Göz Merceği Diseksiyonu: Zebra Balığı Lens Morfolojisini Gözlemleme Tekniği

Overview

Bu videoda, kortikal mercek morfolojisini ve mercek dikişlerinin yapısal bütünlüğünü analiz etmek için yetişkin ve larva zebra balığı lenslerini parçalamak için geliştirilen protokol açıklanmaktadır.

Protocol

1. Larva ve Yetişkin Zebra Balığı Lenslerinin Diseksiyonu

1. Balıkları 6 dpf larvadan yetişkinliğe trikain ile dokunmaya duyarlı olmayan ancak yine de güçlü bir kalp atışı gösterene kadar uyuşturmak. Sahneleme için Schilling (2002) başına balık standart uzunluğunu ölçün.
2. Mikro diseksiyon makası kullanarak gözleri hemen kesin ve PBS'de bir diseksiyon kabına yerleştirin (Yetişkin gözler için gösterilenŞekil 1).
   1. Lens diseksiyonları için silikonla doldurulmuş özel bir 35 mm'lik bir tabak yapın. Silikon ayarlandıktan sonra, diseksiyon sırasında yetişkin gözlerini / lenslerini hareketsizleştirmek için yaklaşık 2-3 mm çapında ve 0,5 mm derinliğinde bir divot kesin.
3. Yetişkin zebra balığı lenslerinin diseksiyonu
   1. PBS ile dolu çanak divot posterior tarafına yetişkin bir göz yerleştirin. Optik diskten <45° açıyla tokmak takarak gözü hareketsiz hale getirin. Lensi çalmamaya veya sıkıştırmamaya dikkat edin. Diseksiyon makası ile optik diskten silier bölgeye retina ve sklera yoluyla iki veya üç radyal kesi yapın.
   2. Retinayı ve sklerayı çiçek yaprakları gibi soyun ve gözü ters çevirin, kornea tarafı yukarı. Lensi, sklera ve korneanın makasın düz tarafıyla manipülasyonu yoluyla dolaylı olarak hareketsiz hale getirirken, retinayı ve bağlı dokuları kürsülerle çekin. Lensteki fazla dokuyu dikkatlice kırpın.
      NOT: Sürekli sağlıklı lensler elde etmek için dikkatlice diseksiyon yapmak çok önemlidir.
4. Larva zebra balığı lenslerinin diseksiyonu
   1. PBS ile dolu silikon kabın düz kısmına bir larva gözü posterior tarafı yerleştirin ve gözü başka bir tungsten iğnesi veya tostu ile hareketsiz hale getirirken retina ve skleradan radyal kesikler yapmak için keskinleştirilmiş bir tungsten iğnesi kullanın.
      NOT: Lense zarar vermemeye dikkat edin.
      1. Tel ucunu %10 (w/v) NaOH'a asarak ve düşük voltajlı alternatif akım14 uygulayarak 0,1 mm tungsten telin 2 cm uzunluğundaki ucunu elektrolitik olarak keskinleştirin. Bunsen brülörü kullanarak cam ucunu eriterek iğneyi pastör pipete sabitleyin.
         NOT: Alternatif ince diseksiyon araçları da kullanılabilir.
         DİkKAT: NaOH aşındırıcıdır.
   2. Lensi, iğnenin künt bir tarafıyla ayrışmış gözden hafifçe çıkarın ve bağlı dokuyu dikkatlice çekin.

Representative Results

Şekil 1: Zebra balığı lens diseksiyonu. (A) Gözler uyuşturulmuş balıklardan parçalara ayırılır ve arka taraf yukarı (B) yerleştirilir. (C) Gözler optik disk (od) üzerinden apletlerle hareketsiz hale getirilir ve optik diskten zonüllere kadar retina ve sklerada iki ila üç radyal kesi yapılır. (D) Lensi ortaya çıkarmak için kapakları katlayın. (E) Gözü korneaya bakacak şekilde döndürün, lensi kornea aracılığıyla dolaylı olarak hareketsiz hale getirmek ve sklera-retinayı çekin. (F) Kalan retina ve silier bölgeyi/zonülleri lensten kesin

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A