Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem tej procedury jest zapoznanie studentów kierunków studiów licencjackich z technologią mikromacierzy poprzez zbadanie różnic w ekspresji drożdży poddawanych stresowi oksydacyjnemu. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie całkowitego RNA z kultur drożdży potraktowanych nadtlenkiem wodoru i nietraktowanych kontroli. Drugim etapem procedury jest wygenerowanie i oczyszczenie CDNA z tych próbek RNA.

CDNA jest następnie wykorzystywane do przygotowania CRNA znakowanego biotyną poprzez transkrypcję in vitro. Ostatnim etapem procedury jest fragmentacja CRNA znakowanych biotyną w celu hybrydyzacji z chipami genów drożdży metrycznych AFI. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują różnice w ekspresji w dwóch próbkach drożdży, a dzięki bioinformatyce demonstrują studentom studiów licencjackich moc analizy mikromacierzy.

Zespół Vermont Genetics Network Outreach po raz pierwszy wpadł na pomysł tej metody, gdy powierzono mu dostarczenie technologii mikropromieniowania studentom nauk ścisłych w całym stanie Vermont w celu poprawy ich edukacji naukowej. Do tej pory metoda ta została dostarczona do wielu miejsc w ośmiu szkołach maturalnych w całym stanie. Tak więc główną zaletą korzystania z mikropromieni w modułach dydaktycznych jest to, że daje nam to możliwość nauczania ogólnych technik biologii molekularnej, które są używane na co dzień w całym laboratorium, grupy osób.

Wykorzystujemy to również do nauczania zarówno uczniów, jak i nauczycieli oraz naszych grup. W rzeczywistości mamy studentów i profesorów pracujących razem nad tym samym projektem. Uczą się pewnych technik, które wymagają dużej finezji, takich jak obsługa RNA, co nie jest łatwym zadaniem.

Uczą się, jak wytrącać DNA za pomocą odczynników do wizualizacji. W rzeczywistości mogą korzystać z technik, z którymi zetkną się na studiach magisterskich lub w codziennych laboratoriach biologii molekularnej. Chociaż ta metoda jest odpowiednia do uzyskania wglądu w stres oksydacyjny i drożdże, z pewnością można ją zastosować do innych organizmów modelowych i innych systemów biologicznych, którym możesz chcieć się przyjrzeć.

Ekspresja genów zmienia się, niezależnie od tego, czy są one związane ze zmianami rozwojowymi, toksynami środowiskowymi, określonymi stanami chorobowymi i wieloma innymi. Aby zbadać różnice w ekspresji drożdży poddawanych stresowi oksydacyjnemu, całkowite RNA jest najpierw ekstrahowane z dwóch kultur drożdży za pomocą lizy enzymatycznej. Jedna kultura była narażona na stres oksydacyjny przez godzinne leczenie 0,5 milimolowym nadtlenkiem wodoru w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hanka, podczas gdy druga hodowla była traktowana tylko HBSS jako kontrolą.

Zacznij od oznaczenia dwóch mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,7 mililitra odpowiednimi informacjami identyfikacyjnymi. Przenieś 1,5 mililitra odpowiedniej kultury drożdży do każdej probówki. Odwirować probówki o sile 5 000 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu użyj mikropipety, aby ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. Sprawdź, czy granulka jest wystarczająco duża przed kontynuowaniem procedury. Jeśli osad jest zbyt mały, dodaj 1,5 mililitra kultury do tej samej probówki zawierającej osad, a następnie odwiruj, aby uzyskać większy granulat.

Wyrzuć supernatant za pomocą mikropipety, usuwając jak najwięcej płynu z osadu drożdży. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu SG i 30 mikrolitrów roztworu liazy do wiru granulek drożdży do wymieszania. Inkubować obie probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej podczas inkubacji.

Delikatnie obracaj każdą rurkę co 10 minut, aby wytworzyć płytki. Jednym z najważniejszych kroków podczas posiewania drożdży Sphero jest upewnienie się, że po zabiegu rzeczywiście powstał stuprocentowy Sphero plast. Oznacza to, że nie wszystkie enzymy lityczne są sobie równe.

Musisz więc sprawdzić, czy dobry enzym lityczny zapewnia dobre posiewy sferyczne, co oznacza, że musisz pobrać te próbki, umieścić je na szkiełku mikroskopowym i sprawdzić pod mikroskopem, dodając 0,1% SDS, aby upewnić się, że tworzą się protoplasty. Aby zaobserwować pełne posiewanie sferowe, należy odpipetować 10 mikrolitrów próbki drożdży na szkiełko mikroskopowe, badając próbkę pod mikroskopem przy jednym mikrolitrze 0,1% SDS, aby spowodować pęcznienie komórek drożdży i utworzenie idealnych kulek lub sferoid. Ważne jest, aby zaobserwować, że pączkujące komórki również tworzą sferoidy S.

W przypadku zaobserwowania częściowego posiewu sferologicznego zaleca się przedłużone leczenie liazą. Po potwierdzeniu całkowitego posiewu sferologicznego w 350 mikrolitrach buforu BRLT do każdej probówki, dodaj 250 mikrolitrów 100% etanolu. Upewnij się, że rurka jest szczelnie zakręcona, trzymając pokrywę zamkniętą i energicznie wiruj przez jedną minutę.

Ta procedura spowoduje na płytkach Sphero. Następnie użyj kolumn wirowych R i łatwych Z, aby zebrać i oczyścić RNA z dwóch kultur. Na koniec oceń jakość wyekstrahowanego RNA za pomocą 1,2% prefabrykowanego żelu aros do elektroforezy w celu przygotowania CRNA znakowanego biotyną.

Całkowite RNA wyekstrahowane z komórek drożdży jest najpierw wykorzystywane do syntezy CD NA przez odwrotną transkrypcję. Po wytworzeniu CD NA przygotuj probówki z żelem z blokadą fazową do użycia w probówkach żelowych z wirówką do wytrącania CD NA z pełną prędkością przez jedną minutę, aby upewnić się, że żel znajduje się na dnie probówki. Nie należy wirować probówek z blokadą fazową w celu wytrącenia CD NA, pipetować 162 mikrolitry dolnej warstwy buforowanego chloroformu fenylowego o pH 8,0 tris, alkoholu izoamylowego lub mieszaniny PCI i dodawać do 162 mikrolitrów zawartości drugiej nici, probówka reakcyjna syntezy CD NA równe objętości mieszanin wodnych i organicznych są wymagane do tego etapu.

Wiruj przez pięć sekund, aby wymieszać zawartość. Następnie za pomocą mikropipety przenieś całą mieszaninę CD N-A-P-C-I do probówki z żelem z blokadą fazy. Nie wirować wirówki w probówce z żelem z blokadą fazową z pełną prędkością przez dwie minuty.

Następnie za pomocą mikropipety przenieś górną warstwę z probówki z żelem z blokadą fazową do nowo oznaczonej probówki o pojemności 1,7 mililitra. Postaraj się zebrać jak najwięcej warstwy. Dodaj następujące składniki do mikrorurki wirówkowej o pojemności 1,7 mililitra, 405 mikrolitrów 100% etanolu, 80 mikrolitrów octanu amonu i jeden mikrolitr wiru farby w postaci granulek.

Na krótko umieść probówkę w wirówce zawiasami probówki skierowanymi na zewnątrz i wiruj z pełną prędkością przez 20 minut. W temperaturze pokojowej, po zakończeniu wirowania, delikatnie wyjmij probówkę z wirówki, uważając, aby nie naruszyć osadu CD NA. Granulka powinna być różowa ze względu na farbę granulowaną i mniej więcej wielkości ziarna soli.

A z boku rurki pod zawiasem umieść granulat CD NA na lodzie i natychmiast przystąp do czyszczenia pelletu. Aby rozpocząć procedurę czyszczenia osadu CD NA, należy użyć mikropipety P 1000, aby ostrożnie usunąć cały supernatant z probówki. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.

Jest to twoja próbka o pojemności 500 mikrolitrów zimnego, 80% etanolu do probówki. Delikatnie zakryj rurkę i odwróć ją powoli kilka razy. Obserwuj swój pellet bardzo uważnie, aby upewnić się, że nie odczepił się od boku tuby.

Jeśli granulka zostanie odłączona, możesz sprowadzić ją z powrotem na dno probówki, umieszczając probówkę z powrotem w stojaku i pozwalając granulce osiąść na dnie lub odwirowując probówkę z pełną prędkością przez 15 sekund. Następnie użyj mikropipety P 1000, aby ostrożnie usunąć etanol, nie naruszając granulatu. Przechyl rurkę, aby umożliwić usunięcie jak największej ilości płynu.

Dodaj nową Eloqua zimnego, 80% etanolu, zakryj rurkę i powoli odwróć ją kilka razy. Po usunięciu całego etanolu możliwe za pomocą mikropipety P 1000. Wirować probówkę z pełną prędkością przez pięć sekund.

Następnie użyj mikropipety P 10, aby usunąć ostatnie kilka mikrolitrów etanolu bez naruszania granulatu. Umieść otwartą probówkę w suszarce na 10 do 20 minut, aby odparować pozostały etanol. Po wyschnięciu pelety łatwo się zgubić, dlatego należy uważać, aby delikatnie obchodzić się z tubką i zamykać nakrętkę.

Po zakończeniu suszenia zwizualizuj wysuszony granulek, aby potwierdzić, że jest obecny w probówce. Na koniec ponownie zawieś wysuszony granulat w 22 mikrolitrach wody wolnej od RNA i umieść probówkę na lodzie. Ta CDNA jest następnie wykorzystywana do przygotowania CRNA znakowanej biotyną poprzez transkrypcję in vitro przy użyciu zestawu Enzo BioArray.

Po oczyszczeniu i określeniu ilościowym CRNA znakowanego biotyną, jest on rozdrabniany w celu przygotowania celu. Po wygenerowaniu CDNA stosujemy standardową metodologię transkrypcji in vitro w celu wygenerowania biotynylowanego CRNA. CRNA musi przejść przez fragmentację, zanim będzie można go zastosować do chipa mikropromieniowego.

Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś ilość odpowiadającą pięciu mikrogramom CRNA do oznakowanej 0,5 mililitrowej probówki PCR. Dodaj wystarczającą ilość wolnej wody RNA, aby uzyskać całkowitą objętość do 16 mikrolitrów, a następnie dodaj cztery mikrolitry pięciokrotnego buforu fragmentacyjnego do probówki. Całkowita objętość w tubie powinna wynosić 20 mikrolitrów.

Wirować probówkę i wirować przez 10 sekund. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez 30 minut. W termocyklerze umieść probówkę na lodzie po inkubacji.

Rozdrobniony i nierozdrobniony CRNA z każdej próbki jest następnie oceniany za pomocą elektroforezy przy użyciu 1,2% prefabrykowanego żelu AROS. Po zakończeniu przebiegu żel jest wizualizowany na transluminatorze i uzyskiwany jest obraz. Końcowy produkt syntezy jest hybrydyzowany z chipami genowymi drożdży atrycznych, a reprezentatywne wyniki analizy mikromacierzy przedstawiono tutaj.

Ten pierwszy rysunek jest przykładem zeskanowanego obrazu chipa genu drożdży atrics wygenerowanego przez oprogramowanie operacyjne chipa genu atrics. Jest to wykres rozrzutu 2D wszystkich transkryptów genetycznych, około 6 700 genów porównujących dane kontrolne i leczone drożdżami. Każdy punkt reprezentuje pojedynczy gen.

Geny pokolorowane na fioletowo wskazują geny, które są wyrażane w różny sposób, podczas gdy geny oznaczone na czerwono nie. W tym przykładzie większość genów o zróżnicowanej ekspresji to geny zaangażowane w kontrolę cyklu komórkowego, jak wskazują ich opisy. Ten schemat blokowy z bazy danych do wizualizacji adnotacji i zintegrowanego odkrywania ilustruje geny o zróżnicowanej ekspresji w dotkniętym szlaku biologicznym.

Geny oznaczone czerwoną gwiazdą wskazują na obniżoną regulację genów w szlaku miotycznym. Na koniec przedstawiono reprezentatywne wyniki wykresu wulkanicznego wygenerowanego za pomocą oprogramowania do przesiewania genów gatunków geologicznych. Próbki kontrolne i poddane działaniu substancji porównano z wartością odcięcia wartości P wynoszącą 0,05 i 1,5-krotną zmianą ekspresji.

Zdecydowaliśmy się użyć drożdży, ponieważ drożdże są łatwe w szybkim wzroście, ale zdaliśmy sobie również sprawę, że najważniejszą częścią pracy z drożdżami jest stworzenie przyzwoitego poszycia sferowego. Jedną z rzeczy w mikromacierzy, której nie chcemy robić, jest niepełne trawienie i właściwie tylko komórki sferoplastowe, które są w fazie G jeden lub G 2 M. A potem przeprowadzasz eksperyment z mikromacierzą na drożdżach, które są w określonej fazie replikacji.

Kolejną skomplikowaną kwestią, którą staramy się zwrócić na siebie w tym ćwiczeniu, jest to, że granulowanie CD NA, o którym ludzie mówią codziennie, ale niekoniecznie jest to łatwe. To, co zrobiliśmy w naszym module, to użycie specjalistycznych probówek i odczynników do wizualizacji. Możemy więc odkręcić DNA i zobrazować apel, co ułatwia pracę zarówno uczniom, jak i nauczycielom.

Dzięki temu może być stosowany we wszystkich fazach pracy DNA i RNA po jego opracowaniu. Ten moduł naprawdę utorował drogę wykładowcom w instytutach maturalnych do eksploracji, być może przyglądając się innym organizmom modelowym lub innym schematom leczenia, które mogą być zgodne z istniejącymi programami nauczania lub ewentualnie ich własnymi zainteresowaniami badawczymi. Aby dać wam przykład niektórych modyfikacji, które zostały wprowadzone, było jedno miejsce, które przyglądało się wpływowi leczenia herbicydami na drożdże lub inne, które przyglądało się leczeniu LAMP IDE u drożdży, podczas gdy inne miejsce przyglądało się zmianom rozwojowym w linii komórkowej ssaków, które były szczególnie zainteresowane.

I wreszcie, w innym miejscu przyjrzano się wpływowi różnicowych źródeł światła na rzodkiewnik lub rośliny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić eksperyment mikropromieniowy ze studentami nauk ścisłych, w tym izolację całkowitego RNA z drożdży, wytwarzanie CDNA i fragmentację CRNA znakowanego biotyną. Praktyczne doświadczenia z technologiami na tak wysokim poziomie pomagają wzmocnić i wzmocnić edukację w zakresie nauk ścisłych na poziomie licencjackim.