Abstract
ثنائي الفوتون المجهري (TPM) على الحصول على الصور في مناطق عميقة داخل الأنسجة والأعضاء. في تركيبة مع تطوير أدوات جديدة المجسم والعمليات الجراحية ، TPM تصبح تقنية قوية لتحديد "منافذ" داخل الأجهزة الخلوية وثيقة "السلوك" في الحيوانات الحية. بينما intravital التصوير يوفر المعلومات التي تمثل أفضل السلوك الحقيقي الخلوية داخل الجهاز ، فإنه أكثر وشاقة وتتطلب من الناحية الفنية من حيث المعدات المطلوبة / الإجراءات البديلة السابقين من التصوير اكتساب الجسم الحي. وبالتالي ، فإننا تصف عملية جراحية ورواية "المجسم" حامل الجهاز الذي يتيح لنا متابعة تحركات Foxp3 + الخلايا داخل الغدة الصعترية.
Foxp3 هو المنظم الرئيسي لتوليد الخلايا التائية التنظيمية (Tregs). وعلاوة على ذلك ، يمكن تصنيف هذه الخلايا وفقا لأصلهم : أي. وتسمى الغدة الصعترية ، متباينة Tregs "طبيعيا Tregs" (nTregs) ، كما سpposed محيطيا لتحويلها Tregs (pTregs). على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن كمية كبيرة من البحوث في الأدب المتعلق النمط الظاهري وعلم وظائف الأعضاء من هذه الخلايا T ، ولا يعرف سوى القليل جدا عن التفاعلات في الجسم الحي مع الخلايا الأخرى. قد يكون هذا النقص بسبب غياب التقنيات التي من شأنها أن تسمح مثل هذه الملاحظات. البروتوكول وصفها في هذه الورقة يقدم علاجا لهذه الحالة.
لدينا بروتوكول يتكون من استخدام الفئران عارية التي تفتقر إلى التوتة الذاتية منذ لديهم طفرة المنضبطة في تسلسل الحمض النووي الذي يهدد تمايز بعض الخلايا الظهارية ، بما في ذلك الخلايا الظهارية التوتة. وكانت الفئران عارية غاما المشع وتشكيل العظام مع الكوسا (BM) من الفئران GFP / GFP Foxp3 - KI. بعد شفائهم BM (6 أسابيع) ، تلقى كل حيوان التوتة الجنينية زرع الكلى داخل الكبسولة. بعد قبول الغدة الصعترية (6 أسابيع) ، تم تخدير الحيوانات ، والتي تحتوي على الكلىتعرض الغدة الصعترية المزروعة ، حامل ثابت في جهازنا ، وأبقى في ظل الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي للتصوير بواسطة TPM. لقد تم استخدام هذا النهج لدراسة تأثير المخدرات في توليد الخلايا التائية التنظيمية.
Protocol
1. إعداد الحيوان
أجريت الايقاف الخلية BM وزرع الغدة الصعترية في ظروف معقمة : ملاحظات مهمة. أعدت تعليق BM داخل الخلية شفاطات لدينا غرفة والثقافة ، في حين تم إجراء عمليات زرع الغدة الصعترية في غرفة العمليات الجراحية التي تقع داخل منشأة الحيوانية لدينا. وكانت من اجل الحفاظ على هذه الشروط وضمان العقيم ، لم يسمح لنا لتسجيل الفيديو لدينا في هذه الأماكن. ومع ذلك ، تم تعقيمها جميع المواد الجراحية وتنظيفها مسبقا على مقاعد البدلاء مع Virkon الجراحية (صيدلي مختبرات بحوث شركة) والايثانول 70 ٪. وقد وافق جميع الإجراءات المتبعة في رعاية الحيوان واستخدام جنة المؤسسية (IACUC) وكانوا في اتفاق مع الاتحاد لحيوانات المختبر الأوروبي للجمعيات العلوم (FELASA) التوجيهات. رقم معرف غير موافقة AO10/2010. كانت كل التجارب صورة الإجراءات النهائية والموت الرحيم كانت الحيوانات مباشرة بعد نهاية الصورالاستحواذ.
إجراءات مفصلة كما يلي :
- أشرق (مع irradiator - γ) 8 الاسبوع الفئران عارية قديمة مع 900 راد لتدمير السلائف الذاتية للدم داخل العظم الكوسا (BM). بعد التشعيع ، وعودة الحيوانات إلى أقفاصها حتى تقوم بإعداد الخلايا المانحة BM عن الحقن في الوريد وإعادة BM أخرى. تم تنفيذ هذا النقل BM 1 ساعة بعد التشعيع.
- فصل الحيوانات المانحة BM. وTibias femurs من أطرافه الخلفية للحيوان واحد عادة ما تكون كافية لإعادة بناء ما يصل الى المتلقي الحيوانات 3. بعد القتل الرحيم مع CO 2 ، إزالة أطرافه الخلفية ومن ثم إزالة الجلد والعضلات من العظام.
- قطع نهاية مغلقة من كل العظام والاحمرار مع برنامج تلفزيوني (أو RPMI) أو سحق كل منهم في بمدافع الهاون ، وذلك باستخدام مدقة ، مع 2 مل من برنامج تلفزيوني (أو RPMI) لإزالة BM.
- تعطيل البنية BM الى تعليق وحيد الخلية التي تكرار USI تطلع قويةنانوغرام ماصة P1000. بدلا من ذلك ، يمكنك أيضا تمرير BM طوال إبرة حقنة 21G عدة مرات. الطرد المركزي (400g ، 5 دقائق ، RT) ، وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني ، وحقن في الوريد إلى متلقين عارية - المشع الخاص. في تجاربنا استخدمنا BM - KI من Foxp3 GFP / الفئران GFP فيه جميع الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ستبدي GFP 1.
- قبول BM المانحة يحدث في الأيام الأولى بعد نقل ، لأن غير BM - المعاد الحيوانات لا يمكن البقاء على قيد الحياة أكثر من 14 يوما. ومع ذلك ، ينبغي للمرء أن ينتظر لمدة 4 الى 6 أسابيع للسماح للانتعاش الكامل من جميع المقصورات BM. Bactrim (روش) وأضيفت إلى الماء (2 ملغ / مل) خلال الأسبوع الأول بعد التشعيع لتقليل مخاطر العدوى البكتيرية.
- وقد وصفت بالفعل زرع الغدة الصعترية الجنينية 2. لفترة وجيزة ، بدء تربية أزواج من الفئران إسوي والتحقق من توصيل (دليل على الجماع) كل يوم. منفصلة موصولة إناث و 2 - CO الموت ببطء لهم في يوم 15 من pregnancy (المراقبة من المكونات هو يوم 1 من الحمل). إزالة الأجنة وthymuses و. ضع thymuses الجنينية في برنامج تلفزيوني الباردة حتى نقلها.
- لتنفيذ عمليات زرع thymuses ، BM - تخدير الفئران عارية مع المتلقي ketamin (120 ميكروغرام / غرام من وزن الفأر) / زيلازين (16 ميكروغرام / غرام من وزن الفأر) والاحتفاظ بها على رأس وسادة التدفئة على 37 درجة مئوية حتى يحصلوا على اللاوعي.
- فضح جراحيا الكلى لتنفيذ عمليات زرع للthymuses. فرك الجلد لأول مرة مع ChloraPrep (Carefusion شركة) والايثانول 70 ٪. ثم ، وجعل قطع 1 سم على الجلد من الجزء الخلفي الجانبي جسم الحيوان ، مم 2 خوار الضلع مشاركة الصدري.
- خفض التجويف البريتوني والانسحاب الكلى من هذا التجويف. إجراء قطع صغيرة سطحية في كبسولة الكلى بشفرة المشرط. باستخدام ملقط مع طرف رقيقة جدا جعل الحقيبة تحت كبسولة الكلى من الماوس المتلقي وتضيف ما يصل إلى 4 فصوص الغدة الصعترية في هذه الحقيبة.
- ب وضع الكلى ACK إلى مكانها ، خياطة التجويف البريتوني مع واحد أو اثنين غرز ، ومن ثم إغلاق الماوس الجلد باستخدام طريقة خياطة نفسه. بدلا من ذلك ، يمكن القيام به الغراء الغرز الجراحية.
- حقن مسكنة (بوتورفانول في 5 ملغ / كلغ) تحت الجلد مباشرة بعد الانتهاء من عملية جراحية لتفادي ألم الحيوان والحفاظ على الحيوانات في لوحة التسخين حتى يبدأ في التعافي من التخدير. والفئران في قفص فردي لأول 3 أيام بعد الزرع لمنع زملائه من قفص إزالة الغرز. إزالة الغرز بعد أسبوع 1.
- الفئران عارية لا تملك خلايا تي. لذلك ، يمكنك قبول تقييم الكسب غير المشروع الغدة الصعترية من خلال رصد نسبة CD4 + CD8 + أو خلايا T في الدم. مرة واحدة في الأسبوع (2) ، بعد أسابيع من زرع الغدة الصعترية ، تنزف الحيوانات وصمة عار في الدم المضادة للCD4 ومكافحة CD8 الاجسام المضادة (MABS). عندما CD4 : CD8 نسبة ما يقرب من 2:1 ، زرع الغدة الصعترية وظيفية بالكامل (الشكل 1).
تحضير جميع المواد ستحتاج مقدما ووضعها جانبا.
- تخدير الحيوانات مع ketamin / زيلازين (الجرعات الموصوفة في البند نفسه 1.5) ووضعها على رأس وسادة التدفئة على 37 درجة مئوية. ضخ 100 ميكرولتر من B - ثيوسيانات رودامين ديكستران (20 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) عن طريق الوريد للسماح التصور المستقبلي لتدفق الدم.
- فضح الكلى المزروعة التي تحتوي على الغدة الصعترية وفقا لبروتوكول سبق وصفها في البند 1.6.
- لمنع الكلى من العودة إلى موقعها الأصلي ، على مقربة من الجانبين الوحشي شق الجلد مع غرز.
- وضع قطعة من القطن غارقة في برنامج تلفزيوني على الجزء العلوي من الجهاز لإبقائها رطبة.
- وضع وسادة التدفئة على رأس الحيوان حامل المرحلة (الشكل 2A).
- وضع الحيوان في أعلى لوحة التدفئة في صاحب الحيوان ، يصل الجهاز (الشكل 2B).
- قرصة الجهاز في كلا الجانبين مع المشبك مترADE رقيقة من رقائق الألومنيوم (الشكل 2C).
- أغلق صاحب الحيوان ومكان التحقيق سخان الأعلى في أقرب وقت ممكن لنسيج الجسم (الشكل 2D). هذا التحقيق سخان التدابير باستمرار درجة حرارة الجهاز ويرسل هذه المعلومات إلى جهاز التدفئة لضبط التيار الكهربائي ، وابقائها عند 37 درجة مئوية.
- إزالة القطن غارقة في برنامج تلفزيوني وإضافة منخفضة ذوبان agarose (2 ٪ في برنامج تلفزيوني) في 30 درجة مئوية في أعلى إعداد الخاص بك.
- تغطية كاملة مع إعداد المدفأة العليا (2E الشكل). في الفتحة على هذا سخان هناك ساترة عزل agarose من الهدف (الشكل 2F). رصد وحقن تخدير الماوس دفعة نصف الجرعة كل 40 دقيقة. بعد الحصول على الصور ، الموت ببطء الحيوان مع CO 2.
ملاحظة : يتم عرض الصور من الألومنيوم احباط ومقطع المدفأة الأعلى في الشكل 3.
3. ثنائي الفوتون التصوير اكتساب
استخدمنا تستقيم "المرج أولتيما XY" ثنائي الفوتون المجهر. وقد تم تجهيز نظامنا مع تي : ليزر الياقوت ، وأربع فرق إدارة المشاريع PMT العليا للقناة في وقت واحد استحواذ تصل إلى 4 وغمر المياه الهدف 20X.
- بدوره على تي : ليزر الياقوت والنظام كله المجهر.
- إضافة المرايا مزدوج اللون ومجموعات التصفية وفقا لموجات المطلوب. في حالتنا استخدمنا حامل أوليمبوس - BX2 كروما وتحتوي على 565 نانومتر مرآة مزدوج اللون ، واحدة 525/50 تصفية نانومتر (على Foxp3 - GFP إشارة) ، واحد 595/50 تصفية نانومتر (لديكستران رودامين - B - إشارة داخل الأوعية الدموية ). وكان نطاق الطول الموجي الليزر المستخدمة بين 880-900 نانومتر.
- إضافة إلى صاحب الحيوان المجهر ، الاتصال وتشغيل السخانات في كل شيء ، إضافة الماء على فتحة سخان أعلى ، وانخفاض بعناية الهدف في الماء ، والتركيز على متن سفينة أو بعض GFP Tregs.
- س مع المجهر ، Y ، Z للمراقبة الخارجية ، والمسح بسرعة الأنسجة لتحديد المنطقة المصالح.
- ضبط على كسب هذه الفرق لتحسين فصل الألوان وتقليل كمية الليزر اللازمة لتحقيق إشارة كافية على الخلفية. محاولة استخدام الحد الأدنى من الليزر لتجنب الصور تلف الأنسجة الخاص.
- مرة واحدة تقع في المنطقة للمصالح ، وتبدأ الوقت الفاصل بين التصوير. في حالتنا ، و5D نموذجي (س ، ص ، ض ، ر ، ولون) بروتوكول اقتناء يتكون من الحصول على صور متسلسلة من حجم 50 ميكرومتر الأنسجة المتعمق ، مقسمة إلى 4.0 ميكرون ض الخطوات ، x و y بطول 140 ميكرون لكل منهما. يأخذ كل وحدة تخزين التي سيتم شراؤها حوالي 30 ثانية. ولذلك ، فإن 60 الاستحواذ تنفيذ نحو 30 دقيقة من الحصول على الصور.
- نقل البيانات إلى الخادم المؤسسية واستخدام ImageJ ، Imaris ، أو برامج Volocity لأداء متعدد الأبعاد وجعلها تتبع الخلية.
4. ممثل النتائج
g1.jpg "/>
الشكل 1. . التوتة الجنينية قبول وظيفة بعد استرداد BM ، وقد تم زرع thymuses الجنينية للحيوانات المعاد BM ؛ بعد أسبوعين من زرع الغدة الصعترية ، ونزفت هذه الفئران مرة واحدة في الأسبوع لمراقبة نسب فرعية الخلايا التائية التي تلطيخ المضادة للCD4 أو CD8 المضادة ، MABS. اعتبرنا قبلت بنجاح الغدة الصعترية في الحيوانات مع CD4 : CD8 حول نسبة 1.5-2.0:1 (A). للتأكد من فاعليته ، ونحن ضحت بعض الحيوانات وزرع الغدة الصعترية ، مقارنة النسبة المئوية للخلية توتية مجموعات سكانية فرعية مختلفة مع الفئران WT (B). النسب المئوية للالمزدوج السلبية (DN ؛ CD4 -- thymocytes -- CD8) المجموعات السكانية الفرعية (عن طريق تلطيخ مع CD25 المضادة للطائرات ومضادة للMABS CD44) ، انقر نقرا مزدوجا إيجابية (DP ؛ CD4 + CD8 + thymocytes) واحدة إيجابية (SP) CD4 + أو CD8 + thymocytes كانت متشابهة بين هذه الحيوانات.
ig2.jpg "/>
الشكل 2. التجمع صاحب الحيوان ، وبعد تخدير عميق ، يتم وضع الحيوان على رأس وسادة التدفئة ، التي شنت في وقت سابق على رأس الحيوان حامل المرحلة (أ). الكلى المزروعة التي تحتوي على الغدة الصعترية هي مواجهة (B). والمشبك رقائق الألومنيوم القرصات بدقة الكلى كله (C) لابقائه في مكانه. التين. 1C ادخال يبين بالتفصيل المشبك. يتم وضع الجزء العلوي من صاحب الحيوان في مكان (D). تتم إزالة القطن غارقة في برنامج تلفزيوني من الجزء العلوي من الجهاز ، والاستعاضة عنها ذوبان agarose المنخفضة الدافئة ، ويتم إضافة جهاز التدفئة أعلى (E). أخيرا ، يتم نقل التجمع كله المجهر ، التي يمثلها هنا الهدف (F).
الشكل 3. تفاصيل أجزاء حامل ، وهذه الصور تظهر المشبك رقائق الألومنيوم (أ) عقد الكلى (B). نلاحظ أيضا في المنطقة حيث تقع الغدة الصعترية المزروعة. هذا يشير إلى ما يقرب من المنطقةلقطع الكبسولة التوتة وجعل جيب لوضع التوتة الجنينية. تم إصلاح سخان ساترة العلوي (C) مع الغراء إلى الجزء السفلي من السيليكون والخمسين (D).
فيلم 1. التصوير Intravital من thymocytes + Foxp3 - GFP داخل الغدة الصعترية حيث تم الإبقاء على مستويات الفسيولوجية للالأوكسجين ودرجة الحرارة (37 درجة مئوية) خلال العملية برمتها. لاحظ تدفق الدم والحركة من Tregs. ويمكن قياس هذه السرعات ومقارنة مع البيانات المنشورة. انقر هنا لمشاهدة الفيلم.
الفيلم 2. Intravital تصوير Tregs داخل الغدة الصعترية ، حيث تم الحصول على الصور في 30 درجة مئوية. لاحظ عدم وجود حركة وشكل الجولة من الخلايا على الرغم من الحفاظ على تدفق الدم. انقر هنا لمشاهدة الفيلم.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
- Bettelli, E. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, 235-238 (2006).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2006).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Hugues, S. Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity. 5, 1235-1242 (2004).
- Tang, Q. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).
- Le Borgne, M. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature immunology. 10, 823-830 (2009).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).
- Barretto, R. P. J. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17, 223-228 (2011).
