiego pola mikroskopu na podczerwień do obrazowania agregatów białkowych.

Montaż, strojenie i wykorzystanie bezaperturowego mikroskopu w bliskim polu podczerwieni do obrazowania białek

Opisano metodę obrazowania za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) w trybie stukowym (tapping mode) w celu wizualizacji plazmidowego DNA, białek cytoplazmatycznych oraz kompleksów DNA-białko. Metoda obejmuje alternatywne podejścia do przygotowania próbek do obrazowania AFM po przeprowadzeniu manipulacji biochemicznych. DNA zawierające specyficzne regiony oddziałujące z białkami są obserwowane w warunkach buforu zbliżonego do fizjologicznego.

Wizualizacja rekombinowanego DNA i kompleksów białkowych przy użyciu mikroskopii sił atomowych

Metoda badania struktury fotoreceptora białkowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) jest opisana w tym artykule. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) ujawnia nienaruszone dimery białkowe na powierzchni miki.

Mikroskopia sił atomowych fotoreceptorów światła czerwonego przy użyciu ilościowego mapowania właściwości nanomechanicznych PeakForce

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.

Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Ten protokół opisuje zastosowanie mikroskopii sił atomowych i nanoskalowej spektroskopii w podczerwieni do oceny wydajności fototermicznej spektroskopii w podczerwieni w nanoskali w charakterystyce trójwymiarowych próbek wielopolimerowych.

Postępy w nanoskalowej spektroskopii w podczerwieni w celu zbadania wielofazowych układów polimerowych

Poznaj nanospektroskopię w podczerwieni i mikroskopię sił atomowych do badania agregacji białek związanej z chorobami neurodegeneracyjnymi. Te metody umożliwiają wizualizację samoorganizacji białek na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych

Przeglądaj więcej filmów