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A coloração de Gram permite a visualização rápida da morfologia bacteriana e ampla distinção celular a partir de uma ampla gama de amostras ambientais. Para manchar as bactérias, um esfregaço uniforme é aplicado em um lado de vidro e deixado secar. Após a fixação do esfregaço por calor, o cristal violeta é aplicado.
Um agente descolorante enxágue o cristal violeta das células Gram-negativas, mas não das células Gram-positivas. Um segundo corante, normalmente safranina, é usado como uma coloração de fundo para visualizar as células Gram-negativas. Uma vez coradas, as células podem ser avaliadas quanto à morfologia, tamanho e arranjo celular, como cadeias ou aglomerados.
Este vídeo demonstrará como preparar uma amostra ambiental, isolar as espécies bacterianas nela encontradas e realizar uma coloração de Gram nas colônias isoladas
A coloração de Gram permite a categorização da maioria das bactérias em duas grandes classes estruturais: Gram-positivas e Gram-negativas. Embora ambas as classes tenham uma membrana plasmática fosfolipídica subjacente, a estrutura da parede celular varia muito. A parede celular Gram-positiva é composta principalmente por uma espessa camada de peptidoglicano, que é um polímero que consiste em açúcares e aminoácidos. As paredes celulares Gram-negativas têm uma camada mais fina de peptidoglicano, imprensada entre uma segunda membrana lipídica. Esta membrana externa normalmente contém lipopolissacarídeos.
O cristal violeta carregado positivamente se liga fracamente à parede celular bacteriana carregada negativamente. O iodo de Gram forma um complexo insolúvel com o corante violeta cristalino, fixando-o na parede celular.
Durante a etapa de descoloração, o peptidoglicano nas células Gram-positivas é desidratado, fazendo com que ele se contraia e prenda os complexos cristal violeta-iodo. Nas células Gram-negativas, o agente descolorante compromete a membrana externa, aumentando sua porosidade. Isso permite que os complexos de cristal violeta-iodo sejam lavados.
Agora que você entende os princípios por trás da coloração de Gram com bactérias do solo, vamos ver o processo realizado nas bactérias do solo em laboratório.
Depois de coletar uma amostra de solo no campo, leve-a ao laboratório para análise. Refinar a amostra com uma peneira e pesar 10 g de solo peneirado usando uma balança analítica.
Dilua a amostra em 95 mL de solução salina tamponada com fosfato e vórtice para misturar. Realize 1 a 10 diluições adicionais, vórtice entre cada diluição. Transferir alíquotas de, pelo menos, 3 diluições sucessivas para placas de agarose com baixo teor de nutrientes replicadas.
Após a esterilização por chama de etanol e o resfriamento de uma haste de vidro dobrada batendo no meio, espalhe a amostra sobre a superfície das placas. Incube as placas à temperatura ambiente. Após incubação por 3 a 5 dias, selecione a diluição mais alta com 30 a 300 colônias discretas. Com uma alça de inoculação estéril, selecione as colônias de interesse para isolamento.
Listre a colônia em uma seção de um prato novo. Esterilizando o laço entre as estrias, faça listras sucessivas em zigue-zague em cada seção da placa para permitir o isolamento subsequente de colônias únicas discretas. Incube as placas por 1 a 2 dias em temperatura ambiente.
Para iniciar a preparação de esfregaços bacterianos, prenda um clipe a uma lâmina de vidro pré-limpa para facilitar o manuseio. Para cada esfregaço bacteriano, limpe e esterilize uma alça de inoculação. Coloque 2 loops de água destilada estéril no centro da lâmina.
Depois de esterilizar o laço novamente, remova uma pequena quantidade de cultura de uma colônia isolada e misture com a água na lâmina. É importante resfriar o loop antes de tocar na cultura, batendo várias vezes em uma porção não inoculada de ágar. O esfregaço deve se assemelhar ao leite diluído. Deixe a lâmina secar à temperatura ambiente. Após a secagem, fixe o esfregaço com calor, passando-o rapidamente por uma chama.
Depois de seco, pipete violeta de cristal sobre o esfregaço e deixe descansar por 2 a 3 min. Enxágue cuidadosamente a lâmina com água destilada, direcionando o fluxo direto para o topo da lâmina, permitindo que a água escorra suavemente para baixo. Não aponte o fluxo de água diretamente para o esfregaço.
Cubra a lâmina com iodo de Gram. Após 2 min, enxágue suavemente com água destilada. Descolora a lâmina com etanol a 95% até que a mancha não seja mais lavada. Enxágue imediatamente com água destilada. Isso limitará a descoloração excessiva do esfregaço.
Adicione safranina como contra-mancha ao esfregaço por 30 s. Isso manchará todas as células Gram-negativas presentes. Enxágue suavemente com água destilada e seque com papel absorvente. Observe a lâmina resultante com um microscópio. Use uma objetiva de baixa potência primeiro para fazer ajustes grosseiros e encontrar uma parte ideal da mancha antes de passar para o campo de visão menor das ampliações mais altas.
Depois de obter mais imagens e ajustar o esfregaço com uma objetiva de média potência, adicione óleo de imersão diretamente ao esfregaço. O óleo é necessário para objetivas de alta potência que fornecerão as melhores micrografias. As bactérias Gram-positivas aparecerão na cor azul ou roxa, enquanto as células Gram-negativas serão vermelhas ou rosa. Além da estrutura da parede celular, a forma e o arranjo são elucidados a partir das micrografias resultantes.
A capacidade da coloração de Gram de estudar qualitativamente as bactérias é importante para uma ampla gama de campos científicos.
O solo é apenas uma das fontes ambientais das quais as bactérias podem ser isoladas e analisadas. Para a água potável, a preparação da amostra deve ser modificada. Amostras de água da torneira podem ser retiradas de uma torneira e colocadas em meios de crescimento que facilitam o crescimento de diversas colônias bacterianas heterotróficas. Ao ser plaqueado em um meio como R2A, o processo é quase idêntico ao procedimento do solo.
Para certas técnicas de identificação bacteriana, os parâmetros dependem do tipo de parede celular da bactéria de interesse. Neste exemplo, o sangue de um paciente séptico foi testado e descobriu-se que abrigava bactérias Gram-positivas.
Com essas informações, foram escolhidas sondas de ácido nucleico peptídico específicas da espécie que se ligariam ao rRNA das células. Essas sondas foram ligadas a corantes fluorescentes que foram usados para identificar as espécies presentes.
Devido às diferenças fundamentais na estrutura celular Gram-positiva e negativa, as bactérias têm respostas únicas a outros compostos além do cristal violeta. Este experimento buscou isolar Clostridium difficile, uma bactéria Gram-positiva, de amostras fecais. A cicloserina, que inibe o crescimento de células Gram-negativas, foi adicionada à placa de ágar. As células Gram-positivas que cresceram na placa foram isoladas por outros métodos.
Você acabou de assistir à introdução de JoVE à coloração de Gram para estudos ambientais. Agora você deve entender os benefícios do processo e como executar a técnica e utilizar os resultados. Obrigado por assistir!
