Overview
이 비디오는 피질 렌즈 형태와 렌즈 봉합사의 구조적 무결성을 분석하기 위해 성인 및 애벌레 얼룩말 렌즈를 해부하기 위해 개발된 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
1. 라발 과 성인 얼룩말 피시 렌즈의 해부
- 6 dpf 애벌레에서 트리카인으로 성인기에 물고기를 마취하여 터치에 반응하지 않지만 여전히 강한 심장 박동을 보여 줍니다. 스테이징을 위해 쉴링(2002)에 따라 어류 표준 길이를 측정합니다.
-
마이크로 해부 가위를 사용하여 즉시 눈을 소비하고 PBS (성인 눈에 표시된 그림1)에서 해부 접시에 넣습니다.
- 렌즈 해부를 위한 실리콘으로 채워진 맞춤형 35mm 접시를 만드십시오. 실리콘이 설정되면 직경 2-3mm, 깊이 0.5mm의 디봇을 소비하여 해부 시 성인 눈/렌즈를 고정합니다.
-
성인 제브라피시 렌즈 의 해부
- PBS로 가득 찬 접시 디봇 후방 쪽에 어른의 눈을 놓습니다. 광학 디스크를 통해 집게를 /lt;45° 각도로 삽입하여 눈을 고정합니다. 렌즈를 닉하거나 압축하지 않도록 주의하십시오. 광디스크에서 해부 가위를 가진 섬모 영역까지 망막과 스클레라를 통해 2~3개의 방사형 절개를 만드세요.
- 망막과 꽃잎처럼 껍질을 벗기고 눈을 반전, 각막 측면을 위로. 망막과 부착된 조직을 집게로 당기면서, 가위의 평평한 면으로 클레라와 각막의 조작을 통해 렌즈를 간접적으로 고정시합니다. 렌즈에서 과도한 조직을 조심스럽게 다듬습니다.
참고: 일관되게 건강한 렌즈를 얻기 위해 신중하게 해부하는 것이 중요합니다.
-
애벌레 제브라피시 렌즈 해부
- PBS로 채워진 실리콘 접시의 평평한 부분에 애벌레 눈 후방 측면을 놓고 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 망막과 경쇄를 통해 방사형 컷을 만드는 동시에 다른 텅스텐 바늘이나 집게로 눈을 고정시십시오.
참고: 렌즈를 손상시키지 않도록 주의하십시오.- 와이어 팁을 10%(w/v) NaOH로 일시 중단하고 저전압 교대-전류14를 적용하여 전동적으로 0.1mm 텅스텐 와이어의 2cm 길이의 끝을 선명하게 합니다. 번센 버너를 사용하여 유리 끝을 녹여 파스퇴르 파이펫에 바늘을 고정하십시오.
참고: 대체 미세 해부 도구도 사용할 수 있습니다.
주의: NaOH는 부식성입니다.
- 와이어 팁을 10%(w/v) NaOH로 일시 중단하고 저전압 교대-전류14를 적용하여 전동적으로 0.1mm 텅스텐 와이어의 2cm 길이의 끝을 선명하게 합니다. 번센 버너를 사용하여 유리 끝을 녹여 파스퇴르 파이펫에 바늘을 고정하십시오.
- 바늘의 무딘 면으로 분리 된 눈에서 렌즈를 부드럽게 떠서 부착 된 조직을 조심스럽게 꺼냅니다.
- PBS로 채워진 실리콘 접시의 평평한 부분에 애벌레 눈 후방 측면을 놓고 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 망막과 경쇄를 통해 방사형 컷을 만드는 동시에 다른 텅스텐 바늘이나 집게로 눈을 고정시십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 1: 제브라피쉬 렌즈 해부. (A) 눈은 마취된 물고기에서 해부되고 후방 측을 위로 올려 놓습니다(B). (C) 눈은 광학 디스크(od)를 통해 집게에 의해 고정되고, 2~3개의 방사형 절개는 광학 디스크에서 zonules에 이르는 망막및 클클레라로 만들어집니다. (D) 플랩을 접어 렌즈를 드러냅니다. (E) 각막을 향하도록 눈을 돌리고 각막을 통해 렌즈를 간접적으로 고정시키고 clera-망막을 당깁니다. (F) 렌즈에서 남은 망막과 섬모 영역/zonules를 잘라내세요.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
Dumont #5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals |
Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A |