ניתוח עדשת העין: טכניקה להתבונן מורפולוגיה עדשה זברה

Overview

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול שפותח כדי לנתח עדשות זברה למבוגרים וזחלים כדי לנתח מורפולוגיה של עדשות קליפת המוח ושלמות מבנית של תפרי העדשה.

Protocol

1. ניתוח של עדשות זברה זברה למבוגרים

1. יש להרדים דגים מזחלים של 6 dpf ועד לבגרות עם טריקאין עד שאינם מגיבים למגע אך עדיין מראים דופק חזק. מדוד אורך דגים סטנדרטי לפי שילינג (2002) לאחסון זמני.
2. מיד בלו עיניים באמצעות מספריים מיקרו-דיסקציה ומניחים לתוך צלחת דיסקציה ב- PBS (איור 1 מוצג לעיניים בוגרות).
   1. הפוך צלחת מותאמת אישית 35 מ"מ מלא סיליקון עבור ניתוחי עדשה. לאחר סיליקון להגדיר, excise divot סביב 2-3 מ"מ קוטר ו 0.5 מ"מ עמוק עבור קיבוע עיניים מבוגרים / עדשות במהלך הניתוח.
3. ניתוח עדשות זברה למבוגרים
   1. מניחים עין בוגרת לתוך הצד האחורי חלוקת המנה למעלה מלא PBS. שתק את העין על-ידי החדרת מלקחיים בזווית <45° דרך הדיסק האופטי. היזהר לא לחתוך או לדחוס את העדשה. הפוך שניים או שלושה חתכים רדיאליים דרך רשתית וסקלרה מדיסק אופטי לאזור ciliary עם מספריים דיסקציה.
   2. מקלפים בחזרה את הרשתית והסקלרה כמו עלי כותרת של פרחים ומהפוך את העין, צד הקרנית כלפי מעלה. לשתק את העדשה בעקיפין באמצעות מניפולציה של סקלרה וקרנית עם הצד השטוח של המספריים, תוך משיכת הרשתית ורקמות מחוברות עם מלקחיים. בזהירות לקצץ רקמה עודפת מהעדשה.
      שים לב: חיוני לנתח בזהירות כדי להשיג עדשות בריאות באופן עקבי.
4. ניתוח עדשות זברה זחל
   1. מניחים צד אחורי של עין הזחל כלפי מעלה על החלק השטוח של צלחת הסיליקון מלא PBS ולהשתמש מחט טונגסטן מחודד לעשות חתכים רדיאליים דרך הרשתית ואת סקלרה תוך קיבוע העין עם מחט טונגסטן אחר או מלקחיים.
      שים לב: היזהר לא לפגוע בעדשה.
      1. לחדד את הקצה של אורך 2 ס"מ של חוט טונגסטן 0.1 מ"מ אלקטרוליטי על ידי השעיית קצה החוט לתוך 10% (w / v) NaOH והחלת מתח נמוך לסירוגין-זרם14. לאבטח את המחט לתוך פיפטה פסטר על ידי המסת קצה הזכוכית באמצעות מבער Bunsen.
         שים לב: ניתן להשתמש גם בכלי ניתוח עדינים חלופיים.
         אזהרה: NaOH הוא מאכל.
   2. מוציאים בעדינות את העדשה מהעין המנותקת עם צד קהה של המחט, ומרחיקים בזהירות את הרקמה המחוברת.

Representative Results

איור 1: ניתוח עדשת זברה. (א) העיניים מנותחו מדגים מורדמים ומונחות בצד האחורי למעלה (B). (ג) העיניים משותקות על ידי מלקחיים באמצעות הדיסק האופטי (od) ושניים עד שלושה חתכים רדיאליים נעשים ברשתית וסקלרה מהדיסק האופטי לזונולים. (ד) מקפלים את המדפים החוצה כדי לחשוף את העדשה. (ה) לסובב את העין כדי להתמודד עם הקרנית למעלה, לשתק את העדשה בעקיפין דרך הקרנית ולהרחיק את סקלרה-רשתית. (ו) לקצץ את הרשתית הנותרת ואת אזור ciliary / zonules מהעדשה

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A