Analiza lizosomalna z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich
17 lipca 2026
Ten artykuł przedstawia protokół LysoTracker dla żywych komórek w celu zmierzenia remodelacji lizosomalnej podczas starzenia się w fibroblastach ludzkich IMR-90.
Badamy senescencję komórkową i jej charakterystykę, skupiając się na tym, jak cechy takie jak zmiany w lizosomom mogą służyć jako markery starzenia. Konwencjonalne markery starzenia są często oparte na punkcie końcowym i są binarne, podczas gdy obrazowanie żywych komórek może odczytywać starzenie się jako ciągły, ilościowy sygnał w różnych warunkach. Na początek zasiewamy fibroblasty IMR-90 w 24-dołkowej płytce i inkubują je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla, aż uformują się w podkonfluencyjną monowarstwę.
Rejestruj gęstość siewu i czas między posadzeniem a barwieniem lizosomalnym dla każdego eksperymentu. Rozgrzej kompletne medium hodowlane do 37 stopni Celsjusza. Przygotuj 75 nanomolarowy roztwór roboczy LysoTracker Deep Red w medium i chron go przed światłem.
Delikatnie wymieszaj roztwór roboczy przez lekko wstrząsające odwrócenie. Wybierz dobrane grupy fibroblastów IMR-90 przed-senescencyjnych i senescencyjnych przygotowanych przy użyciu określonej metody indukcji starzenia. Potwierdź fenotyp senescencyjny monitorując cechy wzrostu i morfologię.
Odpompuj wyczerpane medium z każdego dołka. Delikacie dodaj roztwór roboczy LysoTracker wzdłuż ścianki każdego dołka, unikając zakłócenia monowarstwy. Inkubuj komórki z LysoTracker przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.
Podczas ostatnich 10 minut inkubacji z LysoTracker, dodaj Hoechst 33342 bezpośrednio do dołków w zalecanej przez producenta koncentracji roboczej i mieszaj przez delikatne kołysanie płytki. Usuń medium barwiące na końcu inkubacji i przepłucz komórki raz z podgrzanym PBS, aby zmniejszyć fluorescencję tła. Natychmiast po przepłukaniu dodaj podgrzane medium hodowlane bez fenolu czerwonego.
Przejdź bezpośrednio do obrazowania żywych komórek, zachowując spójność czasu od wymiany bufora do pozyskania danych dla wszystkich dołków. Oznakuj równoległe dołki na płytce hodowlanej na barwienie beta-galaktozydazą, aby porównać wysoce senescencyjne komórki z kontrolami przed-senescencyjnymi. Zakończ obrazowanie żywych komórek dla dołków walidacyjnych przed fiksacją.
Zapisz współrzędne sceny podczas obrazowania na żywo, aby ponownie zlokalizować te same pola po fiksacji. Dodaj roztwór fiksujący z zestawu do barwienia beta-galaktozydą senescencyjną zawierający 2% formaldehydu i 0,2% glutaraldehydu do komórek. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuje przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej.
Usuń środek fiksujący i przepłucz dołki dwa razy PBS. Następnie dodaj roztwór barwienia beta-galaktozydazy zawierający substrat X-gal o pH 6 do każdego dołka. Uszczelnij płytkę parafilmem, aby ograniczyć parowanie podczas inkubacji i umieść płytkę w suchym inkubatorze o 37 stopniach Celsjusza bez dwutlenku węgla na 12 do 16 godzin.
Po fiksacji i barwieniu, umieść płytkę na scenie mikroskopu i ponownie zlokalizuj te same pola obrazowania za pomocą nagranych współrzędnych sceny. Obserwuj dołki pod mikroskopem jasnopolowym i udokumentuj wzór barwienia. Zdobądź reprezentatywne obrazy dla każdego warunku i określ ułamek komórek pozytywnych na beta-galaktozydazę związaną z senescencją na dołek.
Komórki senescencyjne wykazywały jasne, przestrzennie rozszerzone, lizosomom wzbogacone regiony paranuklearne, podczas gdy kontrole przed-senescencyjne wykazywały niższy ogólny sygnał z dyskretnymi punktowymi strukturami. Warunki senescencyjne wykazywały wyższy ułamek komórek pozytywnych na beta-gal niż kontrole przed-senescencyjne. Zaobserwowano silną korelacje między intensywnością LysoTracker a obszarem pozytywnym na beta-gal związanym z senescencją na wszystkich powtarzanych dołkach.
Średnia intensywność LysoTracker w obrębie pozytywnej maski była wyższa w kulturach senescencyjnych niż w kulturach przed-senescencyjnych, co czyni ją najbardziej odpornym kryterium rozróżniającym między tymi dwoma warunkami na poziomie pola. Zintegrowana intensywność LysoTracker na jądro była również wyższa w kulturach senescencyjnych na przedstawionym reprezentatywnym polu. Ten protokół umożliwia badaczom pomiar przebudowy lizosomalnej w żywych komórkach, dostarczając ilościowego pojedynczego odczytu senescencyjnego obciążenia i progresji.
Ważne jest, aby zachować identyczne ustawienia barwienia i obrazowania dla wszystkich dołków, ponieważ porównania intensywności są ważne tylko w obrębie jednej sesji. Przyszłe badania mogą rozszerzyć tę procedurę na trójwymiarowe modele, dodatkowe typy komórek i walidację na różnych systemach mikroskopowych i przepływach pracy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
This article presents a live-cell imaging protocol for assessing cellular senescence by quantifying lysosomal remodeling using LysoTracker Deep Red, an acidotropic fluorescent dye. The method provides an indirect, pH-dependent readout of the acidic organelle compartment, serving as a practical correlate of senescence burden in cultured cells, specifically demonstrated in IMR-90 human lung fibroblasts undergoing replicative senescence.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular senescence
- Cell biology
- Live-cell imaging
Background
- Cellular senescence is characterized by stable cell-cycle arrest and distinct phenotypes, including enlarged morphology and altered secretory profiles.
- Senescent cells show pronounced lysosomal remodeling and expansion of the acidic endo-lysosomal compartment.
- Changes in lysosomal acidity and degradative capacity are hallmarks of senescence.
- Traditional senescence assays include SA-β-Gal staining, but live-cell compatible, quantitative methods are needed.
Purpose of Study
- To provide a simple, live-cell imaging protocol for quantifying lysosomal remodeling as a correlate of senescence.
- To demonstrate the use of LysoTracker Deep Red for assessing acidic organelle expansion in senescent cells.
- To offer a quantitative complement to conventional endpoint assays for senescence.
Methods Used
- Culturing and serial passaging of IMR-90 human lung fibroblasts to induce replicative senescence.
- Staining live cells with LysoTracker Deep Red to label acidic organelles.
- Fluorescence imaging to visualize and quantify lysosomal signal intensity and lyso-positive area per cell.
- Optional SA-β-Gal staining on parallel cultures as a confirmatory marker.
Main Results
- Late-passage, senescent cultures exhibited higher LysoTracker signal and larger lyso-positive regions compared to early-passage controls.
- The observed increase in acidotropic dye signal is consistent with expansion of the acidic organelle compartment during senescence.
- The method provides an indirect, quantitative measure of lysosomal remodeling associated with senescence.
Conclusions
- The protocol offers a simple, adaptable approach for live-cell assessment of senescence-linked lysosomal remodeling.
- Results should be interpreted as indirect correlates of lysosomal changes, not direct measures of lysosome number or biogenesis.
- The method can be extended to other cell types or senescence-inducing conditions.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of cellular senescence using LysoTracker-based lysosomal profiling enables early detection of senescence-linked organelle remodeling in human fibroblasts. This live-cell imaging approach provides a scalable, indirect readout of senescence burden, supporting predictive confidence in discovery-stage cell models. Integrating such quantitative, adaptable assays strengthens portfolio triage and mechanistic de-risking in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of senescence-associated organelle remodeling as a functional biomarker.
- Supports biological de-risking by quantifying lysosomal changes linked to cell-cycle arrest.
- Facilitates predictive confidence in cell-based models for target validation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, live-cell systems for downstream screening of senescence-modulating compounds.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of lysosomal signal intensity and area per cell.
- Enables assay standardization and scalability for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling of senescence in human fibroblasts.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of senescence-modifying interventions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying cellular remodeling endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This lysosomal profiling protocol fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing and quantitative assessment of senescence in cell models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of senescence-linked lysosomal remodeling and pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in live-cell assays.
- Analytics: Delivers image-based measurements of lysosomal signal intensity and area per cell for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains continuity with disease-relevant fibroblast models and senescence endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable, live-cell assay platform for diverse senescence-inducing conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in senescence studies.
- Operational Value: Enables standardization, reproducibility, and scalability in live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, early-stage readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of senescence-modifying candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and quantitative image analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of staining and imaging protocols.
- Adaptable to various cell types and senescence-inducing stresses with protocol optimization.
- Interpretation is limited to indirect correlates of lysosomal remodeling, not direct lysosome quantification.
