Summary
영구와 만성 세균 감염 마우스 모델 수립
Abstract
세균성 감염 마우스 모델은 감염, 염증, 면역학, 신호 전달, 그리고 tumorigenesis과 같은 분야를 공부를위한 강력한 모델 시스템입니다. 많은 연구자에 의해 유도된 대장염의 이점을 데리고
Protocol
세균성 문화, 마우스 gavage 및 살모넬라균 검출이 프로토콜은 세 부분을 포함하고 있습니다.
1. 살모넬라균의 성장 상태.
- ° C 야간 37 품어 살모넬라균 Luria - Bertani 국물 (LB) 접시를 준비합니다.
- LB 판에서 복제를 선택하고 12 ML 튜브 7 ML의 LB에 넣어 37 ° C 약 5 시간 동안 흔들.
- 약 18 시간 동안 떨지 않고 37 ° C에서 고정 상 문화와 부화의 0.05 ML과 함께 50 ML의 LB의 예방.
- 비율 100:3을 (HBSS LB)를 사용하여 HBSS에있는 박테리아를 중단, 10 분 6,000 RPM과 함께 실온에서 하룻밤 박테리아 문화를 스핀. 예를 들면 다음과 같습니다
모든 50 ML의 LB 문화는 1.5 ML의 HBSS에 일시 중지됩니다. - 동물 gavage 경우, 추가 1시 10분 비율 박테리아 문화를 희석. 예를 들면 다음과 같습니다
모든 1.5 ML의 LB 문화 15 ML의 HBSS에 일시 중지됩니다.
2. 살모넬라균 감염 모델 *
- 스트렙토 마이신 솔루션을 준비합니다. 각각의 마우스는 100 μl HBSS에 스트렙토 마이신의 7.5 MG를 받게 될 것입니다. 예를 들어, 10 마우스에 대한 1.2 ML HBSS에 스트렙토 마이신 총 90 MG를 준비합니다. 스트렙토 마이신 솔루션을 준비할 때 항상 몇 가지 여분의 볼륨을했습니다.
- 구두 gavage 치료를 받기 전에 물과 음식을 4 시간 철수.
- 스트렙토 마이신 (제어 마우스에 대한 HBSS 100 μl)의 7.5 MG로 스트렙토 마이신과 Gavage 쥐. 똑바로 식도를 만들기 위해 검지로 머리와 목 스트레칭, 단단히 엄지와 가운데 손가락으로 마우스 어깨 위에 피부를 잡아. 입천장을 따라와 인두의 뒤쪽의 오른쪽 방향으로 먹이 바늘의 볼 - 팁을 직접 다음, 부드럽게 식도로 아래로 통과하고 100 μl 솔루션을 주입. 아무 저항도 느끼지해야합니다.
- 스트렙토 마이신 처리, 철회 물, 생쥐는 박테리아에 감염된 음식을 다시하기 전에 이후 20 시에.
- HBSS 100 μl 현탁액 각 마우스를 Gavage 또는 경구 gavage에 의해 멸균 HBSS (제어)와 치료. gavage 절차는 스트렙토 마이신과 같은) 2.3로 gavage 마우스입니다.
* 동물 실험은 특정 - 병원체가없는 여성 C57BL / 이전 1 설명된대로 6~7주 살 때 6 쥐 (타코닉, 허드슨, NY)를 사용하여 수행되었습니다. 프로토콜은 동물 자원 (UCAR)에서 로체스터 대학위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.
3. 소장에서 살모넬라균의 검출.
- (100 MG) 마우스 배설물 수집합니다.
- 적극적으로 1ml PBS와 소용돌이와 1.5 마이크로 원심 튜브에 배설물 샘플을 전송합니다.
- 800 RPM 10 분 원심 분리기. 깨끗한 microfuge 튜브에 뜨는을 전송합니다.
- 5 분을 위해 6,000 rpm으로 원심 분리. 뜨는은 삭제됩니다 200 μL PBS는 쥐똥에 추가 vortexed됩니다.
- 살모넬라균을 검출 BBL CHROMagar 접시에 일회용 휴대 확장기와 리크 200 μl PBS가. 살모넬라균 종은 (보라색으로 장미, Fig.1 참조) 자주빛 나타납니다. 200 μl 산출하면 접시에 너무 많은 식민지는 100 μl 또는 연속 50 μl를 사용합니다.
4. 대표 결과.
프로토콜이 제대로되면 살모넬라균 typhimurium의 식민지가 6 개월 이상 마우스 소장에서 검색된 수 있습니다. 살모넬라균은 6 개월 (Fig.1)을 통해 지저분한 문화에 의해 감지 수 있습니다. 전형적인 아웃이 모델의 결과로서, 몸은 상실과 죽음 4 주 이후에 감염 내에서 발생하는 무게. 감염에 사용되는 살모넬라균의 변종에 따라, 일부 마우스는 6 개월 이상 생존할 수 없습니다.
그림 1. 살모넬라균의 종의 창자 살모넬라균 인해 선택 chromogens의 존재에 신진 대사의 차이로 색상 (퍼플 로즈) 자주빛 나타납니다. 다른 박테리아가 어느 저해 또는 파란색 - 녹색 또는 무색의 식민지를 생산하고 있습니다.
그림 2. 살모넬라균 돌연변이 스트레인 PhoP C, C PhoP에 감염된 마우스의 생존 비율 아브라 -, 그리고 PhoP C AvrA-/AvrA +, 사주 (28 일) PhoP C 아브라.
4 주 동안 살모넬라균에 감염된 생쥐의 표 1. 체중.
| 0 | 일주 | 이주 | 삼주 | 사주 | |
| 제어 | 16.78 ± 1.05 | 16.91 ± 1.28 | 18.26 ± 1.23 | 19.31 ± 1.26 | 20.26 ± 1.15 |
| PhoP C 16.89 ± 1.03 | 17.14 ± 1.19 | 17.43 ± 1.63 * | 18.68 ± 1.78 | 20.05 ± 1.11 | |
| PhoP C 아브라 - | 16.91 ± 1.12 | 16.96 ± 1.39 | 17.06 ± 2.14 ** | 18.71 ± 2.18 | 20.15 ± 1.56 |
| PhoP C AvrA-/AvrA + | 16.94 ± 0.96 | 17.17 ± 1.02 | 17.63 ± 1.42 * | 18.44 ± 2.03 | 20.09 ± 1.17 |
* 그룹 P에게 <0.05를 제어 비교
** 그룹 P <0.01를 제어 비교
표 2. 살모넬라균의 변종이 연구에 사용.
| 이름 | 설명 | 참조 또는 소스 |
| 살모넬라균 14028s | 야생 형 S. typhimurium | ATCC |
| PhoP C | 돌연변이 비 병원성 복잡한 조절기 | 밀러 외., 1990 |
| PhoP C 아브라 - | 아브라 - 돌연변이 | 콜리 - 하이엄스 외., 2002 |
| PhoP C AvrA-/AvrA + | PhoP C 보완 플라스미드 인코딩 아브라 아브라 -로 | 콜리 - 하이엄스 외., 2002 |
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Discussion
이 시스템을 사용하려면, 그것은 동물을 gavage하는 방법을 알아보려면 연구자가 필요합니다. 박테리아 문화를 준비하고 쥐를 gavage 위해 우리는 세부 방법론을. 우리는 또한 위장 (GI) 트랙트에서 살모넬라균 지속성을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 포함이 프로토콜의 중요한 단계
- 스트렙토 마이신 - 전처리 : 스트렙토 마이신 - 전처리 일부 공생 굿 식물 제거 및 살모넬라균 감염 2 민감한 쥐를 만들 수 있습니다.
- 살모넬라균 gavage : 초보자를위한, gavage가 도전 수 있습니다. 솔루션 실수로기도에 주입하고 마우스 사망의 원인이되기 때문에 언젠가, gavage가 실패합니다.
- 영구 세균성 식민지가 : 가까이 GI 트랙트의 모니터링 박테리아가 필요합니다. 마우스 배설물 문화뿐만 아니라,이게 맹장의 내용도 BBL CHROMagar 플레이트에서 살모넬라균 검출에 사용될 수 있습니다. 마우스가 살모넬라균 감염 후 희생 때이게 맹장 내용을 수집합니다.
우리는 서로 다른 농도로 마우스에있는 살모넬라균의 식민지를 테스트한 : 1 X 10 8 식민지 - 형성 단위 (100 μl / 마우스) 1 X 10 3 식민지 - 형성 단위. 1 X 10, 살모넬라균은 쥐를 식민지 수 6-10 X 10 8 식민지 - 형성 단위되었습니다. 따라서, 우리 이전의 출판물 1, 5 및되지 않은 데이터를 바탕으로,이 용액에 살모넬라균의 최종 농도는 gavage 전에 측정되지 않습니다.
이 실험 절차, 우리는 특정 - 병원체가없는 여성 C57BL / 6~7주 살 때 6 마우스 (타코닉, 허드슨, NY)를 사용합니다. 사용 박테리아 변종이 살모넬라균의 typhimurium 야생 형 변형 ATCC14028s (WT - SL)를 포함, 비 병원성 살모넬라균 돌연변이 스트레인 PhoP C3, C PhoP 아브라 -, 그리고 PhoP C AvrA-/AvrA +, C PhoP 아브라 (표 2). 이 프로토콜을 사용하여 살모넬라균의 typhimurium의 식민지가 6 개월 (Fig1) 마우스 소장에서 검색된 수 있습니다. 살모넬라균 감염과 염증이 대변과 소년 체중을 관찰하여 측정되었다. 조직 샘플과 혈액 수집되었을 때, 소장의 길이는 창자 염증의 기능으로 측정되었습니다. spleens와 간은의 무게도 조사했다. 마우스 혈청의 시토킨은 ELISA5에 의해 테스트되었습니다. 더 많은, 생화학 및 분자 방법은 더욱 살모넬라균 5 유도된 염증 시토킨의 변화와 병리 변화를 테스트하는 데 사용됩니다.
일반적으로, 체중 감소와 죽음 4 주 게시물 감염 (표 1) 이내에 발생합니다. 포스트 살모넬라균 감염은 박테리아 치료하지 않고 통제 그룹에 비해 세균 감염 그룹에서 상당한 체중 감소가 발생했습니다 (* P <0.05 또는 P <0.001 표 1). 체중은 매주 측정되었다. 생존 비율 4 주 게시 감염이 그림에 표시했다. 2. 전반적으로, 생쥐 92 % (N = 50) 살모넬라균 변종에 감염 PhoP C, 78% PhoP C 아브라 - 또는 70% PhoP C AvrA-/AvrA + 대장에 영구적인 살모넬라와 함께 살아남을 수 있음을 보였다. 급성 감염 후 모든 생존자는 아직이 제안에 설명된 방법을 사용 육개월 게시물 감염을 포착할 수있는, 살모넬라균를 실었다. 일단 마우스 3 주 게시물 감염 생존, 마우스는 체중을 얻게하고 더 적은 죽음 (Fig.2)가 발생했습니다. 또한, immunofluroscence의 얼룩 데이터는 장의 점막 27주 게시물 감염 (Fig.3)에서 살모넬라균의 침공을 보여줍니다. 이러한 데이터는 보여주 PhoP C, C PhoP 아브라 - 또는 PhoP C AvrA-/AvrA + 만성 감염 모델을 사용할 수 있습니다.
호스트 저항 계수 Nramp1와 쥐 + / + 살모넬라균 감염 3-6에 강한 있습니다. Nramp와 C57/BL6 마우스에 결함이 현재 연구에 사용되었다. 우리는 병원성 살모넬라균 스트레인 14028s에 감염된 90 % 마우스는 4 주 (데이터가 표시되지 않음)을 통해 살아남을 수있는 것으로 나타났습니다. 야생 형 S. Typhimurium 감염의 장기적인 효과를 이해하기 위해서, Nampr1와 생쥐는 + / + 사용할 수 있습니다.
이 모델은 BSL - 2 연구실에 설립됩니다. 우리 프로토콜 동물 자원 (UCAR)에서 로체스터 대학위원회의 대학에 의해 승인됩니다. 살모넬라균에 감염된 마우스는 불편과 고통을 경험하게하고 덜 활성화되어 천천히 이동할 가능성이 높습니다. 그들의 모피가 쓸 될 수 있습니다 그리고 그들은 피드 또는 일반 음료하지 않을 수 있습니다. 동물 밀접하게 준수하고 될 경우 같은 불편의 흔적 마우스 그것이 액체 또는 중대한 체중 감소 (10 % 이상) 7 aspirated했다는 표시를 갖게하며 않은 경우 수화와 열량 섭취를 유지하기 위해 충분히 ambulate 수 없습니다 즉시 죽지, 마우스가 편안하게 euthanized되었다. 모든 실험실 직원은 교육을 것입니다적절하게 쥐를 8, 9 관찰.
많은 연구는 스트렙토 마이신 - 전처리가 감염 1,2,10의 초기 단계에서에 대한 연구 살모넬라균의 typhimurium에 의해 유도된 대장염의 이점을 점령하는 데 사용됩니다. 그러나, 생체내 11 마우스 모델에서 만성 감염에 대해서만 몇 가지 보고서. GI 트랙트에서 살모넬라균 영구적인 존재와 마우스는 우리가 장기 호스트 세균 상호 작용, 신호 전달, 그리고 tumorigenesis를 탐험하실 수 있습니다. 우리는 6 개월 이상 마우스 소장에서 살모넬라균의 typhimurium의 식민지와 함께 만성 세균 감염 마우스 모델을 구축했습니다. 이 모델은 또한 E.coli의 pathogenesis와 probiotics 연구에 사용될 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜은 기본적으로 중요한 생물 학적 및 미생물 질문을 해결하기 위해 마우스 모델을 이용하여 연구를 지원합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIDDK KO1 DK075386 부여하고 Jun Sun에 미국 암 협회 RSG - 09 - 075-01 - MBC에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
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