Name: Analiza lizosomowa z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w ludzkich fibroblastach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-17T12:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny starzenia komórkowego z wykorzystaniem barwnika LysoTracker Deep Red do wizualizacji lizosomów w żywych fibroblastach IMR-90. Protokół umożliwia pomiar przebudowy lizosomalnej jako wskaźnika obciążenia senescencją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie zostało sfinansowane przez granty NIH R15CA274603 dla JAM i TJB, R56DE033253 dla ML, ST i JAM oraz R01GM125870, 1R41AG081123 dla ST i JAM. Schematyczne ilustracje zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

Komórki IMR-90 to uznaną linię komórek fibroblastów ludzkich i nie stanowią badań na ludzkich podmiotach. Nie wymagano zgody etycznej ani zgody na udział w badaniu. Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego Uniwersytetu w Albany, Państwowego Uniwersytetu Nowego Jorku, dotyczącymi pracy z liniami komórek pochodzenia ludzkiego w warunkach Biosafety Level 2 (BSL-2).
1. Ogólne przygotowanie i przegląd przepływu pracy
<ol>
	<li>Zdefiniuj cel eksperymentu jako analizę profilowania lizosomałów w żywych komórkach za pomocą barwienia LysoTracker Deep Red i żywego barwnika jądrowego w celu ilościowego określenia remodelacji lizosomałów jako ciągłego odczytu obciążenia senescencją w komórkach IMR-90. Zdefiniuj podstawowe porównanie biologiczne jako jedno z następujących projektów:
	<ol>
		<li>Indukcja senescency vs. dopasowane nieindukujące kontrolę.</li>
		<li>Warunki wysokiej senescency vs. niskiej senescency w serii dawki lub czasowej.</li>
		<li>Warunki wysokiej senescency traktowane senolitykiem vs. kontrola wysokiej senescency traktowana pojazdem.</li>
		<li>Seria leczenia senolitycznego obejmująca zarówno grupę niskie senescency jako bazę wyjściową, jak i grupę wysokiej senescency.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustal minimalną strukturę kontroli dla wszystkich eksperymentów.
	<ol>
		<li>Uwzględnij grupę kontrolną niskiej senescency dopasowaną pod względem gęstości sadzenia, czasu barwienia i ustawień obrazowania.</li>
		<li>Uwzględnij grupę wysokiej senescency wygenerowaną przez zdefiniowany czynnik senescency lub przez senescencję replikacyjną późnej pasaży.</li>
		<li>Uwzględnij replikaty biologiczne dla każdego warunku i przeprowadź barwienie i obrazowanie o identycznym czasie w całych warunkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdefiniuj odczyty testowe jako bezpośrednie obrazowano-metryczne miary remodelacji lizosomałów:
	<ol>
		<li>Zmierzyć średnią intensywność LysoTrackera na komórkę wewnątrz maski lizosomalnej za pomocą jednolitego progu intensywności jako podstawowego odczytu testowego. Na poziomie pojedynczej komórki, ta metryka oddziela warunki niskiej senescency od warunków wysokiej senescency z największą wielkością efektu i jest niewrażliwa na gęstość jąder na poziomie pola (Dodatkowa Figura 1).</li>
		<li>Zarejestruj następujące jako wtórne odczyty, które dokumentują ekspansję kompartymentu, ale są bardziej wrażliwe na wybory segmentacji lub gęstość jąder na poziomie pola: wzbogaconą lizosomałowo powierzchnię na komórkę i zintegrowaną intensywność LysoTrackera na jądro na poziomie pola. Zintegrowana intensywność na jądro jest informacyjna w dobrze zasiedlonych polach, ale staje się niestabilna, gdy pole zawiera małą liczbę jąder, ponieważ normalizacja na jądro dominuje przez pojedyncze komórki.</li>
		<li>Zarejestruj opcjonalne liczby punktów lizosoma i metryki ich wielkości, gdy rozdzielczość obrazowania pozwala na rozróżnienie punktów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj barwienia związanego z senescencją β-galaktozydazą (SA-β-Gal) jako opcjonalnego etapu walidacji wykonywanego na równoległych dołach lub dopasowanych próbkach, w zależności od ograniczeń eksperymentalnych. Użyj tej walidacji, aby potwierdzić, że kultury późnej pasaży wykazują zwiększoną SA-β-Gal pozytywność w porównaniu z kulturami wczesnej pasaży.</li>
	<li>Standaryzuj test w różnych warunkach, ustalając następujące zmienne przed zebraniem danych:
	<ol>
		<li>Koncentracja robocza LysoTrackera (75 nM) i czas barwienia (30 min).</li>
		<li>Identyczność i zakres koncentracji roboczych barwników jądrowych (np. Hoechst 33342 w zakresie od 1 µg/mL do 2 µg/mL).</li>
		<li>Parametry obrazowania, w tym powiększenie obiektywu, czas ekspozycji, intensywność oświetlenia, binning i strategia fokusu.</li>
		<li>Format płytki i konfiguracja obrazowania (jasne płytki obrazowania z dnem lub płytki ze szklanym dnem), w tym układ dołków replikat.</li>
		<li>Wybór progów i normalizacja intensywności.
		<ol>
			<li>Zastosuj pojedynczy stały próg intensywności do kanału LysoTrackera we wszystkich dołkach w obrębie eksperymentu, aby zdefiniować maskę lizosomalną.</li>
			<li>Wybierz próg raz podczas konfiguracji testu za pomocą zestawu kalibracyjnego pól obejmującego oczekiwany zakres intensywności (np. dwa pola niskiej senescency i dwa pola wysokiej senescency) i utrzymaj go stały w całych dołkach w tej sesji; dopuszczenie, aby próg zmieniał się na poszczególne dołki, wprowadza krągłą zależność między pomiarem a wynikiem.</li>
			<li>W przypadku porównań między eksperymentami, nabywaj wszystkie warunki w jednej sesji w jednakowych ustawieniach mocy lasera, ekspozycji i wzmocnienia oraz podawaj te ustawienia w legendzie do figury.</li>
			<li>Jeśli wymagane są porównania absolutnej intensywności między sesjami, uwzględnij fluorescencyjny standard referencyjny (np. referencyjną płytkę z kulkami lub ustaloną referencyjną komórkę) i normalizuj zmierzone intensywności odpowiednio. 
			UWAGA: Nie porównuj surowych wartości intensywności między sesjami bez identycznych ustawień pozysk

Autorzy nie mają żadnych sporów interesu do ujawnięcia.

Niniejszy protokół opisuje przepływ pracy do obrazowania komórek in vivo, który mierzy starzenie się komórek poprzez przebudowę lizosomu i daje ilościowe wyniki obciążenia starzeniowym na poziomie pojedynczej komórki i dołka. Kilka kroków jest szczególnie istotnych dla uzyskania wiarygodnego testu. Po pierwsze, sam model biologiczny musi być dobrze kontrolowany. Indukcja starzenia się replikacyjnego w fibroblastach IMR-90 wymaga starannego śledzenia podwójnych populacji i równoległego utrzymywania kultur wczesnych przejś...

Senescencja komórkowa to trwały program zatrzymania cyklu komórkowego aktywowany przez różne stresy i czynniki związane ze starzeniem1,2,3,4. Komórki senescencyjne są klasycznie identyfikowane przez konstelację markerów, ponieważ żaden pojedynczy marker nie jest całkowicie specyficzny. Charakterystyczne cechy to powiększona, spłaszczona morfologia komórek, senescencyjno-związana aktywność β-galaktozydazy (SA-β-Gal), tworzenie ognisk uszkodzeń DNA i pro-zapalny profil sekrecyjny (SASP)2,4,5. Wśród tych cech, przebudowa lizosomu wyłoniła się jako wybitna i funkcjonalnie znacząca cecha senescencji6,7. Komórki senescencyjne wykazują głębokie zmiany lizosomalne, w tym dramatyczną ekspansję wielkości i liczby lizosomu wraz ze zmienioną funkcją (często z uwzględnieniem częściowej neutralizacji pH lizosomalnego i akumulacji niszczerzałego materiału)6,7,8,9. Ta lizosomalna ekspansja przyczynia się do zwiększonej aktywności SA-β-Gal, ustanowionego markera senescencji, który odzwierciedla podwyższoną aktywność β-galaktozydazy lizosomalnej w komórkach senescencyjnych10,11,12. Rzeczywiście, barwienie SA-β-Gal wykorzystuje to zjawisko poprzez stosowanie inkubacji o suboptymalnym pH (6,0), aby selektywnie wykrystalizować barwnik w lizosomach komórek senescencyjnych, które zgromadziły enzym i wykazują wyższe pH niż komórki młode10,12,13.
Lizosomy odgrywają centralne role w obrocie białek i sygnalizacji, a ich dysregulacja jest obecnie uważana za charakterystyczną cechę starzenia się i senescencji1,2,4,6. Komórki senescencyjne często wykazują dysfunkcję lizosomalną, co widać na podstawie podwyższonego pH luminalnego, zmienionej aktywności enzymatycznej i akumulacji lipofuscyny (autofluorescencyjny pigment utlenionych makrocząsteczek)6,14. Biogeneza lizosomalna jest często zwiększona lub zmieniona poprzez skoordynowaną ekspresję i regulację lizosomalną (CLEAR) pod kontrolą czynnika transkrypcyjnego EB (TFEB) i powiązanych czynników6,7,15. Ten proces może zwiększyć masę lizosomalną w komórkach senescencyjnych, gdy adaptują się do stresu poprzez zwiększenie komponentu degradacyjnego6,7,10. Z drugiej strony, komórki senescencyjne mogą również doświadczać obniżenia funkcji lizosomalnej (np. zmniejszona kwasowość), co może wpływać na procesy takie jak autofagioza i sprawiać oporność na pewne stresy, w tym ferroptotyczną śmierć komórki6,8. Dlatego pomiar zawartości i funkcji lizosomalnej jest kluczowy dla zrozumienia i identyfikacji senescencji6,16.
LysoTracker Deep Red to przenikający błony fluoryscencyjny probnik, który selektywnie gromadzi się w kwaśnych organellach poprzez protonowo napędzane uwięzienie przez błonę lizosomalną16,17. Powstały sygnał odbija połączoną objętość kwaśnego komponentu, siłę gradientu protonowego i lokalną dostępność barwnika, a nie masę lizosomalną, i może się zmieniać wraz ze zmianami pH lizosomalnego lub stanu błony, które występują niezależnie od łącznej liczby lizosomu6,16. W kontekście senescencji komórkowej, komórki wykazują rozszerzone i bardziej intensywnie oznakowane przedziały LysoTracker-dodatnie w porównaniu z przed-senescencyjnymi odpowiednikami9, zgodnie z ekspansją kwaśnego komponentu organelli i zwiększoną biogenezą lizosomalną zgłoszoną przez badania biochemiczne i ultrastrukturalne6,7,10. To podejście do żywych komórek oferuje kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnym końcowym barwieniem SA-β-Gal: umożliwia ilościową i przestrzennie rozdzielczną analizę pojedynczych komórek, może być łączone z innymi fluoryscencyjnymi reporterami, nie wymaga fiksacji i rejestruje różnorodność poprzez raportowanie ciągłych cech, a nie binarnego punktu końcowego6,16. Przez cały ten protokół, sygnał LysoTracker jest używany jako odczyt komponentu kwaśnego organelli w żywych komórkach, a zmiany zależne od warunków są interpretowane odpowiednio, a nie trakt

<table><tbody><tr><td>24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229124</td><td>Każda przezroczysta multi-wellowa płytka kulturalna z dnem, kompatybilna z fluorescencyjnym obrazowaniem żywych komórek (np. 6-, 12- lub 24-wellowe płytki polistyrenowe; płytki szklano-denne mogą być preferowane dla wyższej rozdzielczości obrazu).</td></tr><tr><td>Beta-galaktozydaza zestaw barwienia (senescencja assay)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9860</td><td>Każdy komercyjny SA-β-galaktozydaza zestaw z zweryfikowanym buforem barwiącym przy pH 6.0. Dla odniesienia, roztwór fiksujący zawiera 2% formaldehydu i 0,2% glutaraldehydu w PBS, a roztwór barwiący zawiera 1 mg/mL X-gal w DMF, 40 mM cytrynian/fosforan pH 6.0, 5 mM potasu ferrocyjanku, 5 mM potasu ferrycyjanku, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2.</td></tr><tr><td>BioRender (oprogramowanie do naukowych ilustracji)</td><td>BioRender</td><td>N/A &mdash; aplikacja internetowa</td><td>Służy do tworzenia schematycznych rysunków (Rysunki 1&ndash;3). https://www.biorender.com</td></tr><tr><td>Dwutlenek węgla (CO2), skompresowany cylinder</td><td>Airgas (lub podobny dostawca)</td><td>N/A</td><td>CO2 medycznej klasy używany do utrzymania 5% atmosfery w inkubatorze do hodowli komórkowej i komorze do obrazowania na scenie.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodowa (FBS), wyłączona termicznie</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10082147</td><td>Każda surowica bydlęca płodowa o klasie kultury komórkowej, wyłączona termicznie w 56 °C; używana w 10% v/v w pełnym medium kulturowym.</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny z funkcją żywych komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF7000</td><td>Każdy szerokopolowy lub konfokalny mikroskopek fluorescencyjny z kontrolą temperatury i CO2 dla żywych komórek, zestawy filtrów dla daleko-czerwonych (ekscytacja ~647 nm / emisja ~670 nm) i DAPI/Hoechst (ekscytacja ~405 nm / emisja ~460 nm) kanałów oraz obiektyw 20×-40× z wystarczającym NA do rozdzielania cech lizosomalnych. W tym badaniu użyto Systemu Obrazowania EVOS M7000.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 barwnik jądrowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Komórkoprzenikalny barwnik DNA do barwienia jądra żywych komórek (niebieska fluorescencja, ekscytacja ~405 nm). Nie może być zamieniany z DAPI, która nie przenika przez komórkę w warunkach fizjologicznych.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazów</td><td>Python Software Foundation</td><td>N/A</td><td>Każde środowisko obliczeniowe naukowe wspierające segmentację jądra, rozszerzenie regionu komórka-jądro, progowanie intensywności i podstawową statystykę obrazu (np. Python z scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). SenTrack pipeline (patrz Plik Suplementarny S1) został opracowany na potrzeby tego badania.</td></tr><tr><td>IMR-90 ludzkie fibroblasty płucne (linia komórkowa)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Normalna linia komórkowa fibroblastów płodowych ludzkich diploidalnych używana do modelowania senescencji replikacyjnej; można zastąpić dowolną podobnie scharakteryzowaną linią fibroblastów ludzkich.</td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>L12492</td><td>Acydotropowy fluorescencyjny barwnik do barwienia żywych komórek kwaśnych organelli; dostarczany jako 1 mM stock w DMSO. Koncentracja robocza wynosi 75nM w przygotowanej kulturze komórkowej.&nbsp; Emisja daleko-czerwona (ex 647 nm / em 668 nm) minimalizuje nakładanie się z autofluorescencja lipofuscyny, ale jej nie eliminuje.</td></tr><tr><td>Minimalne środowisko Essential Medium (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11-095-080</td><td>Podstawowe środowisko kultury dla fibroblastów IMR-90; uzupełnione o 10% FBS i 1% penicylinę-streptomycynę. Można zastąpić dowolną standardową formułę Eagle's Minimalnego Essential Medium z solami Earle's i L-glutaminą.</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny (100×)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15140122</td><td>Dodatek antybiotyczny do pełnego medium kultury; stosuje się w 1% v/v (końcowe stężenie 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny). Można zastąpić dowolnym standardowym roztworem pen-strep.</td></tr><tr><td>Środowisko do obrazowania bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>A1896701</td><td>Środowisko DMEM lub HBSS bez czerwieni fenolowej używane do obrazowania żywych komórek w celu zmniejszenia fluorescencji tła podczas akwizycji. FluoroBrite DMEM jest jedną z powszechnie używanych opcji; można zastąpić dowolnym środowiskiem do obrazowania bez czerwieni fenolowej, uzupełnionym o 10% FBS.</td></tr><tr><td>Phosphat buffered saline (PBS), pH 7.4 (1×)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td>Bufor izotoniczny do płukania komórek i rozcieńczania reagentów; można zastąpić dowolnym sterylnym 1× PBS o pH 7.4.</td></tr><tr><td>SenTrackLite v0.5.0 (oprogramowanie)</td><td>Open-Source (Estrada / Melendez Lab)</td><td>v0.5.0</td><td>Otwartoźródłowa jednoplikowa aplikacja Python / Tkinter do analizy obrazów senescencji lizosomalnej. Dystrybuowana jako Plik Suplementarny S1. Archiwizowana na Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. Licencja MIT. Źródło: https://github.com/gold

analiza lizosomalna z użyciem lysotracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich

Lysosomal Profiling With LysoTracker For Quantitative Assessment of Cellular Senescence In Human Fibroblasts

Senescencja komórkowa to stabilny stan zatrzymania cyklu komórkowego związany z charakterystycznymi fenotypami, w tym powiększoną morfologią komórek, zmienionymi sygnałami sekrecyjnymi i wyraźną przebudową lizosomu. Komórki senescencyjne zwykle wykazują rozszerzenie kwaśnego przedziału endo-lizosomalnego, któremu towarzyszą zmiany w kwasowości światła i zdolności degradacyjnej, co stwarza możliwość prostych pomiarów żywych komórek związanych z przebudową organelli związaną z senescencją. Praca opisuje protokół obrazowania żywych komórek, który wykorzystuje LysoTracker Deep Red, kwasowy fluorescujący barwnik, aby zapewnić pośredni, zależny od pH zastępczy wskaźnik kwaśnego przedziału organelli jako korelat obciążenia senescencją. Metoda jest demonstrowana na ludzkich fibroblastach płucnych IMR-90 przechodzących replikacyjną senescencję w trakcie kolejnych przeszczepów. Protokół szczegółowo opisuje hodowlę komórek i śledzenie przeszczepów, barwienie LysoTracker, obrazowanie fluorescencyjne i oparte na obrazie pomiary intensywności sygnału lizosomalnego oraz obszaru sygnału dodatniego na komórkę. Barwienie senescencyjnej β-galaktozydazy (SA-β-Gal) na równoległych kulturach jest dołączone jako opcjonalny marker potwierdzający, a nie jako standard odniesienia. Przedstawione wyniki pokazują wyższy sygnał kwasowego fluorescującego barwnika i większe regiony lizosomu dodatnie w kulturach późnego przeszczepu niż w kontrolach wczesnego przeszczepu, co jest zgodne z rozszerzeniem kwaśnego przedziału organelli podczas senescencji. Ponieważ odczyt zależy od objętości przedziału, gradientu protonów i dostępności barwnika, najlepiej interpretować go jako pośredni korelat przebudowy lizosomu, a nie bezpośrednie miara liczby lub biogenezy lizosomu. Protokół jest prosty w adaptacji i może być dostosowany do innych typów komórek lub stresów indukujących senescencję, zapewniając praktyczną, ilościową alternatywę dla konwencjonalnych testów końcowych.

Zastosowanie tego protokołu do fibroblastów IMR-90 w warunkach niskiego i wysokiego starzenia się przynosi ilościowe wyniki czynności lizosomowe, które można podsumować na poziomie pojedynczej komórki, a w razie potrzeby również na poziomie całego pola.
Przedstawione zestawy danych pochodzi z pojedynczego eksperymentu biologicznego, porównującego kultury IMR-90 w przebiegu 13 (P13; niska starczność, ~PDL 26) i przebiegu 23 (P23; wysoka starczność, ~PDL 46). Dwa dołki dla każdego warunku został...

Ten artykuł przedstawia protokół LysoTracker dla żywych komórek w celu zmierzenia remodelacji lizosomalnej podczas starzenia się w fibroblastach ludzkich IMR-90.

Analiza lizosomalna z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich

Cellular senescence is a stable cell-cycle arrest state associated with characteristic phenotypes, including enlarged cell morphology, altered secretory ...

Badamy senescencję komórkową i jej charakterystykę, skupiając się na tym, jak cechy takie jak zmiany w lizosomom mogą służyć jako markery starzenia. Konwencjonalne markery starzenia są często oparte na punkcie końcowym i są binarne, podczas gdy obrazowanie żywych komórek może odczytywać starzenie się jako ciągły, ilościowy sygnał w różnych warunkach. Na początek zasiewamy fibroblasty IMR-90 w 24-dołkowej płytce i inkubują je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla, aż uformują się w podkonfluencyjną monowarstwę.Rejestruj gęstość siewu i czas między posadzeniem a barwieniem lizosomalnym dla każdego eksperymentu. Rozgrzej kompletne medium hodowlane do 37 stopni Celsjusza. Przygotuj 75 nanomolarowy roztwór roboczy LysoTracker Deep Red w medium i chron go przed światłem.Delikatnie wymieszaj roztwór roboczy przez lekko wstrząsające odwrócenie. Wybierz dobrane grupy fibroblastów IMR-90 przed-senescencyjnych i senescencyjnych przygotowanych przy użyciu określonej metody indukcji starzenia. Potwierdź fenotyp senescencyjny monitorując cechy wzrostu i morfologię.Odpompuj wyczerpane medium z każdego dołka. Delikacie dodaj roztwór roboczy LysoTracker wzdłuż ścia

lysosomal-profiling-with-lysotracker-for-quantitative-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film ilustruje test oparty na cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania komórek raka starczego wywołanego terapią za pomocą podwójnych markerów starzenia. Wykrywanie i kwantyfikacja komórek starczych wymaga użycia substratu β-galaktozydazy. Substrat jest rozszczepiany przez aktywną lizosomalną β-galaktozydazę w komórkach starczych, wytwarzając produkt fluorescencyjny, który w połączeniu z granulkami autofluorescencyjnej lipofuscyny oznacza starcze komórki rakowe.

Kwantyfikacja starzejących się komórek nowotworowych wywołanych terapią za pomocą cytometrii przepływowej

Czy starzenie się zapobiega lub sprzyja nowotworzenia, pozostaje kwestią sporną. Ponieważ leki chemoterapeutyczne mogą indukować starzenie się komórek rakowych, badanie starzenia się jest niezbędne do zaproponowania nowych terapii. Jednak standardowy i szeroko stosowany test β-galaktozydazy ma poważne wady. Proponujemy tutaj szybki i czuły test oparty na cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia starzenia.

Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

Starzenie się komórek, nieodwracalny stan zatrzymania cyklu komórkowego, może być wywołane przez różne stresy komórkowe. W tym miejscu opisujemy protokoły indukowania starzenia się komórek oraz metody oceny markerów starzenia.

Techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek

Tutaj omawiamy szereg protokołów do indukcji i walidacji starzenia się komórek w hodowanych komórkach. Skupiamy się na różnych bodźcach wywołujących starzenie i opisujemy kwantyfikację powszechnych markerów związanych ze starzeniem się. Przedstawiamy szczegóły techniczne na przykładzie fibroblastów, ale protokoły można dostosować do różnych modeli komórkowych.

Indukcja i walidacja starzenia się komórek w pierwotnych komórkach ludzkich

Wykazano, że wewnątrzkomórkowy ROS odgrywa ważną rolę w indukcji starzenia się komórek. W tym miejscu opisujemy czuły test do ilościowego określania poziomów ROS podczas starzenia się komórek. Udostępniamy również protokoły oceny fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się, który podobno przyczynia się do różnych dysfunkcji związanych z wiekiem.

Ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się w normalnych ludzkich fibroblastach podczas starzenia się wywołanego onkogenem

Starzenie się komórek jest kluczowym czynnikiem w rozwoju przewlekłych patologii związanych z wiekiem. Identyfikacja środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki starcze daje nadzieję na wydłużenie procesu starzenia się w dobrym zdrowiu. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test do badań przesiewowych w celu identyfikacji senoterapeutyków na podstawie pomiaru aktywności związanej ze starzeniem β-galaktozydazy w pojedynczych komórkach.

Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Ten protokół opisuje proces metabolicznego znakowania starzejących się i niedzielących się komórek za pomocą pulsacyjnego SILAC, nieukierunkowaną analizę spektrometrii mas i uproszczone obliczanie okresów półtrwania białek.

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Przedstawiono protokół fluorescencyjnej, cytometrycznej cytometrii przepływowej starzejących się komórek nowotworowych indukowanych przez chemioterapię w hodowli komórkowej lub w mysich modelach nowotworów. Opcjonalne procedury obejmują współbarwienie immunologiczne, utrwalanie próbki w celu ułatwienia analizy dużych partii lub punktów czasowych oraz wzbogacanie żywotnych komórek starczych przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej.

Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej

Multipleksowa immunofluorescencja umożliwia sekwencyjne oznaczyć wiele markerów przeciwciał w obrębie pojedynczej sekcji tkanki, aby wspierać przestrzenną analizę architektury tkanki i populacji komórek. Tutaj przedstawiono przepływ pracy dla wielokrotnego wykrywania markerów związanych z starzeniem się, strukturalnych i immunologicznych, łącznie z manualną i zautomatyzowaną przygotowaniem szkieł i iteracyjnym obrazowaniem oraz analizą pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania do cyfrowej...

Wielobarwne badanie immunofluorescencyjne do przestrzennej oceny markerów starzenia in vivo

Ten protokół przedstawia mikroskopie konfokalną światła odbitego do obiektywnej, pojedynczej komórkowej detekcji aktywności senescencji związanej z beta-galaktozydazą (SA-β-gal) w frakcji naczyniowej stromy izolowanych z ludzkiego tkanki tłuszczowej. Metoda jest kompatybilna z immunocytochemią, zawiera kontrole pH do oceny ilościowej i dodatkowo zapewnia bardziej wrażliwą i mniej subiektywną alternatywę dla konwencjonalnego barwienia SA-β-gal.

Wykrywanie starzenia się przy użyciu odbitego światła w frakcji naczyniowej tkanki tłuszczowej

Poznaj metodę ilościowej oceny starzenia komórkowego z wykorzystaniem barwnika LysoTracker Deep Red do wizualizacji lizosomów w żywych fibroblastach IMR-90. Protokół umożliwia pomiar przebudowy lizosomalnej jako wskaźnika obciążenia senescencją.

Analiza lizosomalna z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich

Przeglądaj więcej filmów