Summary
Il cordone ombelicale sono utilizzate per isolare le cellule muscolari lisce per vie diverse. In questo lavoro abbiamo usato il trattamento enzimatico per isolato cellule muscolari lisce.
Abstract
Il cordone ombelicale umano (UC) è un campione biologico che può essere facilmente ottenuto solo dopo la nascita. Questo campione biologico è, il più delle volte, scartati e la loro raccolta non comporta alcun rischio aggiuntivo per la salute neonato o la madre s. Inoltre non sono preoccupazioni etiche sollevate. L'UC è composto da una vena e due arterie da cui entrambe le cellule endoteliali (EC)
Protocol
- Arterie sono ottenuti da pezzi di UC di 3-7 cm.
- Gelatina di Wharton che circonda le arterie è stato accuratamente rimosso tagliandolo con le forbici.
- Un brusco-end ago di un diametro esterno di 0.6-1mm è stato inserito 7 mm circa da una estremità delle arterie sezionato.
- Per rimuovere il sangue residuo all'interno dei vasi, le arterie sono tenute in verticale e perfusi con, circa 20 a 40 ml, soluzione fisiologica (PSS), utilizzando una siringa da 20 ml collegata ad un ago. Se necessario, questa fase di lavaggio è stato ripetuto per diverse volte.
- La stessa procedura è stata ripetuta con RPMI 1640 supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS).
- Una estremità del vaso sanguigno è stato chiuso. Una siringa da 10 ml è stato collegato all'ago e perfusi con 3 ml di collagenasi tipo I (800 unità / ml in soluzione salina tampone di Hank (HBSS)). Poi l'altra extremityof la nave è stata anche chiusa.
- La nave è stata incubata con una soluzione salina tampone fosfato (PBS), per 15 minuti a 37 ° C con agitazione.
- Dopo la fine della nave sono stati tagliati per raccogliere le SMC libero. Le arterie erano profumato con circa 20 a 40 ml di DMEM-F12 integrato con il 5% di FBS e antibiotico ad un tubo da 50 ml.
- Il tubo è stato centrifugato a temperatura ambiente (250 g, 8 min) e pellet cellulare è stato risospeso in 5 ml di DMEM-F12 integrato con il 5% di FBS.
- La sospensione cellulare è stato trasferito in un collagene rivestito T-pallone e incubate a 37 ° C, con un 5% di CO 2 nell'atmosfera umidificata.
- Dopo 5 16 h, la non-aderenti cellule e drebis cellulari sono stati rimossi, 5 ml di terreno di coltura è stata aggiunta e le cellule sono state incubate a 37 ° C, con un 5% di CO 2 nell'atmosfera umidificata.
- I mezzi di coltura cellulare era cambiato ogni 2 3 giorni, fino a raggiungere SMC confluenza.
- Dopo aver raggiunto confluenza le cellule sono state seminate in due o tre 25 cm 2 T-fiaschi.
Pulizia
- Smaltire gli aghi in un contenitore taglienti.
- Smaltire le siringhe in grandi contenitori a rischio biologico.
- Mettere tutto il tessuto in una piccola borsa a rischio biologico. Chiudere il sacchetto e congelare a -20 ° C fino a quando l'incenerimento.
- Immergere tutti gli strumenti in virucida per almeno 10 min.
- Ritorna supporti non utilizzati per frigorifero.
- Smaltire i guanti in rifiuti biologici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le SMC possono essere utilizzati come modelli per i test futuri con farmaci constrictor, di isolare e caratterizzare strutturalmente di tipo L canali del calcio, per studiare gli aspetti cellulari e molecolari della funzione vascolare e di utilizzarli in ingegneria dei tessuti. SMC e EC sono fondamentali per lo sviluppo di nuovi biomateriali che possono essere utilizzati per la produzione di semi vasi sanguigni sintetici da utilizzare negli esseri umani.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ospedale Amato Lusitano, Castelo Branco in Portogallo.
Ospedale Sousa Martins, Guarda il Portogallo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
