Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

Summary

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectoren worden steeds waardevol voor

Abstract

In de afgelopen jaren recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV) zijn steeds waardevol zijn voor in vivo studies bij dieren, en zijn momenteel ook getest in klinische proeven op mensen. Wild-type AAV is een niet-pathogene lid van de parvoviridae familie en inherent replicatie-deficiënt. De brede transductie profiel, lage immuunrespons, alsmede de sterke en aanhoudende transgenexpressie bereikt met deze vectoren heeft hen een populair en veelzijdig hulpmiddel voor in vitro en in vivo gen delivery. rAAVs kunnen gemakkelijk en goedkoop geproduceerd in het laboratorium en, op basis van hun gunstige veiligheidsprofiel, zijn over het algemeen krijgen een lage veiligheids-classificatie. Hier beschrijven we een methode voor de productie en titering van chimère rAAVs met de capside-eiwitten van zowel AAV1 en AAV2. Het gebruik van deze zogenaamde chimere vectoren combineert de voordelen van beide ouders serotypes zoals hoge titers voorraden (AAV1) en zuiveringdoor affiniteitschromatografie (AAV2). Deze AAV serotypen zijn de best bestudeerde van alle AAV serotypes, en afzonderlijk hebben een brede infectiviteit patroon. De chimère vectoren hier beschreven moet de besmettelijke eigenschappen van AAV1 en AAV2 en kan dus worden verwacht dat een groot aantal weefsels, waaronder neuronen, skeletspieren, pancreas, nieren onder anderen besmetten. De hier beschreven methode maakt gebruik van heparine kolom zuivering, een methode vermoedelijk een hogere virale titer en schoner virale voorbereiding dan de andere zuiveringsmethoden, zoals centrifugatie door middel van een cesium chloride gradiënt te geven. Daarnaast beschrijven we hoe deze vectoren kunnen snel en eenvoudig worden getitreerd om nauwkeurige lezing van het aantal geproduceerde infectieuze deeltjes te geven.

Protocol

Zie figuur 1 voor een illustratie waarin de volgende protocol.

Veiligheid Opmerking: Alle materiaal dat in contact is geweest met de gemonteerde virale deeltjes moet worden gedesinfecteerd met Virkon oplossing of een ander geschikt desinfectans.

1. De voorbereiding van plasmide DNA voorraden (~ 2 dagen)

1. De volgende plasmiden zijn vereist ^een:
   • pRV1 - bevattende de AAV2 Rep en Cap sequenties
   • pH21 - bevattende de AAV1 Rep en Cap sequenties
   • pFdelta6 - Adenovirus-helper plasmide
   • AAV plasmide dat het recombinante expressiecassette geflankeerd door AAV2 verpakking signalen (inverted terminal repeats, ITRs)
2. Terwijl pFdelta6 moeten worden gekweekt in Stbl2 competente cellen op gedeeltelijke verwijdering te voorkomen, kan pRV1 en pH21 worden gekweekt in DH5alpha competente cellen. AAV plasmiden kunnen worden geteeld in Stbl2 cellen als partiële deleties optreden in DH5alpha cellen.
3. Plasmide DNA moet van hoge kwaliteit en vrij van verontreinigingen RNA. Plasmiden kunnen worden gescreend op integriteit met de volgende verteert:
   • pRV1 - verteren met Xbal aan banden van 7,5 kb en 3,8 kb te geven
   • pH21 - verteren met EcoRI om banden van 4,5 kb, 2,8 kb en 0,2 kb te geven
   • pFdelta6 - verteren met HindIII om banden van 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb en 1,5 kb te geven

2. Voorbereiding van de Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) cellen voor transfectie (2 - 3 dagen)

1. Plaat twee 80% confluent 150 cm ² flessen van HEK293 cellen in vijf 15 cm diameter Nunc weefselkweek gerechten. De cellen moeten worden 70 - 80% samenvloeiende voor transfectie (ongeveer 48 uur na plating). Cultuur cellen in standaard Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met een lage glucose met 10% foetaal kalf serum en 100 U / ml penicilline / 100 ug / ml streptomycine.
2. 3 uur voor transfectie te verwijderen DMEM en te vervangen door Iscove'S gewijzigde Dulbecco's medium (IMDM) met 5% foetaal kalf serum.

3. Transfectie van virale plasmiden (~ 1 uur voor transfectie, drie dagen voor de incubatie)

1. Bereid het volgende voor een enkele partij (5 x 15 cm weefselkweek platen) van het virus:
   • 62,5 microgram AAV plasmide
   • 125 ug pFdelta6
   • 31.25 microgram pRV1
   • 31.25 microgram pH21
   • 1650 pl 2,5 M CaCl ₂
   • 12 ml dH ₂ O
2. In een klasse 2 weefselkweek kap steriel filter van de transfectie mengsel in een 50 ml buis.
3. Terwijl vortexen de oplossing, snel toevoegen van 13 ml 2 x HEPES-gebufferde zoutoplossing (pH 7,05). Vervang de deksel van 50 ml buis en blijven vortex gedurende 15 seconden. Laten staan ​​gedurende 1 minuut 45 seconden, moet een fijne witte neerslag te vormen.
4. Zachtjes voeg 5 ml van de transfectie oplossing voor elke 15 cm weefselkweek schotel. Swirl platen te mengen en terug te keren naar incubator.
5. 16 uur na transfectie verwijderen IMDM medium en te vervangen door DMEM.

4. Lyseren van cellen en het oogsten van rAAVs (2 uur)

1. 72 uur na transfectie, verwijder media uit celkweek platen en gooi deze weg. Al het afval dient te worden behandeld met Virkon oplossing of een ander geschikt desinfectans.
2. Voorzichtig de cellen wassen in warm 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4).
3. Voeg 25 ml warm PBS aan elk bord en verwijder voorzichtig cellen met een cel schraper. Verzamel suspensie in 50 ml buizen.
4. Pellet cellen op 800 xg gedurende 10 minuten.
5. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, gebruik van 10 ml per weefselkweek plaat. Opgesplitst in twee 50 ml buizen.
6. Bereid een verse oplossing van 10% natriumdeoxycholaat in dH ₂ O. Voeg 1,25 ml van deze aan elke buis voor een uiteindelijke concentratie van 0,5%. Voeg benzonase nuclease tot een uiteindelijke concentratie van 50 eenheden per ml. Meng grondig buis.
7. Verwijder de cellulaire puin door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 15 minuten. Transfer naar verse 50 ml tube, ervoor zorgen dat alle celafval is verwijderd om te voorkomen dat het blokkeren van heparine kolommen (zie stap 5). In dit stadium kunnen de monsters worden bewaard bij -20 ° C voordat u verder gaat. Wij hebben opgeslagen monsters gedurende enkele weken bij -20 ° C zonder een vermindering van de besmettelijkheid.

5. Heparine kolom zuivering van rAAVs (2 - 3 uur)

1. Setup HiTrap heparine kolommen met behulp van een peristaltische pomp, zodat oplossingen stroming door de kolom van 1 ml per minuut voor de stappen die 5,2 tot 5,4. Het is belangrijk om te controleren of er geen luchtbellen worden ingebracht in de heparine kolom.
2. Evenwicht van de kolom met 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0.
3. Van toepassing zijn 50 ml virus oplossing naar kolom en laat doorstromen.
4. Was kolom met 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0.
5. Met behulp van een 5 ml spuit blijft de kolom w wassenet 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, gevolgd door 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Gooi de flow-through.
6. Met behulp van 5 ml spuiten en lichte druk elueren van het virus uit de kolom door het toepassen van:
   • 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0
   • Verzamel deze in een 15 ml centrifugebuis.

6. Concentratie en steriele filtratie van rAAVs (1 uur)

1. Concentreer je vector met behulp van Amicon ultra-4 centrifugaal filter units met een moleculair gewicht 100.000 cutoff. Laad 4 ml eluaat van de kolom in de concentrator en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 2 minuten (op kamertemperatuur). Gooi doorstroomsysteem en reload concentrator met de resterende virus oplossing en herhaal centrifugeren. De geconcentreerde volume moet ongeveer 250 ul worden. Als geconcentreerde volume is aanzienlijk meer dan dit, gooi de stroom through en blijven centrifuge in een minuut stappen tot het volume is ongeveer 250 ul.
2. Voeg 250 ui PBS om virus voor een eindvolume van 500 pi en verwijderen van de concentrator.
3. Filter vector door middel van een 13 mm doorsnede 0,2 micrometer spuitfilter. Vector moet gealiquoteerd en bewaard bij -80 ° C tot de gewenste.

7. Titering van virale voorraden (3 dagen)

Dit vereist een promotor die actief is in HEK293 cellen besturen van een reportergen of een immunocytochemically detecteerbaar genproduct. Bij het produceren van een vector die niet compatibel is met HEK293 cellen andere cellijnen of primaire celculturen worden gebruikt.

1. Bereid 18 poly-L-lysine gecoat glas dekglaasjes of 18 putten van Nunc kamer dia's door zaaien HEK293 cellen, zodat deze zijn 40 - 50% confluent. Voor de titratie van Cre-afhankelijke rAAVs gebruiken HEK293 cellen die stabiel uitdrukken Cre recombinase ^2.
2. Infecteren elk putje met een seriële dilutions van de AAV-vector (afb. 2A). Gebruik 3 putten per verdunning. We routinematig direct toe te voegen virus aan elke well.
3. Na 72 uur vast HEK293 cellen door het toevoegen van een gelijk volume van 4% paraformaldehyde (PFA) tot middelgrote (het geven van een uiteindelijke concentratie van 2% PFA) gedurende tien minuten bij kamertemperatuur.
4. Was de cellen drie keer in PBS, spoelen in dH ₂ O en dekglaasje aan.
5. Tel het aantal getransduceerde cellen van de drie putten die de hoogste verdunning factor hebben, maar bevatten nog steeds geïnfecteerde cellen, vind het gemiddelde van deze en vermenigvuldigen met de verdunningsfactor om het aantal infectieuze eenheden per microliter (Fig 2B) te geven.

8. Verwachte resultaten

HEK293 cellen getransduceerd met een virus dat codeert voor versterkt groen fluorescent eiwit (eGFP) zijn weergegeven in figuur 2B. Wij over het algemeen een consistente titers van ongeveer 6 x 10 ⁶ infectieuze deeltjes per micro liter. We routinematig gebruik van deze vectoren voor stereotaxische injectie in de volwassen knaagdieren hersenen. Dit zorgt voor een krachtige techniek voor de regio-specifieke genexpressie ^2. Naar deze regio specificiteit te combineren met cell-type selectieve genexpressie we Cre recombinase-afhankelijke rAAVs injecteren in doel gebieden van Cre-transgene muizen ^2. Figuur 2C-E toont voorbeelden van stereotaxische injecties van Cre-afhankelijke rAAVs codering eGFP in verschillende gebieden van de hersenen van volwassen parvalbumin-Cre transgene muizen ^3.

Figuur 1. Schematische weergave van het protocol voor rAAV productie. 1.) HEK293 cellen worden uitgeplaat en gekweekt tot 70 - 80% samenvloeiing. 2.) AAV en helper plasmiden worden voorbereid en getransfecteerd in HEK293 cellen. 3.) Medium is terug veranderd naar DMEM 16 uur na transfectie en HEK293 cellen worden gekweekt voor een ander 56 uur. 4.) HEK293 cellen geoogst en gelyseerd. rAAV vectoren zijn gescheiden van celresten door centrifugation. 5.) Virale deeltjes worden gezuiverd door middel van heparine kolommen voordat de concentratie en sterilisatie. 6.) HEK293 cellen worden gekweekt op 24 goed platen en met seriële verdunningen van de AAV-vector om het aantal infectieuze eenheden te bepalen infecteren.

Figuur 2. Titering en in vivo toepassing van rAAV1 / 2. (A) Instellen van HEK293 cellen voor het meten van virale titer. HEK293 cellen zijn getransduceerd met seriële verdunningen van rAAVs. C, niet-geïnfecteerde controle; N, 1 ui van onverdunde virale voorraad. (B) HEK293 cellen geïnfecteerd met rAAVs uiten eGFP. (CE) Virale eGFP expressie is beperkt tot Cre expressie neuronen in verschillende doelgroepen regio's van parvalbumin-Cre transgene muizen na stereotaxische injectie van Cre-geactiveerde rAAVs. Voorbeelden beelden tonen GFP immunoreactiviteit in (C) van de thalamus en reticulaire globus pallidus, (D) de dentate gyrus en (E) de CA1 regio van de hippocampus. DG, dentate gyrus, RT, reticulaire thalamus kern; GP, globus pallidus. Schaal bars: B, 500 micrometer, C, 100 micrometer, D, 100 micrometer, E, 500 pm.

Discussion

rAAV vectoren zijn steeds waardevol zijn voor in vivo studies bij dieren. Hier hebben we beschreven een eenvoudige en goedkope protocol voor de productie van rAAVs, die de brede toepassing van deze nuttige vector te vergemakkelijken door het vermijden van de dure uitbesteding van het virus de productie aan bedrijven. Het protocol (op basis van referentie 1) beschrijft de productie van chimère rAAV1 / 2 vectoren die capside-eiwitten van beide ouders serotypes bij gelijke verhoudingen ^4. De zuivering van het rAAV vectoren door te binden aan heparine kolommen is afhankelijk van de expressie van AAV2 capside-eiwitten, maar kan worden gecombineerd met andere serotypes dan AAV1 hier geschetst. Daarnaast is AAV6 gemeld dat bindt aan heparine, zij het ​​met een verminderde affiniteit, en zou kunnen worden gezuiverd met heparine kolommen met deze procedure ^5,6. Het dient echter te worden opgemerkt, dat de andere serotypes zullen verschillende concentraties van NaCl voor heparine kolom-elutie ^{5,7 vereisen.}

Verpakking rAAV genomen bleek optimaal te zijn tussen de 4,1 en 4,9 kb met een scherpe daling van de verpakking rendement tot 5,2 kb ^8. Deze verpakking limiet kan worden beschouwd als de grootste nadeel van het rAAV systeem, aangezien celtype-specifieke regulering van transgene expressie wordt meestal bereikt door grote cis werkende elementen die niet kunnen worden ondergebracht binnen de kleine AAV deeltjes. Te overwinnen lage titer partijen, zoals die welke voortvloeien uit proberen te pakket genen die dicht bij de AAV verpakking te beperken, hebben wij de combinatie van verschillende virale partijen geconcentreerd tot 250 ul in een 500 pi partij, in plaats van het toevoegen van PBS, zoals beschreven in stap 6.3. Betrouwbare cel-type specifieke transductie kan worden bereikt door het combineren van Cre-driver muizen en voorwaardelijke rAAV cassettes (zie hieronder) om te voorkomen dat het rekken van de verpakking te beperken.

Van de nota, terwijl dit protocol pogingen om gemakkelijk te volgen instructies te geven over de productie van hoge titer rAAV, vereist de aanwezigheid van AAV2 capside-eiwit eenheden voor de zuivering van heparine affiniteitschromatografie. Serotypes dan AAV2 moet worden gezuiverd met behulp van alternatieve procedures ^9. Een voordeel van heparine kolom zuivering is het wordt verondersteld om AAV vectoren die een grotere snelheid dan infectiviteit geproduceerd die gebruik maken van een cesium chloride gradiënt ¹⁰ zijn te produceren. Er zijn echter ook enkele nadelen aan deze methode. Bijvoorbeeld, kunnen andere eiwitten die heparine binden ook aanwezig zijn in het gezuiverde virale voorraad. Terwijl het tropisme van heparine-gezuiverde vectoren kan worden beïnvloed door de vector titer ^10, onze benadering van specifiek te richten ofwel prikkelende ²⁰ of remmende neuronen (fig. 2) maakt gebruik van Cre-geïnduceerde activatie van AAV-gemedieerde transgen expressie en is titer-onafhankelijk. Een alternatief voor heparine kolom zuivering is het gebruik van een iodixanol dichtheidsgradiënt, die een hogere virale titer en zuiverder dan de voorbereiding van het gebruik van produceerteen cesium chloride gradiënt ^10. Deze methode kan ook worden gecombineerd met heparine kolom zuivering om een vector die groter is dan 99% zuiver ¹¹ te produceren. Daarom is een zorgvuldige afweging moet worden genomen door individuele groepen welke virale zuiveringsmethode het beste is voor hun specifieke downstream toepassing.

Het meest voorkomende probleem in verband met dit protocol is een lage virale titer. In onze ervaring kan dit meestal worden teruggevoerd op een lage transfectie-efficiëntie of de elutie van het virus uit de heparine kolommen. Alle transfectie materialen moeten op kamertemperatuur voor transfectie, en test transfecties dient te worden uitgevoerd om de optimale omstandigheden in elk laboratorium te vinden. Andere methoden van transfectie, zoals lipofectamine, zijn zeer efficiënt, maar kan worden onbetaalbaar. Daarnaast is de concentratie en pH van de heparine kolom-elutie-oplossingen is van cruciaal belang voor een volledige elutie van virionen van heparine kolommen Handsfree Console verschaft bestuurdut schade. Een ander belangrijk punt is dat de verpakking cellen goed moet zich houden aan het oppervlak van de weefselkweek gerechten. Als de cellen op een bepaald moment los te maken tijdens de procedure wordt geadviseerd om het experiment en het ontdooien van een nieuwe flacon van cellen te beëindigen.

Spatio-temporele controle van transgen-expressie bij knaagdieren wordt gemakkelijk bereikt door nauwkeurige anatomische richten en het ontwikkelingsstadium van het dier. Efficiënte AAV-gemedieerde genoverdracht is aangetoond in de baarmoeder ^12,13. In het volwassen brein, kan het gebied besmet zijn met rAAV deeltjes na stereotaxische injectie worden aangepast van zeer kleine specifieke regio's, veel grotere gebieden, niet alleen door veranderingen in het virale titer, maar ook door het veranderen van de injectie parameters. Deze omvatten het volume en de snelheid van injecties en het opnemen van de polyol mannitol met het virus vering ^14. Mannitol kan ook worden gebruikt om infectie van een verscheidenheid van weefsels na de systemische rAAV injectie ¹⁵ te vergroten ^</ Sup>.

De verpakking capaciteit van rAAV (ongeveer 4,7 kb) is waarschijnlijk de meest beperkende factor in termen van de genen die uitgedrukt kan worden uit deze virale vectoren. Echter, recente studies aangetoond dat dit kan deels worden ondervangen door het splitsen van grote genen of expressiecassettes in afzonderlijke rAAV vectoren en de invoering van een overbrugging volgorde, het initiëren van genexpressie als virionen dezelfde cel ¹⁶ infecteren. Expressie van genen die door rAAV vectoren kan ook sterk worden verbeterd door gebruik te maken zelf een gratis rAAV vectoren ^17. Stereotaxische injectie van rAAV vectoren zorgt voor een snelle, goedkope en krachtige methode voor het induceren van genexpressie in een regio-specifieke wijze. In combinatie met twee ^{van de tweede} generatie RNA-interferentie strategieën ¹⁸ rAAVs kan ook gebruikt worden voor regio-specifiek gen-knock down. rAAVs kan worden gecombineerd met Cre-transgene muizen of cel-type-specifieke promotors voor circuit-en cel-type te bereiken-Specifieke genexpressie, waardoor genetische manipulaties met een hoge ruimtelijke resolutie ^2,19-21, terwijl de montage rAAVs met bv het tet systeem voegt tijdelijk de controle over virus-gemedieerde genexpressie ^22,23. Deze voorbeelden illustreren de enorme combinatorische potentieel van deze vectoren en voorspellen een snelle stijging van de rAAV op basis van studies door de jaren heen te komen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon Ultra centrifugal filters	EMD Millipore	UFC810024	100,000 MWCO
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM)	Invitrogen	10567014	Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin
Hek293 cells	American Type Culture Collection	CRL-1573	Use at passage less than 30
HEPES buffered saline	Sigma-Aldrich	51558
HiTrap Heparin cartridge	Sigma-Aldrich	54836
Iscove’s modified Dulbecco’s medium	Invitrogen	12440-053	Supplement with 5% FCS
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D5670	Make fresh solution for each batch
15 cm Tissue culture dishes	Fisher Scientific	157150
Stbl2 competent cells	Invitrogen	10268-019
Virkon solution	Fisher Scientific	NC9821357	Leave to disinfect overnight before discarding to drain
Table 1. Specific reagents required for protocol