Técnica Asséptica em Ciências Ambientais

A técnica asséptica é uma habilidade fundamental em microbiologia e tem aplicações cruciais na pesquisa ambiental.

Se as culturas microbiológicas estiverem contaminadas, o tempo, a mão de obra e os custos financeiros que seriam exigidos de um laboratório para "limpar" ou substituir as culturas, particularmente isolados raros de ambientes únicos, podem ser muito altos e proibitivos, e algumas amostras podem ser insubstituíveis.

O uso adequado de técnicas assépticas reduz a probabilidade de contaminação bacteriana e fúngica de reagentes, meios de cultura e amostras ambientais, e também evita a contaminação cruzada entre amostras. É também uma medida de segurança que diminui a transmissão potencial de micróbios para o experimentador, o que é especialmente importante ao trabalhar com patógenos.

Este vídeo apresentará os princípios da assepsia; várias técnicas importantes para manter reagentes e culturas estéreis; e, finalmente, alguns de seus usos na ciência ambiental.

O objetivo do uso de técnicas assépticas é criar e manter um ambiente de trabalho, equipamentos e reagentes estéreis, de modo a minimizar a contaminação de amostras biológicas. Fontes comuns de contaminação incluem microrganismos transportados pelo ar, micróbios presentes na bancada ou equipamento do laboratório e aqueles do cabelo, corpo e roupas do pesquisador.

Dois tipos de agentes são fundamentais para remover ou prevenir a contaminação no laboratório: produtos químicos desinfetantes e calor. Soluções como etanol a 70% e alvejante diluído são frequentemente usadas para desinfetar equipamentos, superfícies de trabalho e luvas de experimentadores antes de iniciar o trabalho asséptico.

Ao mesmo tempo, micróbios em ferramentas, vidraria e meios líquidos podem ser mortos termicamente em uma autoclave, que é uma câmara que esteriliza o conteúdo por meio da exposição ao vapor pressurizado de alta temperatura. Além disso, ferramentas como hastes de vidro usadas para espalhamento e alças de inoculação de metal podem ser esterilizadas por calor usando uma fonte de chama, como um bico de Bunsen.

O uso de uma fonte de chama também é uma das formas mais comuns de estabelecer um ambiente de trabalho asséptico. O calor da chama causa convecção de ar, gerando uma corrente ascendente que levanta quaisquer contaminantes transportados pelo ar para longe das proximidades do queimador e criando um "campo estéril" para realizar trabalhos experimentais assépticos.

Agora que você entende os princípios por trás das técnicas assépticas e por que elas são importantes, vamos passar por um protocolo para criar um ambiente de trabalho asséptico, compor meios de crescimento estéreis e transferir bactérias assepticamente entre diferentes condições de cultura.

Antes de iniciar o trabalho asséptico, é importante que o experimentador use equipamento de proteção individual adequado, ou EPI. O objetivo disso é evitar que o experimentador contamine as amostras e culturas de laboratório e também evitar a transferência de micróbios potencialmente patogênicos para o pesquisador. Os itens de EPI incluem jaleco, luvas e óculos de segurança.

O próximo passo é esterilizar e armazenar adequadamente o meio de crescimento a ser usado para cultivar as amostras microbianas. Primeiro, pese a quantidade adequada de componentes de meio sólido e adicione-os ao volume adequado de solvente líquido especificado pelo fabricante, como água deionizada, em um recipiente autoclavável Adicione uma barra de agitação magnética, coloque o recipiente em um agitador de placa quente e dissolva os componentes de meio sólido com fogo baixo e agitação.

Feche os recipientes médios. Se estiver usando um recipiente de vidro com tampa de rosca, certifique-se de não apertar a tampa completamente, pois o ar dentro dos recipientes se expandirá devido ao aquecimento durante a autoclavagem e precisará escapar. Sem escapar, o gás pode causar a ruptura do vaso. Coloque um pedaço de fita adesiva nos recipientes e autoclave a mídia de acordo com as instruções do fabricante, como 20 min a 121 °C. Após a autoclavagem, verifique se as listras nas fitas da autoclave ficaram pretas, indicando que a temperatura adequada foi atingida.

Para meios de crescimento líquidos, deixe-os esfriar até a temperatura ambiente e armazene-os em temperatura ambiente ou com refrigeração, conforme apropriado. Para meios de crescimento sólidos à base de ágar, deixe-os esfriar até aproximadamente 50 ? C, em seguida, despeje em placas de Petri estéreis. Deixe o ágar-ágar esfriar e solidificar antes de guardá-lo na temperatura apropriada.

Para meios que não podem ser autoclavados devido à presença de componentes sensíveis ao calor, esterilize por filtro usando um filtro de 0,22 μm.

Uma técnica central no trabalho microbiológico é transferir assepticamente culturas bacterianas entre diferentes meios de crescimento, sólidos e líquidos. Antes de começar, limpe a superfície da bancada do laboratório com um desinfetante. Isso reduz o risco de contaminação de culturas ou meios estéreis.

A transferência de culturas bacterianas geralmente faz uso de uma ferramenta chamada alça de inoculação, que precisa ser esterilizada antes do uso por aquecimento em uma chama.

Ligue uma fonte de chama. Passe lentamente a alça de inoculação pela ponta da chama. O loop ficará vermelho. Para transferir uma colônia bacteriana de uma placa de ágar sólida, abra ligeiramente a placa de Petri e bata suavemente a alça de inoculação quente em uma parte vazia da superfície do ágar para evitar que as bactérias matem pelo calor. Raspe uma única colônia com a alça de inoculação e feche a placa.

Para transferir bactérias de um meio de crescimento líquido, remova a tampa do recipiente de cultura. Para ajudar a evitar a contaminação, evite colocar a tampa na bancada. Passe a boca do recipiente 2-3 vezes pela parte mais quente da chama. Em seguida, toque cuidadosamente o laço de inoculação quente e esterilizado no interior do recipiente e deixe esfriar antes de inseri-lo na cultura do caldo. Remova um laço cheio da cultura e feche imediatamente a tampa.

Para transferir as bactérias obtidas para um meio de crescimento estéril, remova a tampa de um recipiente com o caldo estéril e passe a abertura do recipiente pela chama 2-3 vezes. Em seguida, abaixe cuidadosamente o loop de inoculação no meio e agite suavemente para liberar as bactérias. Feche imediatamente a tampa. Esterilize o circuito de inoculação após o uso.

Se transferir bactérias para uma placa de ágar estéril, abra a tampa de uma placa de Petri fresca com ágar não inoculado. Risque o ciclo de inoculação com a cultura bacteriana para frente e para trás em um setor do ágar. Esterilize o laço e resfrie-o tocando em uma parte vazia do ágar e, em seguida, faça outra faixa no ágar em um ângulo obtuso em relação à primeira linha, certificando-se de cruzar a primeira faixa nos primeiros 1-2 golpes, mas evite tocar na primeira faixa nos golpes subsequentes. Repita a esterilização e as estrias mais 2 vezes. Feche a placa de Petri e esterilize a alça de inoculação.

Uma vez inoculado, o caldo ou placa de ágar deve ser incubado na temperatura ideal de crescimento para que o microrganismo em questão obtenha uma cultura viável. Em meio sólido, um gramado ou fita contínua de bactérias seria visível no ágar coberto pelas duas primeiras estrias, mas colônias individuais devem ser obtidas na faixa final. Técnicas assépticas inadequadas resultariam no crescimento de mofo e outros contaminantes na placa.

As técnicas assépticas são importantes em muitos experimentos envolvendo amostras microbianas do ambiente. Neste estudo, os pesquisadores isolaram bacteriófagos, que são vírus que infectam bactérias, da bactéria comum do solo Arthrobacter. As culturas de Arthrobacter foram cultivadas pela primeira vez em condições assépticas. As amostras de solo foram então lavadas e filtradas em tampão fago, e a solução de fago foi misturada com a cultura bacteriana e semeada em placas de ágar. Um gramado bacteriano se formaria no prato, mas haveria clareiras, ou "placas", nos pontos onde o vírus infectou e matou a bactéria. O fago poderia então ser purificado dessas placas para um estudo mais aprofundado.

Além de usar bicos de Bunsen, os ambientes de trabalho assépticos também podem ser mantidos em estações de trabalho especializadas conhecidas como capelas de fluxo laminar, que usam fluxo de ar direcionado e filtros para manter a esterilidade. Aqui, os cientistas trabalharam em uma coifa de fluxo para isolar bactérias e vírus patogênicos em potencial de amostras de água. Esses isolados foram então cultivados junto com amebas. Como as amebas normalmente comem ou "fagocitam" bactérias, qualquer bactéria que seja capaz de resistir à digestão das amebas e permanecer nesses organismos também pode permanecer viável nas células humanas e causar doenças.

Finalmente, as condições estéreis permitem o estudo detalhado de mecanismos ecológicos, como a formação de nódulos radiculares em leguminosas - órgãos cheios de bactérias que "fixam" o nitrogênio atmosférico em amônia, que é usada pela planta para o crescimento. Os pesquisadores aqui criaram "microcosmos" para estudar o processo de nodulação usando placas de Petri entalhadas com meio de crescimento vegetal, colocaram mudas nelas e inocularam as mudas com bactérias rizóbias formadoras de nódulos. O ambiente asséptico da capela de fluxo evita a contaminação das culturas com outras bactérias ou fungos.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre técnicas assépticas na ciência ambiental. Agora você deve entender por que as condições de trabalho assépticas são importantes; como realizar experimentos microbiológicos assepticamente; e algumas aplicações de técnicas assépticas à pesquisa ambiental. Como sempre, obrigado por assistir!