Summary
持続的で慢性細菌感染マウスモデルを確立する
Abstract
細菌感染マウスモデルでは、感染症、炎症、免疫学、シグナル伝達、および腫瘍形成などの分野を研究するための強力なモデルシステムです。多くの研究者によって誘発される大腸炎の利用しています
Protocol
細菌培養、マウスの強制経口投与、およびサルモネラの検出：このプロトコルは、次の3つの部分を含む。
1 サルモネラの成長条件。
- 37℃で一晩インキュベートサルモネラ LB培地（LB）プレートを、準備します。
- LBプレートからクローンを選択し、12 mlチューブに7 mlのLBに入れ、そして37℃で約5時間振とうする。
- 約18時間振盪せずに37℃で定常期の文化とインキュベート0.05 mlを50 mlのLBに接種する。
- 比100:3（：HBSS LB）を使用して、HBSS中の細菌を一時停止、10分間6000rpmで室温で一晩細菌培養を回転させる。次に例を示します。
すべての50 mlのLB培養液を1.5mlのHBSSに懸濁される。 - 動物の強制経口投与の場合は、さらに1:10の比で細菌培養を希釈する。次に例を示します。
毎1.5 mlのLB培養液を15mlのHBSSに懸濁される。
（2） サルモネラ感染症のモデル*
- ストレプトマイシン溶液を調製。各マウスは、100μlのHBSSでストレプトマイシンの7.5 mgを与えられます。例えば、10匹のマウスに対して1.2ミリリットルHBSSでストレプトマイシンの合計90mgのを準備。ストレプトマイシン溶液を調製する際は、必ずいくつかの余分なボリュームを持っている。
- 4時間強制経口投与、治療前に水と食料を撤回。
- ストレプトマイシン（対照マウスのためのHBSS100μlの）の7.5 mgのストレプトマイシンによる強制飼養マウス。ストレート食道を作るために人差し指で頭と首を伸ばし、しっかりと親指と中指でマウスの肩の皮膚をつかむ。口の屋根に沿ってと咽頭の背面の右側に向かって供給針のボールチップに指示、その後ゆっくりと食道に伝承し、100μlのソリューションを注入する。いいえ抵抗を感じてはいけません。
- ストレプトマイシンの治療、撤回水と食料20時間後でマウスが細菌に感染して再び前に。
- HBSS中の100μlの懸濁液と各マウスに強制経口投与または強制経口投与による滅菌HBSS（対照）で処理した。強制経口投与手順はストレプトマイシンと同じ）2.3などの強制経口投与したマウスです。
*動物実験は、以前は1で説明した6〜7週齢の特定病原体フリーの雌C57BL / 6マウス（タコニック、ハドソン、NY）を用いて行った。プロトコルは、動物資源上ロチェスター大学委員会の大学（UCAR）により承認された。
3。腸内のサルモネラの検出。
- （約100mg）マウスは糞便収集する。
- 1ミリリットルPBSと激しくボルテックスの1.5マイクロ遠心チューブに糞便サンプルを転送します。
- 800回転で10分間遠心します。きれいな微量遠心チューブに上清を移す。
- 5分を6000rpmで遠心分離。上清を捨て、200μLのPBSでペレットに添加し、ボルテックスしています。
- サルモネラを検出するためにBBL CHROMagarプレート上に使い捨てセルスプレッダーとストリーク200μlのPBS。 サルモネラ種は、（紫にバラ、図1を参照）ふじ色が表示されます。プレート上に200μlの収量が多すぎるコロニー場合、100μlまたはストリークのための50μlを使用してください。
4。代表的な結果。
プロトコルが正しく行われているときは、 ネズミチフス菌の保菌は、6ヶ月の上にマウスの腸内で検出することができます。 サルモネラは 6ヶ月（図1）を介して糞便培養によって検出される可能性がある。このモデルから来る典型的な外として、ボディは消失し、死は4週間、感染後内で発生する重量を量る。感染症に使用されるサルモネラの菌株に依存し、いくつかのマウスは6ヶ月にわたって生き残ることができる。
図1 サルモネラ種の腸内菌が原因選択した色原体の存在下で代謝の違いに、カラーで（紫にバラ）ふじ色が表示されます。他の細菌は、どちら抑制または青緑色や無色のコロニーを生成している。
図2。 サルモネラ変異株PHOP C、PHOP Cに感染したマウスの生存割合アブラ-、およびPHOP C AvrA-/AvrA +、4週間（28日）のためのPHOP Cアブラ。
4週間のためのサルモネラに感染したマウスの表1。体重。
| 0 | 1週間 | 2週間 | 3週間 | 4週 | |
| の制御 | 16.78 ± 1.05 | 16.91 ± 1.28 | 18.26 ± 1.23 | 19.31 ± 1.26 | 20.26 ± 1.15 |
| PHOP C 16.89 ± 1.03 | 17.14 ± 1.19 | 17.43 ± 1.63 * | 18.68 ± 1.78 | 20.05 ± 1.11 | |
| PHOP Cアブラ- | 16.91 ± 1.12 | 16.96 ± 1.39 | 17.06 ± 2.14 ** | 18.71 ± 2.18 | 20.15 ± 1.56 |
| PHOP C AvrA-/AvrA + | 16.94 ± 0.96 | 17.17 ± 1.02 | 17.63 ± 1.42 * | 18.44 ± 2.03 | 20.09 ± 1.17 |
*グループP <0.05を制御するための比較
**グループP <0.01を制御するための比較
本研究で使用した表2。 サルモネラ菌株。
| の名前 | 説明 | 参照またはソース |
| サルモネラ 14028s | 野生型S.ネズミチフス菌 | ATCC |
| PHOP C | 変異体の非病原性の複雑なレギュレータ | Millerら、1990 |
| PHOP Cアブラ- | アブラ-突然変異 | コリアー-ハイアムズら、2002 |
| PHOP C AvrA-/AvrA + | PHOP C補完をコードするプラスミドのアブラアブラ付き | コリアー-ハイアムズら、2002 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このシステムを使用するには、それは、動物を強制経口投与する方法については、研究者のために必要です。我々は詳細細菌培養を準備し、マウスを強制経口投与するための方法論を。我々はまた、胃腸（GI）管におけるサルモネラの持続性を監視する方法を示します。を含めて、このプロトコルの重要なステップ：
- ストレプトマイシン前処理：ストレプトマイシン、前処理は、いくつかの共生腸内細菌叢を取り除くとサルモネラ感染症2に影響を受けやすいマウスを作ることができる。
- サルモネラ強制経口：初心者のために、強制経口投与が困難な場合があります。解決策が誤って気道に注入し、マウスの死亡を引き起こすされているのでいつか、強制経口投与は失敗します。
- 永続的な細菌のコロニー形成：消化管での綿密なモニタリングの細菌を必要とする。マウス糞便培養に加えて、盲腸の内容は、BBL CHROMagarプレートのサルモネラの検出に使用することができます。マウスは、 サルモネラ感染症の後に犠牲にされているときに盲腸の内容を収集する。
我々は、異なる濃度でマウスにサルモネラの保菌をテストしている：1 × 10 8コロニー形成単位（100μL/マウス）に1 × 10 3コロニー形成単位。 1 × 10 6〜10 × 10 8コロニー形成単位で、 サルモネラは、マウスを植民地化することができた。したがって、私たちの以前の出版物1,5、および未発表データに基づいて、この溶液中のサルモネラの最終濃度は、強制経口投与前に測定されることはありません。
この実験的な手順では、我々は6-7週齢の特定病原体フリーの雌C57BL / 6マウス（タコニック、ハドソン、NY）を使用。使用菌株は、 サルモネラ菌の野生型株のATCC14028s（WT - SL）、非病原性サルモネラ変異株PHOP C3、PHOP Cアブラ-、およびPHOP C AvrA-/AvrA +、PHOP Cアブラを（表2）が含まれます。このプロトコルを使用して、 ネズミチフス菌のコロニー形成は、6ヶ月（Fig1）の上にマウスの腸内で検出することができます。 サルモネラ感染症と炎症は、糞便と男の子の重量を観察することによって測定した。組織サンプルと血液が収集されたときは、腸の長さは、腸の炎症の特徴として測定した。脾臓と肝臓の重みも検討した。マウス血清サイトカインはELISA5により試験した。さらにさらに、生化学的および分子のメソッドはさらにサルモネラ 5によって誘導される炎症性サイトカインの変化と病態の変化をテストするために使用されています。
一般的に、体重減少と死亡は4週間後に感染（表1）内で発生する。ポストサルモネラ感染症は、細菌の無治療の対照群と比較して細菌感染群で有意な体重減少があった（* P <0.05またはp <0.001、表1）。体重は毎週測定した。生存割合4週間後に感染が図で示されていた。 2。全体的に、マウスの92％（N = 50） サルモネラの菌株PHOP Cに感染し、78％PHOP Cアブラ-、または70％PHOP C AvrA-/AvrA +腸内で永続的なサルモネラで生き残ることができる。急性感染した後、すべての生存者はまだこの提案に記載されている方法を使用して6ヶ月後に感染が検出される可能性サルモネラを 、行った。一度のマウスは3週間後に感染を生き残る、マウスは、体重を獲得し、以下の死は、（図2）が発生しました。また、immunofluroscenceの染色データも腸管粘膜27週間後に感染症（図3）におけるサルモネラの侵入を示す。これらのデータは示してそのPHOP C、PHOP Cアブラ-、またはPHOP C AvrA-/AvrA +慢性感染症のモデルに使用することができます。
宿主抵抗性因子Nramp1とマウス+ / + サルモネラ菌感染3-6に耐性がある。欠陥NrampとC57/BL6マウスは、現在の研究で使用した。我々は、病原性サルモネラ株の14028sに感染した90％のマウスは、4週間（データは示さず）を介して生き残ることができないことがわかった。野生型、ネズミチフス菌感染症の長期的な影響を理解するために、Nampr1を持つマウスは、+ / +を使用することができる。
このモデルは、BSL - 2実験室で確立されます。我々のプロトコルは、動物資源上ロチェスター大学委員会の大学（UCAR）によって承認されています。 サルモネラに感染したマウスでは、不快感や苦痛を被ったと少ないがアクティブになると徐々に移動する可能性があります。彼らの毛皮はフリルになることがあります、彼らは通常のように餌や飲みしない場合があります。動物は密接に観察され、マウスがそれは流体または著しい体重減少（10％以上）7自然吸気 したという通知を示した、とした場合など十分に歩き回ることができないような不快感の兆候は、水分補給とカロリー摂取量を維持する場合すぐに死ぬことは、マウスを人道的に安楽死された。すべての検査技師はに訓練されます。適切なマウスの8,9の観察。
ストレプトマイシン前処理を使用する多くの研究は、感染1,2,10の早い段階での研究にネズミチフス菌により誘導される大腸炎の利用しています。しかし、in vivoで11のマウスモデルにおける慢性感染症に対する唯一の少数報告。消化管におけるサルモネラ永続的な存在を持つマウスは、私たちは長期的なホスト-細菌相互作用、シグナル伝達、および腫瘍形成を探索することができます。我々は6ヶ月以上のマウスの腸でネズミチフス菌の植民地化と慢性的な細菌感染マウスモデルを確立している。このモデルはまた、大腸菌の病因とプロバイオティクスの研究にも使用できます。全体的に、このプロトコルは、根本的に重要な生物学的および微生物学的問題に対処するためのマウスモデルを用いて研究者を支援します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品はJun SunにNIDDK KO1 DK075386助成金と米国癌学会RSG - 09 - 075 - 01 - MBCによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
References
- Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
- Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
- Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
- Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
- Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
- Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
- Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
- Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).
- Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , Forthcoming (2010).
