Name: Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę CoSTseq do badania struktury RNA powstającego u Saccharomyces cerevisiae. Technika umożliwia jednoczesne mapowanie pozycji polimerazy RNA i stanu parowania zasad, dostarczając wgląd w składanie transkrypcyjne RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr SK Boopathy Jegathambal za kodowanie oraz członkom laboratorium Neugebauer, zwłaszcza P. Bechowi, za pomocne dyskusje. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (R01GM112766 do KMN) oraz stypendium przeddoktorskie American Heart Association (908949 do LS). LPS był wspierany przez grant szkoleniowy NIH 5T32GM14943803. LRAB był wspierany przez stypendium podoktorskie American Heart Association (26POST1569544). Pozyskiwanie danych w Yale Center for Genomic Analysis było wspierane przez National Institute of General Medical Sciences przy National Institutes of Health w ramach Nagrody nr 1S10OD03036301A1. Za tę pracę odpowiadają wyłącznie autorzy i niekoniecznie odzwierciedlają oficjalne poglądy NIH.

<ol><li>Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+opportunities+in+RNA+structure+experimental+determination+and+computational+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling.</a> Nature Methods. 19 (10), 1193-1207 (2022).</li>
<li>Bonilla, S. L., Jones, A. N., Incarnato, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biophysical+dissection+of+RNA+conformational+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural and biophysical dissection of RNA conformational ensembles.</a> Current Opinion in Structural Biology. 88, (2024).</li>
<li>Bose, R., Saleem, I., Mustoe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes%2C+functions%2C+and+therapeutic+possibilities+of+RNA+secondary+structure+ensembles+and+alternative+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Causes, functions, and therapeutic possibilities of RNA secondary structure ensembles and alternative states.</a> Cell Chemical Biology. 31 (1), 17-35 (2024).</li>
<li>Rapakko, J., Scaravilli, M., Änkö, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+RNA-protein+interactions+and+RNA+structures+in+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Interplay between RNA-protein interactions and RNA structures in gene regulation.</a> FEBS Open Bio. , (2025).</li>
<li>Rodgers, M., Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+for+rRNA+folding+and+assembly+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">A roadmap for rRNA folding and assembly during transcription.</a> Trends in biochemical sciences. 46 (11), 889-901 (2021).</li>
<li>Tomezsko, P., Swaminathan, H., Rouskin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMS-MaPseq+for+Genome-Wide+or+Targeted+RNA+Structure+Probing+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DMS-MaPseq for Genome-Wide or Targeted RNA Structure Probing In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 2254, 219-238 (2021).</li>
<li>Xu, H., Douglas, C. W., Lambowitz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+TGIRT-seq+methods+for+comprehensive+transcriptome+profiling+with+decreased+adapter+dimer+formation+and+bias+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improved TGIRT-seq methods for comprehensive transcriptome profiling with decreased adapter dimer formation and bias correction.</a> Scientific Reports. 9 (1), (2019).</li>
<li>Lopes, R., Agami, R., Korkmaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GROseq%2C+A+Tool+for+Identification+of+Transcripts+Regulating+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">GROseq, A Tool for Identification of Transcripts Regulating Gene Expression.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1543, 45-55 (2017).</li>
<li>Mahat, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-Pair+Resolution+Genome-Wide+Mapping+Of+Active+RNA+polymerases+using+Precision+Nuclear+Run-On+%28PROseq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Base-Pair Resolution Genome-Wide Mapping Of Active RNA polymerases using Precision Nuclear Run-On (PROseq).</a> Nature protocols. 11 (8), 1455-1476 (2016).</li>
<li>Schärfen, L., Vock, I. W., Simon, M. D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+folding+of+nascent+RNA+regulates+eukaryotic+RNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid folding of nascent RNA regulates eukaryotic RNA biogenesis.</a> Molecular Cell. 85 (8), 1561-1574 (2025).</li>
<li>Hawley, D. K., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+steps+in+transcription+initiation+and+reinitiation+from+the+major+late+promoter+in+a+HeLa+nuclear+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional steps in transcription initiation and reinitiation from the major late promoter in a HeLa nuclear extract.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (8), 3452-3461 (1987).</li>
<li>Hawley, D. K., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+partial+characterization+of+three+functional+steps+in+transcription+initiation+by+human+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Separation and partial characterization of three functional steps in transcription initiation by human RNA polymerase II.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (13), 8163-8172 (1985).</li>
<li>Zubradt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMS-MaPseq+for+genome-wide+or+targeted+RNA+structure+probing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo.</a> Nature Methods. 14 (1), 75-82 (2017).</li>
<li>Tijerina, P., Mohr, S., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMS+foot-printing+of+structured+RNAs+and+RNA-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">DMS foot-printing of structured RNAs and RNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2608-2623 (2007).</li>
<li>Liebig, A., Waldsich, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+RNA+structure+within+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing RNA structure within living cells.</a> Methods in enzymology. 468, 219-238 (2009).</li>
<li>Pelechano, V., Chávez, S., Pérez-Ortín, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Complete+Set+of+Nascent+Transcription+Rates+for+Yeast+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Complete Set of Nascent Transcription Rates for Yeast Genes.</a> PLOS ONE. 5 (11), (2010).</li>
<li>Wery, M., Descrimes, M., Thermes, C., Gautheret, D., Morillon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-mediated+RNA+fragmentation+allows+robust+transcript+reassembly+upon+whole+transcriptome+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Zinc-mediated RNA fragmentation allows robust transcript reassembly upon whole transcriptome RNA-Seq.</a> Methods. 63 (1), 25-31 (2013).</li>
<li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase%3A+an+RNA+repair+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> The EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li>
<li>Köster, J., Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake+a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fastp%3A+an+ultrafast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">fastp: an ultrafast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithms+for+efficiently+collapsing+reads+with+Unique+Molecular+Identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Algorithms for efficiently collapsing reads with Unique Molecular Identifiers.</a> PeerJ. 7, (2019).</li>
<li>Spasic, A., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+RNA+secondary+structure+folding+ensembles+using+SHAPE+mapping+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling RNA secondary structure folding ensembles using SHAPE mapping data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 314-323 (2018).</li>
<li>Saldi, T., Fong, N., Bentley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+elongation+rate+affects+nascent+histone+pre-mRNA+folding+and+3%E2%80%B2+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription elongation rate affects nascent histone pre-mRNA folding and 3′ end processing.</a> Genes & Development. 32 (3-4), 297-308 (2018).</li>
<li>Pan, T., Artsimovitch, I., Fang, X., Landick, R., Sosnick, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+a+large+ribozyme+during+transcription+and+the+effect+of+the+elongation+factor+NusA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Folding of a large ribozyme during transcription and the effect of the elongation factor NusA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (17), 9545-9550 (1999).</li>
<li>Heilman-Miller, S. L., Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+transcription+on+folding+of+the+Tetrahymena+ribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Effect of transcription on folding of the Tetrahymena ribozyme.</a> RNA. 9 (6), 722-733 (2003).</li>
<li>Yu, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computationally+reconstructing+co-transcriptional+RNA+folding+from+experimental+data+reveals+rearrangement+of+nonnative+folding+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Computationally reconstructing co-transcriptional RNA folding from experimental data reveals rearrangement of nonnative folding intermediates.</a> Molecular Cell. 81 (4), 870-883 (2021).</li>
<li>Yu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+eukaryotic+nascent+RNA+structure+elucidates+cotranscriptional+folding+and+its+antimutagenic+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of eukaryotic nascent RNA structure elucidates cotranscriptional folding and its antimutagenic effect.</a> Nature communications. 14 (1), (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

RNA zaczyna się składać współtranskrypcjonalnie z powodu szybszej kinetyki parowania zasad w porównaniu do szybkości syntezy 24,25,26,27. Nasza obecna wiedza na temat rodzącego się fałdowania RNA pochodzi z badań pojedyncząsteczkowych RNA prokariotycznych, sondowania in vitro lub metod in silico. W tym protokole prezentowany jest szczegółowy workflow CoSTseq; technika ta umożl...

RNA może fałdować się w struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe dzięki parowaniu zasad w cząsteczkach RNA, a te struktury mogą być dodatkowo kształtowane przez białka pełniące rolę chaperonów prowadzących fałdowanie RNA1. Struktura RNA może być wysoce dynamiczna, gdzie komórkowe RNA mogą dopasowywać się do różnych struktur określonych przez krajobraz termodynamiczny, generując zespoły możliwych konformacji RNA2. Dynamiczne zmiany konformacyjne mogą wpływać na regulację i ekspresję genów 3,4. Z kolei RNA może również przyjmować bardzo preferowane struktury ściśle powiązane z jego funkcją, takie jak tRNA, małe jądrowe RNA i rRNA. Chociaż te przykłady podkreślają dojrzałe RNA o silnych rolach regulacyjnych, etapy przetwarzania RNA eukariotycznego często współwystępują z transkrypcją, w tym splicing pre-mRNA, rozszczepienie 3' na końcu oraz modyfikację RNA. Podobnie, fałdowanie RNA może zachodzić przed dojrzewaniem transkryptu, jak omawiano w innych miejscach5.
Chociaż sekwencja RNA może kodować strukturę wtórną, dokładne określenie często wymaga eksperymentalnej walidacji in vitro lub in vivo. Pojawienie się specyficznych dla struktury technik modyfikacji chemicznej, takich jak DMS-MaPseq (profilowanie mutacyjne dimetylosiarczanu z sekwencjonowaniem), utorowało drogę do określania wtórnej struktury komórkowego RNA z komórek żywych6. DMS jest wprowadzany do komórek i konkretnie metyluje ściany parowania zasad Watsona-Cricka: adenozynę, cytozynę oraz, w mniejszym stopniu, urydynę, które są dostępne tylko po niesparowaniu. Po modyfikacji przez DMS można użyć wysokiej jakości i wysoce procesowej transkryptozy odwrócnej, takiej jak termostabilna transkryptoza intronowa odwrotna grupy II (TGIRT)7, która koduje zmodyfikowane zasady jako mutacje w ostatecznej przygotowanej bibliotece cDNA. Mutacje te można następnie wykorzystać do wnioskowania dostępności RNA na poziomie nukleotydów. Chociaż jest to potężna technika, metody DMS-MaPseq i pokrewne były głównie wykorzystywane do badania dojrzałego RNA, które jest już w pełni złożone6.
Opracowano kilka metod badania początkowej regulacji i przetwarzania RNA. Globalne sekwencjonowanie run-on (GROseq) zostało opracowane, aby przezwyciężyć ograniczenia RNA-seq, które umożliwia pomiar poziomów RNA w komórkach w stanie stacjonarnym i tym samym dostarcza informacji uśredniających transkrypcję, przetwarzanie RNA oraz procesy degradacji wpływające na poziomy RNA. GROseq wykorzystywał bromouridynę do przebiegu jądrowego, gdzie polimeraza RNA (Pol) mogła dodawać nukleotydy do powstającego RNA z rozdzielczością dziesiątek zasad8. Precyzyjne sekwencjonowanie run-on (PROseq) zostało opracowane na podstawie tej metodologii, aby mapować RNA Pols na powstającym RNA w rozdzielczości par zasad, wykorzystując biotynę-NTP. Tutaj dodano biotinylowany NTP tam, gdzie Pol ostatnio wykryto na 3' końcu nowo zsyntetyzowanego RNA9.
Ostatnio Schärfen i in. opracowali i wykorzystali Co-transkrypcyjne Śledzenie Struktury Strukturalnej (CoSTseq), które wykorzystuje i adaptuje sondowanie biotynowe oraz DMS, umożliwiając określenie struktury RNA w początkujących transkrypcjach w S. cerevisiae10. CoSTseq umożliwia określenie struktury wtórnej RNA podczas aktywnej transkrypcji; protokół ten szczegółowo opisuje, jak jądrowy run-on jest łączony z sondowaniem DMS podczas eksperymentów CoSTseq. Ponieważ CoSTseq wymaga starannego obsługiwania podczas przygotowywania próbek oraz szczególnej uwagi na jakość danych podczas analizy CoSTseq, protokół ten opisuje najlepsze praktyki generowania odpowiednich bibliotek do sekwencjonowania parowanego na platformie Illumina. Protokół CoSTseq jednocześnie dostarcza RNA powstające i dojrzałe, z czego to drugie można analizować jako zbiór danych DMS-MaPseq, umożliwiając rygorystyczne porównanie RNA powstającego i dojrzałego (Rysunek 1). Eksperymentalnie wymagany jest dostęp do odczynników niezbędnych do utrzymania hodowli drożdży oraz przeprowadzania sond jądrowych i DMS, zgodnie z poniższym protokołem. Początkowy wynik RNA jest kluczowy dla sukcesu przygotowania biblioteki CoSTseq i analizy danych; Dlatego warunki wzrostu ustanowione przez odpowiednie inkubatory i podłoża są kluczowe dla zapewnienia odpowiedniej ilości materiału wyjściowego. Wreszcie, aby przeprowadzić analizę obliczeniową danych CoSTseq, idealny jest dostęp do klastra High-Performance Computing (HPC).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69945/69945fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Przegląd połączonego przygotowania biblioteki CoSTseq i DMS-MaPseq z tej samej próbki biologicznej. (A) Permeabilizacja ściany komórkowej drożdży i błony jądrowej za pomocą sarkozylu umożliwia włączenie biotyny-NTP na 3' końcu rodzącego się RNA podczas reakcji jądrowej na przebieg. (B) DMS metyluje niesparowane reszty A i C (czasem U) na powstającym i dojrzałym RNA w komórce permeabilizowanej, a całkowite RNA jest pozyskiwane przez ekstrakcji fenol/chloroform. Powstające RNA jest następnie oczyszczane z całkowitego RNA przez magnetyczne kulki sprzężone ze streptawidyną; Ekstrakcja TRIzol uwalnia powstające RNA z kulek. Równolegle, supernatant kulkowy zawierający poliadenylowane mRNA może być wytrącony EtOH; z tego materiału mRNA może być izolowane przez oligo(dT) odciąganie kulek. MRNA poli A+ są fragmentowane przed przygotowaniem w bibliotece. (C) Do oddzielnego generowania cDNA z RNA powstającego lub dojrzałego stosuje się transkryptoazę przełączającą szablon, po czym następuje ligacja adapterów 5' i 3', aby wprowadzić UMI N7 i kody kreskowe (szczegóły dotyczące CoSTseq patrz Rysunek 2 ). Należy zauważyć, że etapy transkrypcji wstecznej DMS-MaPseq i CoSTseq będą wykorzystywać odrębne adaptery heterodupleksowe z nawisami uzupełniającymi biotynę-NTP stosowaną w CoSTseq oraz N nawisów stosowanych w DMS-MaPseq. Minimalne cykle PCR są używane do wzmacniania w celu ograniczenia polaryzacji w bibliotece, a selekcja rozmiaru jest stosowana do usunięcia dimerów adaptera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69945/69945fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

<table><tbody><tr><td>10mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330019</td><td></td></tr><tr><td>10mM Biotin-11-CTP</td><td>Nauki biologiczne Jena</td><td>NU-831-BIOX</td><td></td></tr><tr><td>10mM GTP</td><td>Invitrogen</td><td>18332015</td><td></td></tr><tr><td>10mM UTP</td><td>Invitrogen</td><td>18333013</td><td></td></tr><tr><td>10X NEBuffer 1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7001S</td><td>Użyte w kroku 7.2.1</td></tr><tr><td>10X fosforanowa sól fizjologiczna buforowana (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS</td><td>RPI&nbsp;</td><td>L23100-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fenol: chloroform&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP do wyboru rozmiaru</td><td>Beckman Coulter &nbsp;</td><td>A63880</td><td>Użyte do wyboru rozmiaru w kroku 7.5.1</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdży bacto</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bicyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B3876-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-GLUKOZA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>DIFCO AGAR</td><td>BD DIFCO</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dimetylo-siarczan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D186309-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads i handel; Koraliki MyOne Streptavidin C1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td>Stosowany do obniżania biotyny w sekcji 4.1</td></tr><tr><td>Dynabeads i handel; mRNA DIRECT&trade; Zestaw oczyszczający</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td>Wykorzystywane do wyboru Poly A w sekcji 5.1</td></tr><tr><td>EDTA, pH 8, 0,5M</td><td>Sigma Aldrich &nbsp;</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>Współwydzielacz stosowany w krokach 4.2.7 i 5.2.4</td></tr><tr><td>Induro&reg; &nbsp; Transkryptaza odwrotna</td><td>New England Biolabs</td><td>M0681S</td><td>Enzym RT stosowany w kroku 6.3.1</td></tr><tr><td>Alkohol izoamylowy</td><td>Sigma Aldrich &nbsp;</td><td>W205710-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>JT-BAKER</td><td>9084-05-01</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart PCR Kit & nbsp; &nbsp;</td><td>Roche</td><td>07958889001</td><td>Wysokowierny DNA Pol stosowany w 7.3.2 i 7.4.1 w reakcjach PCR</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLCM2154</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Używany do oczyszczania DNA w krokach 6.3.3 i 7.2.2</td></tr><tr><td>Ligaza Mth RNA</td><td>New England Biolabs</td><td>M2611A</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Clean & Koncentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4060</td><td>Zalecane do oczyszczania DNA Oligo w kroku 7.1.2</td></tr><tr><td>Octan potasu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236497-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>JT Baker</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Avantor</td><td>6984-04-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Clean & Koncentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1014</td><td>Zestaw do czyszczenia RNA stosowany w kroku 5.3.2 po leczeniu PNK</td></tr><tr><td>RNaseOUT&trade; Rekombinowany inhibitor rybonukleazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td>Inhibitor RNazy stosowany w kroku 5.3.1 podczas leczenia PNK</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB07080</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Jakość biologiczna</td><td>351-035-721</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5150-1L</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu&nbsp;</td><td>Macron</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&middot; In&trade; Inhibitor RNazy (20 U/&mu; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2696</td><td>Inhibitor RNazy stosowany w kroku 6.3.1</td></tr><tr><td>Polinukleotydowa kinaza T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Termostabilny 5' Ligaza DNA/RNA aplikacji</td><td>New England Biolabs</td><td>M0319L</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7,4, 1M</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60202. K2</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>TEKNOVA</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&trade; Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Dla elucii RNA w sekcji 4.2; w sekcji 4 nazywana także "reagentem RNA"</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

porównawcza analiza struktury rna transkryptów powstających i dojrzałych u saccharomyces cerevisiae

Comparative RNA Structure Analysis of Nascent and Mature Transcripts in Saccharomyces cerevisiae

Podczas transkrypcji rodzące się RNA zaczyna parować zasad podczas wychodzenia z polimeraz RNA (Pols). To parowanie zasad umożliwia tworzenie struktur RNA, które mają istotny wpływ na ekspresję genów na poziomie przetwarzania, translacji i stabilności RNA. Ustalone metody badania struktury wtórnej RNA ograniczają się do dojrzałych transkrypcji, podczas gdy o stanach fałdowania wiadomo niewiele. Ponadto stosunkowo niższa obfitość (< 1%) oraz przejściowy charakter powstającego RNA komplikują jego izolację i charakteryzację. Śledzenie struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) wykorzystuje transkrypcyjne badania z biotyną-NTP i dimetylosiarczanem (DMS), aby jednocześnie uzyskać pozycję Pol i status parowania zasad w początkujących transkrypcjach. W Saccharomyces cerevisiae CoSTseq dostarcza informacji o sekwencji i strukturze blisko końca 3' powstających RNA transkrybowanych przez dowolne z trzech RNA Pol. Podczas transkrypcji biotyna-NTP wprowadzona w miejscu aktywnym skutecznie blokuje Pols. Następnie leczenie DMS metyluje niesparowane nukleotydy A, C i U. Późniejsze wzbogacenie biotyny i synteza cDNA za pomocą transkryptozy odwróconej przełączającej się szablonami umożliwiają sekwencjonowanie parowe oraz obliczanie reaktywności DMS w zależności od pozycji Pol. CoSTseq jest łatwo wykonywany równolegle z sondowaniem DMS (DMS-MaPseq), umożliwiając również przechwycenie złożonego dorosłego transkrypcji. Przedstawiono tutaj szczegółowy protokół dla równoległego CoSTseq i DMS-MaPseq, obejmujący transkrypcyjne run-on, przygotowanie biblioteki oraz analizę danych.

Ta sekcja przedstawia rzeczywiste wyniki uzyskane podczas implementacji workflow i analizy CoSTseq, zgodnie z opisem tego protokołu. Po pierwsze, ta sekcja opisuje oczekiwane wyniki po ocenie jakości pomyślnych przygotowań bibliotecznych przed i po sekwencjonowaniu. Przed sekwencjonowaniem badacze mogą wykorzystać test PCR oraz analizę TapeStation, aby potwierdzić obecność RNA po wzbogaceniu biotyn. Wskazuje to na pomyślną izolację powstającego RNA podczas przygotowań do biblioteki CoSTseq. Ocena jakości danych po sekwen...

Struktura wtórna RNA została głównie zaobserwowana w dojrzałym RNA metodami sondowania struktury. Sekwencjonowanie śledzenia struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) jednoczy jądrowy run-on, który był wykorzystywany do badania pozycji polimerazy na powstającym RNA, z wykorzystaniem sondowania struktury. CoSTseq umożliwia tym samym obserwację wtórnej struktury RNA w RNA podczas aktywnej transkrypcji.

Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae

During transcription, nascent RNA starts base pairing as it exits RNA polymerases (Pols). This base pairing permits the formation of RNA structures that ...

Badaliśmy przetwarzanie RNA kotranskrypcyjnego, w tym jak rodzące się RNA fałduje podczas wyłaniania się z polimerazy RNA, która je syntetyzuje. Przed tą metodą nie byliśmy w stanie monitorować, jak RNA fałduje się podczas syntezy, co hamowało nas w badaniach. Ta nowa metoda przezwycięża te luki.CoSTseq został opracowany w celu badania rozwijającego się fałdowania RNA w drożdżach. Jest szczególnie skuteczny w analizie bardzo obfitych RNA. Na początek inokuluj szczep Saccharomyces cerevisiae BY4741 w 50 mililitrach podłoża YPAD i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniami z prędkością 200 obrotów na minutę, aż hodowla osiągnie fazę środkową logarium.Zbierz około trzech mililitrów kultury drożdżowej odpowiadającej 1,8 jednostki gęstości optycznej i wiruj w 2 500 x g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą wstępnie schłodzonej wirówki. Zrzuć supernatant do pojemnika na odpady. Ponownie zawiesić granulek w 10 mililitrach zimnego PBS i ponownie wirować w dawce 2 500 x g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usuń supernatant i trzymaj granulat drożdżowy na lodzie. Ostrożnie ponownie zawiesz granulat drożdżowy w 10 mililitrach zimnego 0,5% sarkosylu, nie tworząc przy tym bąbelków. Inkubuj ponownie zawieszone drożdże na lodzie przez 20 minut, aby umożliwić przenikliwość, następnie wypuszczaj komórki w granulach 400 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesijuj przepuszczalne komórki drożdży w 100 mikrolitrach wody wolnej od nukleazy za pomocą pipety P-1000.Przygotuj roboczy roztwór buforu transkrypcyjnego 2,5X z świeżo dodanym ditiotreitolem o 5 milimolarach i podgrzej bufor sondujący strukturę 2,5X do 30 stopni Celsjusza. W czystej tubce o dwóch mililitrach dodaj wszystkie wymagane składniki reakcji i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj 100 mikrolitrów przygotowanych komórek drożdży do probówki reakcyjnej i inkubuj je w termomikserze ustawionym na 30 stopni Celsjusza, potrząsając z prędkością 500 obrotów na minutę przez dwie minuty.Następnie szybko dodaj 200 mikrolitrów wcześniej podgrzanego buforu 2,5X do badania struktury oraz 25 mikrolitrów odczynnika dimetylosiarczanowego jednocześnie. Delikatnie zawiruj rurkę w dwóch impulsach i umieść ją z powrotem w inkubatorze ustawionym na 30 stopni Celsjusza i 500 obrotów na minutę. Kontynuuj inkubację na termomikserze przez cztery minuty, z odstępem 30 sekund między próbkami.Przygotuj wcześniej bufory stop-and-wash i umieść je w lodzie do czasu użycia. Zatrzymaj metylację siarczanu dimetylowego, dodając jeden mililitr buforu stopowego do probówki reakcyjnej. Następnie wiruj próbki oznaczone dimetylosiarczanem w stężeniu 3 500 x g przez pięć minut w wirówce wstępnie schładzającej.Po obróceniu wyrzuć supernatant do odpowiedniego pojemnika na odpady. Dodaj do pelletu jeden mililitr schłodzonego buforu do mycia i ponownie zawiesij. Powtarzaj wirowanie w dawce 3 500 x g przez pięć minut.Natychmiast przejdź do ekstrakcji RNA i nie zamrażaj granulek drożdżowych. Ponownie zawiesić granulat drożdżowy oznaczony siarczanem dimetylu w 600 mikrolitrach buforu lizycznego RNA, a następnie przenieść zawiesinę do probówki zawierającej 40 mikrolitrów 20% siarczanu sodu dodecylowego. Inkubuj próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 sekund, z potrząsaniem z prędkością 950 obrotów na minutę.Następnie wykonaj ekstrakcji RNA fenochloroformem zgodnie ze standardową procedurą. Wykonaj wir magnetycznych kulek streptawidyny i przenieś 44 mikrolitry tych kulek do nowej probówki na każdą próbkę o łącznej pojemności 80 mikrogramów RNA. Umieść magnetyczne koraliki na magnetycznym stojaku, aż kulki się ułożą.Po usunięciu bufora magazynowego ponownie zawiesz kulki w jednym mililitrze bufora pre-wash A. Następnie inkubuj zawiesinę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, następnie namagnesuj i usuń supernatant. Po umyciu ponownie zawiesij kulki w 88 mikrolitrach buforu wiążącego 2X. Przelej 80 mikrolitrów zawiesiny do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 80 mikrogramów biotinylowanej próbki RNA w 80 mikrolitrach.Obróć mieszankę z kulek na rotatorze przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieszczam rurkę na magnetycznym stojaku, aby zebrać przepływ zawierający dojrzałe RNA i zachować je na wytrącanie, aby wykonać selekcję poli-A dojrzałych RNA przy użyciu DMS-MaPseq. Następnie dwukrotnie płucz kompleks RNA powstający w kulkach 500 mikrolitrami buforu o wysokiej zawartości soli.Następnie raz przepłukaj 500 mikrolitrami buforu wiążącego 1X, a na koniec 500 mikrolitrów buforu o niskiej zawartości soli. Następnie dodaj 300 mikrolitrów odczynnika RNA do kulki=nowo powstającego kompleksu RNA, dokładnie zawiesij i inkubuj na termomieszaku przez pięć minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 60 mikrolitrów chloroformu, zainkubuj i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Wiruj próbkę w 14 000 x g przez pięć minut w wirówce wstępnej schładzania. Na koniec przelej górną fazę wodną około 180 mikrolitrów do nowej probówki zbiorczej. Usuń pozostałą fazę organiczną, pozostawiając koraliki i resztki roztworu wodnego.Po oczyszczeniu powstającego RNA wykonaj odwrotną transkrypcję przełączającą szablon, liguj adapter 5' i wybierz biblioteki do sekwencjonowania. Wizualizacja testowych produktów PCR na żelu o wartości 1% agarozy wykazała minimalne powstawanie dimerów primerów oraz charakterystyczne rozmazanie około 300 par zasad dla sekwencjonowania struktury transkrypcyjnej lub bibliotek CoSTseq i DMS-MaPseq. Elektroferogram dla próbki CoSTseq pierwszej potwierdził rozkład wielkości biblioteki z pikiem około 285 par zasad.Odczyt odczytu mRNA ASC1 ujawnił, że biblioteka CoSTseq obejmuje pokrycie całego intronu, co potwierdza, że RNA jest dopiero w zarodku. Natomiast biblioteka DMS-MaPseq nie miała pokrycia intronowego, co wskazuje, że RNA jest dojrzałe. Matryca składania transkrypcyjnego cot 18S przed rRNA wykazała, że reaktywność DMS wykazywała nagłe zmiany, gdy polimeraza RNA przesuwała się z pozycji 790 do 811 wzdłuż locus rDNA.Analiza reaktywności DMS mRNA ADH1 wykazała podobne profile między formami młodymi a dojrzałymi, wskazując na obszary stabilności strukturalnej. Dla porównania, mRNA SSA2 wykazywało obszary o różnej reaktywności DMS między formami młodymi a dojrzałymi, co sugeruje zmiany strukturalne podczas dojrzewania. Dzięki CoSTseq naukowcy mogą określić in vivo powstające struktury wtórne RNA oraz pozycję polimerazy RNA wzdłuż transkryptów RNA.CoSTseq ma kroki o ograniczonym czasie, używa toksycznych chemikaliów. Lepiej przetwarzać nie więcej niż dwie próbki jednocześnie. Z całkowitego RNA wygenerowanego przez CoSTseq, niebiotynowo wykorzystane RNA mogą być wykorzystywane do jednoczesnego badania dojrzałych struktur przy użyciu tradycyjnego DMS-MaPseq.

comparative-rna-structure-analysis-nascent-mature-transcripts

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Poziom w stanie stacjonarnym określonych mRNA jest określany przez szybkość syntezy i rozpadu mRNA. Tempo degradacji mRNA w całym genomie lub tempo rozpadu określonych mRNA można zmierzyć, określając okresy półtrwania mRNA. Protokół ten koncentruje się na pomiarze szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae.

Pomiar szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae przy użyciu szczepów rpb1-1

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący sekwencję RNA do monitorowania poziomów mRNA w czasie podczas niedotlenienia komórek S. cerevisiae. Metodę tę można dostosować do analizy ekspresji genów podczas dowolnej odpowiedzi komórkowej.

Pomiar poziomu mRNA w czasie podczas odpowiedzi niedotlenienia drożdży S. cerevisiae

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Protokół ten ilościowo mierzy stabilność i okres półtrwania intergenowych i intragenowych RNA wzmacniających w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą leczenia aktinomycyną D, RT-qPCR oraz analizy regresji nieliniowej. Stosuje się strategie normalizacji specyficzne dla pozycji, aby dokładnie modelować dynamikę rozpadu eRNA w sposób zależny od kontekstu.

Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Dostarczamy szczegółowe metody metabolicznego oznaczania i oczyszczania początkujących transkryptów do analizy transkryptomu u wczesnych zarodków Xenopus z wykorzystaniem 5-etynylo-urydyny (5-EU).

Znakowanie metaboliczne nowo powstającego transkryptomu w wczesnej embriogenezie Xenopus

Poznaj metodę CoSTseq do badania struktury RNA powstającego u Saccharomyces cerevisiae. Technika umożliwia jednoczesne mapowanie pozycji polimerazy RNA i stanu parowania zasad, dostarczając wgląd w składanie transkrypcyjne RNA.

Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów