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A marcação metabólica é usada para investigar a maquinaria de uma célula. Isso é feito usando análogos químicos para investigar as transformações e modificações bioquímicas que ocorrem. Este vídeo mostrará os princípios da marcação metabólica, procedimentos típicos de marcação isotópica e fotorreativa e algumas aplicações.
A marcação metabólica pode ser realizada usando várias estratégias. Aqui descreveremos a marcação isotópica, fotorreativa e bio-ortogonal.
A marcação isotópica é realizada usando análogos estruturais que são quimicamente idênticos às suas contrapartes naturais, mas têm isótopos incomuns incorporados em sua estrutura. Neste análogo da L-lisina, os átomos de carbono e nitrogênio são substituídos por carbono-13 e nitrogênio-15. As células cultivadas na presença de análogos isotópicos irão incorporá-los em suas estruturas bioquímicas. Os metabólitos são coletados das células e purificados para análise. Amostras com isótopos estáveis são analisadas usando técnicas como espectrometria de massa ou espectroscopia de RMN. As amostras com marcadores radioativos são analisadas usando contagem de cintilação líquida e filmes de raios-x, que serão demonstrados no protocolo de marcação isotópica.
Os marcadores fotorreativos são grupos funcionais incorporados às proteínas, que são estáveis até serem expostos à luz ultravioleta. O grupo funcional forma um radical reativo, que se liga à proteína mais próxima. Um exemplo comum, L-foto-leucina, contém um anel de diazirina, que é um reticulador fotorreativo. Em contraste com a marcação isotópica, há alguma diferença química entre os análogos químicos foto-reativos e suas contrapartes naturais. As células podem preferencialmente incorporar compostos naturais em vez de análogos. Portanto, é importante realizar a marcação fotorreativa em meio livre do composto que está sendo imitado. Uma vez expostos à radiação ultravioleta, os grupos foto-reativos em uma proteína marcada tornam-se instáveis e altamente reativos, fazendo com que ela se ligue com proteínas que interagem, criando um complexo proteico. Complexos reticulados atuam como instantâneos que podem ser analisados usando SDS-PAGE e métodos de espectrometria de massa. Isso fornece informações sobre quais reações estão ocorrendo na via metabólica, identificando espécies de reação e como elas interagem determinando os locais de ligação.
As estratégias de rotulagem bio-ortogonal utilizam análogos com pequenos grupos funcionais que têm pouca ou nenhuma reatividade com biomoléculas naturais. Por exemplo, azidas são pequenos grupos funcionais, cuja reatividade é dita ser ortogonal às reações bioquímicas. Na ligação de Staudinger, um grupo de fosfina ataca o grupo azido. Isso produz um estado de transição que reage intramolecularmente com um éster próximo, resultando em um ligante ligado à amina. Grupos funcionais bio-ortogonais incorporados em biomoléculas podem ser ligados a tags de detecção, como grupos funcionais fluorescentes, e tags de afinidade, como antígenos.
Agora que alguns conceitos e estratégias para a rotulagem metabólica foram discutidos, vamos dar uma olhada no processo no laboratório.
O primeiro passo em um experimento de marcação metabólica é coletar a proteína de interesse. Para fazer isso, as células são cultivadas em uma placa e um método de expressão é usado para promover a síntese da proteína desejada. Neste exemplo, quinases repetidas ricas em leucina, ou LRRK, são expressas. O fosfato dissódico, contendo fósforo-32 radioativo, é usado como análogo. Devem ser tomadas medidas adequadas para proteger contra as radiações ionizantes. Isso inclui a criação de uma área de trabalho, o uso de equipamentos de proteção adequados e a verificação de contaminação radioativa. Uma vez tomadas as medidas de segurança, prepara-se o meio que contém os análogos isotópicos. O meio da cultura é removido e substituído por um contendo os análogos químicos isotópicos e, em seguida, incubado. Após a incubação, as células são lisadas. O lisado é coletado e purificado.
Após a purificação, as proteínas são resolvidas usando SDS-PAGE e depois transferidas para uma membrana de PVDF. A autorradiografia é realizada expondo a membrana ao filme de raios-x e medida usando um gerador de imagens de fósforo. O Western blotting é usado para medir os níveis relativos de proteína na membrana do PVDF. Neste exemplo, os níveis de fosforilação de quinases repetidas ricas em leucina sintetizadas em células 293T foram medidos. O auto-radiograma mostra quanto fósforo foi incorporado à proteína. O Western blotting elucida os níveis das proteínas LRRK. O software de análise de imagens é usado para obter dados quantitativos dos níveis de fosforilação das proteínas.
Neste próximo procedimento, a rotulagem fotorreativa é demonstrada. Primeiro, as células são preparadas e cultivadas. O análogo fotorreativo é adicionado às células na fase intermediária e incubado. Neste procedimento, a p-benzoilfenilalanina é usada. As amostras são coletadas em intervalos e colocadas no gelo. As amostras são então expostas para obter instantâneos das vias bioquímicas ao longo do tempo. As proteínas de interesse são então purificadas e resolvidas usando SDS-PAGE.
Uma estratégia de marcação fotorreativa foi usada para identificar compostos que interagem com a proteína de interesse. A imunodetecção com Western blotting mostra bandas de proteínas que indicam que proteínas de maior peso molecular estão presentes nas amostras irradiadas. Estes são de reticulação devido à interação proteína-proteína que ocorre durante a irradiação UV.
Agora que revisamos os procedimentos de rotulagem metabólica, vejamos algumas das maneiras pelas quais o processo é usado.
Os conceitos de rotulagem metabólica podem ser estendidos a organismos multicelulares. As plantas são cultivadas em um ambiente selado, rico em isótopos estáveis para produzir material vegetal marcado. Dióxido de carbono contendo carbono-13 é adicionado ao recinto, enquanto fertilizante rico em nitrogênio-15 é usado. O material vegetal colhido resultante pode ajudar a responder a perguntas sobre o ciclo de carbono e nitrogênio do ecossistema.
A marcação permite a separação do RNA recém-sintetizado do RNA mais antigo. Ao alterar a concentração inicial do análogo, a cinética da nova síntese de RNA pode ser determinada. Os resultados mostram que a concentração de 4-tiouridina afeta a quantidade de novo RNA transcrito. Além disso, as taxas de incorporação do marcador no RNA podem ser quantificadas diretamente com um espectrofotômetro.
Usando a química do clique biortogonal, os glicanos em um embrião de peixe-zebra podem ser rotulados. Os ovos são injetados com um composto de rotulagem que resulta em rótulos de alcino nos glicanos. Os glicanos nas larvas são então ligados a um composto corante no estágio de desenvolvimento desejado. Os glicanos nos embriões são então fotografados. Os glicanos produzidos em diferentes momentos podem ser identificados pela rotulagem usando cores diferentes em diferentes estágios do desenvolvimento embrionário.
Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre rotulagem metabólica. Este vídeo descreveu os conceitos por trás da rotulagem metabólica e suas estratégias, passou por dois procedimentos gerais e cobriu alguns dos usos das técnicas.
Obrigado por assistir!
