Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae

Badaliśmy przetwarzanie RNA kotranskrypcyjnego, w tym jak rodzące się RNA fałduje podczas wyłaniania się z polimerazy RNA, która je syntetyzuje. Przed tą metodą nie byliśmy w stanie monitorować, jak RNA fałduje się podczas syntezy, co hamowało nas w badaniach. Ta nowa metoda przezwycięża te luki.

CoSTseq został opracowany w celu badania rozwijającego się fałdowania RNA w drożdżach. Jest szczególnie skuteczny w analizie bardzo obfitych RNA. Na początek inokuluj szczep Saccharomyces cerevisiae BY4741 w 50 mililitrach podłoża YPAD i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniami z prędkością 200 obrotów na minutę, aż hodowla osiągnie fazę środkową logarium.

Zbierz około trzech mililitrów kultury drożdżowej odpowiadającej 1,8 jednostki gęstości optycznej i wiruj w 2 500 x g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą wstępnie schłodzonej wirówki. Zrzuć supernatant do pojemnika na odpady. Ponownie zawiesić granulek w 10 mililitrach zimnego PBS i ponownie wirować w dawce 2 500 x g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń supernatant i trzymaj granulat drożdżowy na lodzie. Ostrożnie ponownie zawiesz granulat drożdżowy w 10 mililitrach zimnego 0,5% sarkosylu, nie tworząc przy tym bąbelków. Inkubuj ponownie zawieszone drożdże na lodzie przez 20 minut, aby umożliwić przenikliwość, następnie wypuszczaj komórki w granulach 400 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesijuj przepuszczalne komórki drożdży w 100 mikrolitrach wody wolnej od nukleazy za pomocą pipety P-1000.

Przygotuj roboczy roztwór buforu transkrypcyjnego 2,5X z świeżo dodanym ditiotreitolem o 5 milimolarach i podgrzej bufor sondujący strukturę 2,5X do 30 stopni Celsjusza. W czystej tubce o dwóch mililitrach dodaj wszystkie wymagane składniki reakcji i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj 100 mikrolitrów przygotowanych komórek drożdży do probówki reakcyjnej i inkubuj je w termomikserze ustawionym na 30 stopni Celsjusza, potrząsając z prędkością 500 obrotów na minutę przez dwie minuty.

Następnie szybko dodaj 200 mikrolitrów wcześniej podgrzanego buforu 2,5X do badania struktury oraz 25 mikrolitrów odczynnika dimetylosiarczanowego jednocześnie. Delikatnie zawiruj rurkę w dwóch impulsach i umieść ją z powrotem w inkubatorze ustawionym na 30 stopni Celsjusza i 500 obrotów na minutę. Kontynuuj inkubację na termomikserze przez cztery minuty, z odstępem 30 sekund między próbkami.

Przygotuj wcześniej bufory stop-and-wash i umieść je w lodzie do czasu użycia. Zatrzymaj metylację siarczanu dimetylowego, dodając jeden mililitr buforu stopowego do probówki reakcyjnej. Następnie wiruj próbki oznaczone dimetylosiarczanem w stężeniu 3 500 x g przez pięć minut w wirówce wstępnie schładzającej.

Po obróceniu wyrzuć supernatant do odpowiedniego pojemnika na odpady. Dodaj do pelletu jeden mililitr schłodzonego buforu do mycia i ponownie zawiesij. Powtarzaj wirowanie w dawce 3 500 x g przez pięć minut.

Natychmiast przejdź do ekstrakcji RNA i nie zamrażaj granulek drożdżowych. Ponownie zawiesić granulat drożdżowy oznaczony siarczanem dimetylu w 600 mikrolitrach buforu lizycznego RNA, a następnie przenieść zawiesinę do probówki zawierającej 40 mikrolitrów 20% siarczanu sodu dodecylowego. Inkubuj próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 sekund, z potrząsaniem z prędkością 950 obrotów na minutę.

Następnie wykonaj ekstrakcji RNA fenochloroformem zgodnie ze standardową procedurą. Wykonaj wir magnetycznych kulek streptawidyny i przenieś 44 mikrolitry tych kulek do nowej probówki na każdą próbkę o łącznej pojemności 80 mikrogramów RNA. Umieść magnetyczne koraliki na magnetycznym stojaku, aż kulki się ułożą.

Po usunięciu bufora magazynowego ponownie zawiesz kulki w jednym mililitrze bufora pre-wash A. Następnie inkubuj zawiesinę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, następnie namagnesuj i usuń supernatant. Po umyciu ponownie zawiesij kulki w 88 mikrolitrach buforu wiążącego 2X. Przelej 80 mikrolitrów zawiesiny do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 80 mikrogramów biotinylowanej próbki RNA w 80 mikrolitrach.

Obróć mieszankę z kulek na rotatorze przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieszczam rurkę na magnetycznym stojaku, aby zebrać przepływ zawierający dojrzałe RNA i zachować je na wytrącanie, aby wykonać selekcję poli-A dojrzałych RNA przy użyciu DMS-MaPseq. Następnie dwukrotnie płucz kompleks RNA powstający w kulkach 500 mikrolitrami buforu o wysokiej zawartości soli.

Następnie raz przepłukaj 500 mikrolitrami buforu wiążącego 1X, a na koniec 500 mikrolitrów buforu o niskiej zawartości soli. Następnie dodaj 300 mikrolitrów odczynnika RNA do kulki=nowo powstającego kompleksu RNA, dokładnie zawiesij i inkubuj na termomieszaku przez pięć minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 60 mikrolitrów chloroformu, zainkubuj i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Wiruj próbkę w 14 000 x g przez pięć minut w wirówce wstępnej schładzania. Na koniec przelej górną fazę wodną około 180 mikrolitrów do nowej probówki zbiorczej. Usuń pozostałą fazę organiczną, pozostawiając koraliki i resztki roztworu wodnego.

Po oczyszczeniu powstającego RNA wykonaj odwrotną transkrypcję przełączającą szablon, liguj adapter 5' i wybierz biblioteki do sekwencjonowania. Wizualizacja testowych produktów PCR na żelu o wartości 1% agarozy wykazała minimalne powstawanie dimerów primerów oraz charakterystyczne rozmazanie około 300 par zasad dla sekwencjonowania struktury transkrypcyjnej lub bibliotek CoSTseq i DMS-MaPseq. Elektroferogram dla próbki CoSTseq pierwszej potwierdził rozkład wielkości biblioteki z pikiem około 285 par zasad.

Odczyt odczytu mRNA ASC1 ujawnił, że biblioteka CoSTseq obejmuje pokrycie całego intronu, co potwierdza, że RNA jest dopiero w zarodku. Natomiast biblioteka DMS-MaPseq nie miała pokrycia intronowego, co wskazuje, że RNA jest dojrzałe. Matryca składania transkrypcyjnego cot 18S przed rRNA wykazała, że reaktywność DMS wykazywała nagłe zmiany, gdy polimeraza RNA przesuwała się z pozycji 790 do 811 wzdłuż locus rDNA.

Analiza reaktywności DMS mRNA ADH1 wykazała podobne profile między formami młodymi a dojrzałymi, wskazując na obszary stabilności strukturalnej. Dla porównania, mRNA SSA2 wykazywało obszary o różnej reaktywności DMS między formami młodymi a dojrzałymi, co sugeruje zmiany strukturalne podczas dojrzewania. Dzięki CoSTseq naukowcy mogą określić in vivo powstające struktury wtórne RNA oraz pozycję polimerazy RNA wzdłuż transkryptów RNA.

CoSTseq ma kroki o ograniczonym czasie, używa toksycznych chemikaliów. Lepiej przetwarzać nie więcej niż dwie próbki jednocześnie. Z całkowitego RNA wygenerowanego przez CoSTseq, niebiotynowo wykorzystane RNA mogą być wykorzystywane do jednoczesnego badania dojrzałych struktur przy użyciu tradycyjnego DMS-MaPseq.