Name: Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Poznaj analizę mikromacierzy w Saccharomyces cerevisiae poddanym stresie oksydacyjnym. Naucz się izolować RNA, syntetyzować cDNA i przygotowywać sondy biotynowane do hybrydyzacji z chipami genowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

University of Vermont, Vermont Genetics Network. Publikacja ta została zrealizowana dzięki Vermont Genetics Network, w ramach grantu nr P20 RR16462 z programu BRIN oraz grantu nr P20 RR16462 z programu INBRE National Center for Research Resources (NCRR), który jest częścią National Institutes of Health (NIH). Treść publikacji leży wyłącznie w odpowiedzialności autorów i nie musi odzwierciedlać oficjalnego stanowiska NCRR lub NIH.
Pragniemy podziękować wszystkim uczestniczącym instytucjom edukacyjnym za współpracę i wkład w dopracowanie tego modułu: Castleton State College, Green Mountain College, Johnson State College, Lyndon State College, Marlboro College, Middlebury College, Norwich University oraz Saint Michael's College.

<ol><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).</li>
<li>D'Autréaux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+as+signalling+molecules%3A+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).</li>
<li>Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+responses+to+oxidative+stress+impact+upon+multiple+levels+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis.</a> J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).</li>
<li>Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H2O2+stimulon+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).</li>
<li>Vermont Genetics Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microarray+Outreach%22">Microarray Outreach</a>. , (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Affymetrix+GeneChip+Expression+Analysis%3A+Technical+Manual%22">Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual</a>. , Affymetrix. Santa Clara, CA. (2004).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+Bioinformatics+Resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources.</a> Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Dennis, G. Jr, Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAVID%3A+Database+for+Annotation%2C+Visualization%2C+and+Integrated+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery.</a> Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).</li>
</ol>

Produkcja tego artykułu wideo była sponsorowana przez EMD-Millipore.

Zastosowania i znaczenie.
Program edukacyjny Vermont Genetics Network na Uniwersytecie Vermont prowadzi działania skierowane do studentów studiów licencjackich w ośmiu partnerskich uczelniach na terenie całego stanu. Celem VGN Outreach Core jest zapoznanie studentów w stanie Vermont z najnowocześniejszą technologią i zasobami naukowymi poprzez praktyczne doświadczenia. Opisany moduł mikromacierzy został opracowany w 2003 roku, a następnie zaktualizowany. Jest on oferowany w formie minikursu lub jako element zintegrowany z istniejącym programem zajęć laboratoryjnych w uczestniczących instytucjach.
Projekt ten, realizowany wspólnie przez jednostki centralne uniwersytetów badawczych i uczelnie licencjackie, sprzyja współpracy w obszarze edukacji i badań. Działania upowszechniające technologię mikromacierzy w całym stanie przyczyniły się do usprawnienia programów nauczania oraz stworzyły możliwości badawcze i networkingowe dla placówek centralnych, kadry naukowej oraz studentów.
W miarę wdrażania programu przez kadrę naukową uczelni, zachęca się ich do projektowania własnych eksperymentów, pod warunkiem dostępności odpowiednich chipów Affymetrix GeneChips oraz adnotacji. Wszystkie informacje dotyczące tego modułu, w tym podręcznik laboratoryjny, bibliografia i prezentacje PowerPoint, są dostępne online (Vermont Genetics Network, 2008).
Kluczowe etapy:
Sferoplastowanie: Ważne jest, aby potwierdzić pomyślny przebieg sferoplastowania pod mikroskopem. Zastosowanie SDS jest bardzo korzystne, ponieważ powoduje ono pęcznienie drożdży, co prowadzi do powstania sferoidów. Należy zwrócić uwagę, czy komórki pączkujące również tworzą sferoidy. W przypadku zaobserwowania częściowego sferoplastowania zaleca się wydłużenie czasu inkubacji z litykazą.
Oczyszczanie osadu: Podczas reakcji wytrącania i następnego etapu przemywania etanolem bardzo łatwo jest zgubić osad cDNA. Niezbędna jest najwyższa ostrożność i skrupulatna uwaga podczas pracy z osadem.
Aplikowanie wody do centrum membrany: Podczas etapu elucji RNA z membrany ważne jest, aby „wstrzyknąć” 30 μl wody bezpośrednio do centrum membrany krzemionkowej. Jeśli nie zostanie to osiągnięte, kolumnę można odwirować, a otrzymany eluat ponownie nanieść na membranę krzemionkową. Czynność tę można powtarzać tyle razy, ile jest to konieczne.
Modyfikacje i zamienniki produktów:
<ol>
 <li>Można zastosować alternatywne kolumny do oczyszczania RNA. Przykłady to m.in. USB prep-ease, zestaw Invitrogen Pure Link RNA oraz zestaw Omega RNA clean-up.</li>
 <li>Schizosaccharomyces pombe jest opcjonalnym drożdżem. Affymetrix GeneChip zawiera oba genomy na tym samym chipie.</li>
 <li>Można zastosować różne rodzaje i czasy traktowania. Może to obejmować traktowanie lekami, temperaturą, przeciwutleniaczami itp. Czas traktowania można również dostosować.</li>
 <li>Traktowanie DNazą może nie być wymagane, ponieważ opisane metody wykorzystują starter Oligo (dT).</li>
 <li>Podwójna elucja RNA z kolumny tą samą 30 μl alikwotą nie jest wymagana. Jednokrotna elucja jest prawie zawsze wystarczająca. Procedurę tę sugeruje się w celu zapewnienia całkowitego odzysku. Dodatkowo wodę używaną do elucji RNA z kolumny można wstępnie podgrzać do 65°C, aby dodatkowo zwiększyć wydajność odzyskiwania RNA z kolumny krzemionkowej.</li>
 <li>Dostępnych jest wiele metod ilościowego oznaczania RNA. Urządzenia Eppendorf i Nanodrop wybrano ze względu na łatwość obsługi i potwierdzoną dokładność.</li>
 <li>Elektroforezę w żelu agarozowym można przeprowadzić przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. System E-Gel nie jest wymagany, ale jest zalecany, ponieważ jest wolny od RNaz i nie wymaga czasu oczekiwania na zestalenie żelu.</li>
 <li>Podano informacje o zamawianiu produktów. Jednak wiele odczynników ogólnych można zamówić u wielu różnych dostawców.</li>
 <li>Odczynniki do syntezy cDNA w jednym cyklu (One Cycle cDNA) można zakupić oddzielnie, jeśli jest to bardziej ekonomiczne.</li>
 <li>Istnieją inne metody przygotowania matrycy, jednak uważamy, że ta metoda oferuje studentowi więcej możliwości dydaktycznych.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wymieszaj w wstrząsarku wiroksowym</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne (2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dozowniki P-10s</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-20&amp;#39;pipety automatyczne:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-200&amp;#39;pipety automatyczne:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-1000&amp;#39;pipety automatyczne:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera i transiluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparatura E-Gel</td><td>Invitrogen</td><td>G6000-08</td><td></td></tr><tr><td>E-Gels</td><td>Invitrogen</td><td>G6018-02</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 1,7 ml. Przezroczyste</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>383-MCT175C</td><td></td></tr><tr><td>przezroczyste probówki Axygen 0,5 ml</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>383-MCT060C</td><td></td></tr><tr><td>probówki do wychwytywania Axygen 2 ml</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>383-MCT200NC</td><td></td></tr><tr><td>pudełka z końcówkami P-10 ART:</td><td>CLP</td><td>BT10XL</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka z końcówkami P-100 ART:</td><td>CLP</td><td>BT200</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka z końcówkami P-20 ART:</td><td>CLP</td><td>BT20</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka z końcówkami ART do pipety P-1000:</td><td>CLP</td><td>BT1000</td><td></td></tr><tr><td>Chipsy drożdżowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterylne jednorazowe pipety 25 ml-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterylne jednorazowe pipety 5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statywy na probówki do mikrowirówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chusteczki KimWipes:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fartuchy laboratoryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolby hodowlane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pętliki do szczepień</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>markery permanentne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawiczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taśma autoklawowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% nadtlenek wodoru</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>386790</td><td></td></tr><tr><td>HBSS bez Ca, Mg i barwnika</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Qiagen RNeasy Mini Kit:</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Qiagen DNase:</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Środek do usuwania RNazy</td><td>Denville Scientific</td><td>D1180</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol Harleco 100%</td><td><a href="http://www.emdchemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>65347</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ENZO IVT</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-42655-10</td><td></td></tr><tr><td>Litykaza: jedna butelka</td><td>VWR international</td><td>IC19012310</td><td></td></tr><tr><td>Woda, stopień do hodowli komórkowych</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>4.86505</td><td></td></tr><tr><td>Kultura drożdży:</td><td>ATCC</td><td>18824</td><td></td></tr><tr><td>proszek do pożywki YPD</td><td><a href="http://www.emdchemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>4.8504</td><td></td></tr><tr><td>D(+) glukoza, bezwodna</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>346351</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>56755</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>4005</td><td></td></tr><tr><td>roztwór SDS, 20%</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>7990-OP</td><td></td></tr><tr><td>Farba do pelletów</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>69049</td><td></td></tr><tr><td>PCI wolny od RNaz i DNaz (7 alikwotów):</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32711-500</td><td></td></tr><tr><td>7,5M NH4OAc</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1987 5980</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do fragmentacji (200 mM Tris-octan, pH 8,1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Fiaher</td><td>50-899-90034</td><td></td></tr><tr><td>KOAc</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9757725</td><td></td></tr><tr><td>MgOA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681042</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik do nakładania próbek</td><td>Invitrogen</td><td>10482055</td><td></td></tr><tr><td>Markery PCR</td><td><a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> EMD Millipore</a></td><td>69278-3</td><td></td></tr><tr><td>Żele Phase Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>FP2302820</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do jednocyklowej syntezy cDNA</td><td>Invitrogen</td><td>A10752-030</td><td></td></tr><tr><td>Zawiera:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP&amp;#39;s</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimeraza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>oligod(T) T-7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml EDTA pH 8,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do syntezy pierwszej nici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaza H z E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do syntezy drugiej nici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA z E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza mikromacierzy dla saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

W niniejszym protokole ekspresja genów u drożdży (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po ekspozycji na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), będącego środkiem utleniającym. W badaniu drożdże są hodowane przez 48 godzin w pożywce YPD 1/2X zawierającej glukozę 3X. Hodowlę dzieli się na grupę kontrolną i badaną. Hodowlę badaną traktuje się roztworem 0.5 mM H2O2 w soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) przez 1 godzinę. Hodowlę kontrolną traktuje się samym HBSS. Z obu hodowli izoluje się całkowite RNA, które w wieloetapowym procesie jest przekształcane w produkt cRNA znakowany biotyną. Końcowy produkt syntezy jest przekazywany do UVM Microarray Core Facility i hybrydyzowany z macierzami Affymetrix yeast GeneChips. Uzyskane dane dotyczące ekspresji genów są następnie wprowadzane do oprogramowania do bioinformatycznej analizy danych.

W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

W niniejszym protokole ekspresja genów u drożdży (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem wodoru...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapoznanie studentów nauk przyrodniczych z technologią mikromacierzy poprzez badanie różnic w ekspresji genów u drożdży poddanych stresowi oksydacyjnemu. Cel ten realizowany jest poprzez wstępną izolację całkowitego RNA z kultur drożdży traktowanych nadtlenkiem wodoru oraz z nie traktowanych kontroli. Drugim krokiem procedury jest synteza i oczyszczanie cDNA z tych próbek RNA.Następnie cDNA jest wykorzystywane do przygotowania znakowanego biotyną cRNA poprzez transkrypcję in vitro. Ostatnim etapem procedury jest fragmentacja znakowanego biotyną cRNA w celu hybrydyzacji z chipami genowymi drożdży AFI metrics. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące różnice w ekspresji w dwóch próbkach drożdży, a za pomocą bioinformatyki zademonstrować studentom studiów licencjackich możliwości analizy mikromacierzy.Zespół Outreach sieci Vermont Genetics Network wpadł na pomysł opracowania tej metody, gdy otrzymał zadanie wprowadzenia technologii microray do studentów nauk przyrodniczych w całym stanie Vermont, aby wzbogacić ich edukację naukową. Do tej pory metoda ta została wdrożona w wielu placówkach w ośmiu uczelniach licencjackich w całym stanie. Główną zaletą wykorzystania modułów dydaktycznych microray jest możliwość nauczania grupy osób ogólnych technik biologii molekularnej, które są stosowane każdego dnia w pracy laboratoryjnej.Możemy również wykorzystać to narzędzie do nauczania zarówno studentów, jak i nauczycieli oraz naszych grup badawczych. W rzeczywistości studenci i profesorowie współpracują razem nad tym samym projektem. Uczą się oni określonych technik wymagających dużej precyzji, takich jak praca z RNA, co nie jest łatwym zadaniem.Uczą się, jak wytrącać DNA przy użyciu odczynników wizualizacyjnych. Mają możliwość zastosowania technik, z którymi zetkną się podczas studiów magisterskich lub w codziennej pracy w laboratoriach biologii molekularnej. Chociaż metoda ta jest odpowiednia do badania stresu oksydacyjnego u drożdży, można ją z pewnością zastosować w odniesieniu do innych organizmów modelowych i innych systemów biologicznych, które mogą Państwo chcieć zbadać.Zmiany w ekspresji genów mogą być związane z procesami rozwojowymi, toksynami środowiskowymi, konkretnymi stanami chorobowymi i wieloma innymi czynnikami. Aby zbadać różnice w ekspresji u drożdży poddanych stresowi oksydacyjnemu, w pierwszej kolejności ekstrahuje się całkowite RNA z dwóch kultur drożdży poprzez lizę enzymatyczną. Jedna kultura została poddana stresowi oksydacyjnemu poprzez godzinną inkubację z 0,5 millimolar nadtlenkiem wodoru w soli fizjologicznej Hanksa (HBSS), podczas gdy druga kultura była traktowana wyłącznie HBSS w celu uzyskania kontroli.W pierwszej kolejności należy opisać dwie probówki do mikrocentrifugowania o pojemności 1,7 ml, wpisując odpowiednie dane identyfikacyjne. Do każdej probówki przenieść 1,5 ml odpowiedniej kultury drożdży. Probówki wirować przy 5 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu za pomocą mikropipety ostrożnie usuń i odrzuć nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przed kontynuowaniem procedury sprawdź, czy osad jest wystarczająco duży. Jeśli osad jest zbyt mały, dodaj 1,5 milliliters kultury do tej samej probówki zawierającej osad, a następnie odwiruj próbkę, aby uzyskać większy osad.Usunąć nadsącz za pomocą mikropipety, usuwając jak największą ilość cieczy z osadu drożdży. Następnie do osadu drożdży dodać 100 µL buforu SG oraz 30 µL roztworu liazy i wymieszać na wortexie. Inkubować obie probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Delikatnie zakręcaj każdą probówką co 10 minut, aby wygenerować sferoplasty. Jednym z najbardziej krytycznych kroków podczas wysiewu sferoplastów drożdży jest upewnienie się, że po traktowaniu faktycznie powstały w stu procentach sferoplasty. Oznacza to, że nie wszystkie enzymy lityczne są jednakowej jakości.Należy sprawdzić, czy zastosowany enzym lityczny zapewnia prawidłowe tworzenie sferoplastów. W tym celu należy przenieść próbki na szkiełko przedmiotowe i poddać je obserwacji mikroskopowej po dodaniu 0,1% SDS, aby potwierdzić formowanie się protoplastów. Aby zaobserwować całkowite tworzenie sferoplastów, należy nanieść 10 µL próbki drożdży na szkiełko przedmiotowe, a następnie podczas obserwacji mikroskopowej dodać 1 µL 0,1% SDS, co spowoduje pęcznienie komórek drożdży i formowanie idealnych sfer lub sferoidów. Ważne jest, aby zaobserwować, że komórki pączkujące również tworzą sferoidy.W przypadku zaobserwowania częściowego osadzania się sferoidów zaleca się przedłużenie inkubacji z liazą. Po potwierdzeniu całkowitego osadzenia sferoidów przy zastosowaniu 350 µL buforu BRLT do każdej probówki, należy dodać 250 µL 100% etanolu. Należy upewnić się, że probówka jest szczelnie zamknięta, mocno trzymając pokrywkę i energicznie mieszając na wirówce typu vortex przez jedną minutę.Niniejsza procedura służy do lizy płytek Sphero. Następnie należy użyć kolumnek wirowych R i easy Z w celu wyizolowania i oczyszczenia RNA z obu kultur. Na koniec należy ocenić jakość wyekstrahowanego RNA, wykorzystując gotowy żel agarozowy 1,2% do elektroforezy, aby przygotować znakowane biotyną cRNA.Całkowity RNA wyekstrahowany z komórek drożdży jest najpierw wykorzystywany do syntezy cDNA poprzez odwrotną transkrypcję. Po otrzymaniu cDNA należy przygotować probówki z żelem Phase Lock do wytrącenia cDNA; wiruj probówki z żelem Phase Lock z maksymalną prędkością przez jedną minutę, aby upewnić się, że żel znajduje się na dnie probówki. Nie mieszaj probówek z żelem Phase Lock w wirówce typu vortex. Aby wytrącić cDNA, pipetuj 162 µL dolnej warstwy mieszaniny tris-buforowanego fenolo-chloroformu i alkoholu izoamylowego o pH 8,0 (mieszanina PCI) i dodaj do 162 µL zawartości probówki z reakcją syntezy drugiej nici cDNA; w tym kroku wymagane są równe objętości mieszanin wodnej i organicznej.Wymieszaj zawartość za pomocą wstrząsarki typu vortex przez pięć sekund. Następnie, używając mikropipety, przenieś całą mieszaninę CD N-A-P-C-I do probówki z żelem fazowym (phase lock gel). Nie używaj wstrząsarki typu vortex do probówki z żelem fazowym; odwiruj ją z maksymalną prędkością przez dwie minuty.Następnie za pomocą mikropipety przenieś górną warstwę z probówki z żelem separacyjnym do nowo oznakowanej probówki o pojemności 1,7 ml. Postaraj się zebrać jak największą ilość tej warstwy. Do probówki wirówkowej 1,7 ml dodaj 405 µL 100% etanolu, 80 µL octanu amonu oraz 1 µL barwnika do osadu i wymieszaj na wortexie.Krótko umieść probówkę w wirówce, kierując zawias probówki na zewnątrz, i wiruj z maksymalną prędkością przez 20 minut. Po zakończeniu wirowania w temperaturze pokojowej ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki, uważając, aby nie naruszyć osadu CD NA. Osad powinien mieć różowy kolor dzięki zastosowanemu barwnikowi i wielkość zbliżoną do ziarnka soli.Obok probówki, pod zawiasem, umieść pellet CD NA na lodzie i niezwłocznie przystąp do jego oczyszczania. Aby rozpocząć procedurę oczyszczania pelletu CD NA, użyj mikropipety P 1000, aby ostrożnie usunąć z probówki cały nadsącz. Należy uważać, aby nie naruszyć pelletu.Do probówki dodaj 500 µL zimnego, 80% etanolu do próbki. Delikatnie zakręć probówkę i powoli odwróć ją kilka razy. Uważnie obserwuj osad, aby upewnić się, że nie oddzielił się on od ścianki probówki.Jeśli osad odklei się od ścianek, można go ponownie osadzić na dnie probówki, umieszczając ją w statywie i pozwalając osadowi opaść na dno lub wirując probówkę z maksymalną prędkością przez 15 sekund. Następnie, używając mikropipety P 1000, należy ostrożnie usunąć etanol, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przechyl probówkę, aby umożliwić usunięcie jak największej ilości cieczy.Dodaj nową porcję zimnego 80% etanolu, zakręć probówkę i powoli odwróć ją kilka razy. Usuń jak najwięcej etanolu za pomocą mikropipety P 1000. Wirowarkuj probówkę z maksymalną prędkością przez pięć sekund.Następnie za pomocą mikropipety P 10 należy usunąć ostatnie kilka mikrolitrów etanolu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Otwartą probówkę umieść w suszarce na 10 do 20 minut, aby odparować pozostały etanol. Po wyschnięciu osad jest łatwy do zgubienia, dlatego należy ostrożnie obchodzić się z probówką i pamiętać o zamknięciu zakrętki.Po zakończeniu suszenia sprawdź wizualnie, czy wysuszony osad znajduje się w probówce. Na koniec resuspenduj wysuszony osad w 22 µL wody wolnej od RNA i umieść probówkę w lodzie. Tak otrzymane cDNA służy następnie do przygotowania cRNA znakowanego biotyną poprzez transkrypcję in vitro z wykorzystaniem zestawu Enzo BioArray.Po oczyszczeniu i ilościowym oznaczeniu znakowanego biotyną cRNA, poddaje się go fragmentacji w celu przygotowania tarcz. Po wygenerowaniu cDNA stosuje się standardową metodologię transkrypcji in vitro w celu otrzymania biotynilowanego cRNA. Przed nałożeniem na chip mikromacierzy cRNA musi zostać poddany fragmentacji.Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś ilość CRNA równoważną 5 µg do oznakowanej probówki PCR o pojemności 0,5 ml. Dodaj odpowiednią ilość wody wolnej od RNaz, aby całkowita objętość wyniosła 16 µl, a następnie dodaj do probówki 4 µl buforu do fragmentacji 5x. Całkowita objętość w probówce powinna wynosić 20 µl.Wymieszać zawartość probówki na wortexie i wirować przez 10 seconds. Następnie inkubować probówkę w temperaturze 94 °C przez 30 minutes. Po inkubacji w termocyklerze umieścić probówkę na lodzie.Fragmentowany i niefragmentowany CRNA z każdej próbki poddaje się następnie ocenie za pomocą elektroforezy z wykorzystaniem gotowego żelu AROS 1,2%. Po zakończeniu procesu żel jest wizualizowany na transiluminatorze i pobierany jest obraz. Końcowy produkt syntezy jest hybrydyzowany z matrycami genowymi drożdży atric, a reprezentatywne wyniki analizy mikromacierzy przedstawiono tutaj.Pierwsza rycina przedstawia przykład zeskanowanego obrazu z macierzy genów atrics drożdży, wygenerowanego przez oprogramowanie sterujące macierzą genów atrics. Jest to dwuwymiarowy wykres rozrzutu wszystkich transkryptów genetycznych, obejmujący około 6 700 genów, porównujący dane z grupy kontrolnej i traktowanej drożdże. Każdy punkt reprezentuje pojedynczy gen.Geny zaznaczone kolorem fioletowym wskazują na geny o różnej ekspresji, natomiast geny zaznaczone na czerwono nie wykazują takiej różnicy. W tym przykładzie większość genów o różnej ekspresji to geny zaangażowane w kontrolę cyklu komórkowego, co wynika z ich opisów. Ten schemat blokowy z bazy danych do wizualizacji adnotacji i zintegrowanego odkrywania ilustruje geny o różnej ekspresji w dotkniętej ścieżce biologicznej.Geny oznaczone czerwoną gwiazdką wskazują geny o obniżonej ekspresji w szlaku mitotycznym. Na koniec przedstawiono reprezentatywne wyniki wykresu wulkanicznego (volcano plot) wygenerowanego przy użyciu oprogramowania geo species gene sifter. Próbki kontrolne i traktowane porównano przy zastosowaniu progu istotności P-value 0,05 oraz progu zmiany ekspresji 1,5-krotnej.Zdecydowaliśmy się na wykorzystanie drożdży, ponieważ łatwo je szybko hodować, ale zdaliśmy sobie sprawę, że najbardziej krytycznym elementem pracy z drożdżami jest w rzeczywistości przygotowanie odpowiedniego wysiewu sferoplastów. Jednym z aspektów, których chcemy uniknąć w mikrotablicach, jest przeprowadzenie niepełnego trawienia i uzyskanie sferoplastów pochodzących wyłącznie z komórek w fazie G1 lub G2/M. W takim przypadku eksperyment z mikrotablicami byłby przeprowadzany na drożdżach znajdujących się w określonej fazie replikacji.Kolejnym skomplikowanym zagadnieniem, które staramy się przybliżyć w tym ćwiczeniu, jest wirowanie DNA w celu otrzymania osadu – proces ten jest często omawiany, ale niekoniecznie jest łatwy do przeprowadzenia. W naszym module zastosowaliśmy specjalistyczne probówki oraz odczynniki do wizualizacji, dzięki czemu możliwe jest odwirowanie DNA i bezpośrednia obserwacja osadu, co ułatwia naukę zarówno studentom, jak i nauczycielom.Dzięki temu może on być wykorzystywany we wszystkich etapach pracy z DNA i RNA po jego opracowaniu. Moduł ten utorował drogę kadrze naukowo-dydaktycznej w instytutach licencjackich do dalszych poszukiwań, potencjalnie w zakresie innych organizmów modelowych lub innych schematów terapeutycznych, które mogłyby być zgodne z istniejącymi programami nauczania lub ich własnymi zainteresowaniami badawczymi. Aby podać przykład niektórych wprowadzonych modyfikacji: jeden ośrodek analizował wpływ działania herbicydu na drożdże, inny badał wpływ leczenia LAMP IDE u drożdży, podczas gdy jeszcze inny skupił się na zmianach rozwojowych w linii komórkowej ssaków, która była dla nich szczególnie interesująca.I na koniec, inny ośrodek zbadał wpływ różnych źródeł światła na rośliny arabidopsis. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak zorganizować eksperyment z wykorzystaniem mikromacierzy ze studentami nauk przyrodniczych, w tym izolację całkowitego RNA z drożdży, generowanie cDNA oraz fragmentację znakowanego biotyną cRNA. Praktyczne doświadczenia z tak zaawansowanymi technologiami pomagają utrwalić i wzmocnić edukację naukową na poziomie studiów licencjackich.

microarray-analysis-for-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący sekwencję RNA do monitorowania poziomów mRNA w czasie podczas niedotlenienia komórek S. cerevisiae. Metodę tę można dostosować do analizy ekspresji genów podczas dowolnej odpowiedzi komórkowej.

Pomiar poziomu mRNA w czasie podczas odpowiedzi niedotlenienia drożdży S. cerevisiae

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.

Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek

Ten protokół przedstawia metodę izolacji chromatyny specyficzną dla locus, opartą na rekombinacji specyficznej dla miejsca, w celu oczyszczenia interesującego miejsca pojedynczej kopii genu w jego natywnym kontekście chromatyny z pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae.

Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae

Struktura wtórna RNA została głównie zaobserwowana w dojrzałym RNA metodami sondowania struktury. Sekwencjonowanie śledzenia struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) jednoczy jądrowy run-on, który był wykorzystywany do badania pozycji polimerazy na powstającym RNA, z wykorzystaniem sondowania struktury. CoSTseq umożliwia tym samym obserwację wtórnej struktury RNA w RNA podczas aktywnej transkrypcji.

Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj analizę mikromacierzy w Saccharomyces cerevisiae poddanym stresie oksydacyjnym. Naucz się izolować RNA, syntetyzować cDNA i przygotowywać sondy biotynowane do hybrydyzacji z chipami genowymi.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów