Summary
我们已经开发出新的实验室工具和胸腺的活体成像收购协议。我们的技术帮助识别“龛”胸腺内T细胞发育时。
Abstract
双光子显微镜（TPM），提供图像采集在深层组织和器官内的地区。结合新的立体定向工具和外科手术的发展，TPM成为一个强大的技术，以确定内部器官的“壁龛”，并记录在活的动物细胞的“行为”。虽然活体成像提供最类似于真正的内部器官的细胞行为的信息，这是比较费力，在技术上比其他前体内成像收购所需的设备/程序方面的要求。因此，我们描述了外科手术和小说“立体”，使我们能够遵循Foxp3的运动+细胞在胸腺器官持有。
Foxp3的调节性T细胞（Treg细胞）的产生是主控调节。此外，这些细胞可分为根据其原产地：即。胸腺分化调节性T细胞被称为“自然发生的调节性T细胞”（nTregs），为Opposed向外围转换调节性T细胞（pTregs）。虽然已在文献报道的关于这些T细胞表型和生理的研究量显著，很少有人知道他们在与其他细胞的体内相互作用。这种缺陷的原因可能是缺乏的技术，将允许这些意见。本文中所描述的协议提供了一个补救这种情况。
我们的协议包括使用，因为他们有一个准时在妥协一些上皮细胞，包括胸腺上皮细胞的分化的DNA序列突变，缺乏一种内源性的胸腺的裸鼠。裸鼠γ射线辐照和Foxp3的碘化钾GFP / GFP小鼠骨髓（BM）的重组。骨髓恢复（6周）后，每个动物胚胎胸腺移植的肾囊内。胸腺验收（6周）后，将动物麻醉;肾脏含有的移植的胸腺被暴露，固定在我们的机关持有人，并通过TPM的生理条件下保持体内成像。我们一直在使用这种方法，研究药物的调节性T细胞生成的影响。
Protocol
1。动物准备
重要说明：在无菌条件下进行骨髓细胞悬液和胸腺移植。骨髓悬液，我们的细胞培养室罩内，而胸腺移植是在位于我们的动物设施内的手术室进行。为了保持和保证这些无菌条件下，我们不允许我们的视频记录在这些地方。然而，所有的手术材料，灭菌和手术板凳以前用卫康消毒剂（医药品研究实验室公司）和70％的乙醇清洗。所有程序批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC），他们在联邦与欧洲实验动物科学协会（FELASA）指令的协议。批准的ID号是AO10/2010。所有的图像实验终端程序和动物安乐死紧随图像年底收购。
详细过程如下：
- 照射（与γ-辐照）8周龄裸小鼠900拉德内摧毁的骨髓（BM）的内源性造血前体。照射后，动物笼子，直到您准备的供体骨髓细胞静脉注射和进一步的骨髓重建。此骨髓转移后进行照射1小时。
- 骨髓捐赠动物分开。一个动物的后肢股骨和胫骨一般都不够3收件人动物重组。与CO 2安乐死后，取出后肢，然后从骨子里清除皮肤和肌肉。
- 剪下每个骨骼的封闭端，用PBS（或RPMI）冲洗或粉碎他们都在迫击炮，使用杵与2毫升PBS（或RPMI），删除的BM。
- 扰乱蓬勃向上的愿望USI的重复的成单细胞悬液BM结构吴一个P1000的吸管。另外，您还可以通过整个21G注射器针头的BM几次。离心机（400G，5分钟，RT），暂停在PBS细胞，并注入你的裸体辐照受助静脉注射。在我们的实验中，我们使用BM - KI Foxp3 的GFP / GFP小鼠所有调节性T细胞（Treg细胞）表达绿色荧光蛋白 1 。
- 接受捐助BM发生转移后的第一天，因为非BM重组动物无法存活超过14天。然而，应等待4至6周，让所有的BM车厢完全恢复。复方新诺明（罗氏）在照射后的第一周水（2毫克/毫升），以减少细菌感染的风险。
- 胚胎胸腺移植已经描述2。简单地说，开始滋生的对等基因小鼠和堵塞（性交证据）每天检查。单独的插入女性和CO 2安乐死pregn 15天ancy（观察插头是怀孕的第1天）。取出胚胎及胸腺。直到转移放置在冷PBS胚胎胸腺。
- 要执行的胸腺移植BM收件人，麻醉与氯胺酮（120微克/克鼠标重量）/甲苯噻嗪（鼠标重量的16微克/克）的裸鼠，并保持在37 ° C，直到他们得到一个加热垫的顶部昏迷不醒。
- 手术暴露肾脏进行移植的胸腺。首先ChloraPrep（Carefusion公司）和70％的乙醇擦洗皮肤。然后，一个1厘米的背外侧的动物身体的一部分，2毫米波纹管的最后胸肋骨皮肤上切。
- 切开腹腔，拉出本腔的肾脏。用手术刀刀片补肾胶囊，做一个小的浅表切。使用一个非常薄的尖钳，使肾囊下的收件人的鼠标一小袋，加起来这个袋子4胸腺叶。
- 把肾b ACK到它的地方，与一个或两针缝合腹腔，然后使用相同的缝合方法关闭小鼠皮肤。另外，缝合手术胶水可以使用。
- 注入镇痛（布托啡诺在5毫克/千克）皮下注射后完成手术，以避免动物的痛苦，并保持在一个加热垫，直到他们开始恢复从麻醉中的动物。老鼠笼单独移植后第3天拆除缝线，以防止笼交配。取出1周后拆线。
- 裸鼠没有T细胞。因此，您可以评估胸腺移植验收监测CD4 +或CD8 + T细胞在血液中的比例。每周一次，2周后胸腺移植，出血的动物和染色抗CD4和抗CD8单克隆抗体（单抗）的血液。当CD4：CD8比值约为2:1，移植的胸腺功能齐全（图1）。
准备好所有的材料，您需要提前，并把它们放在一边。
- 麻醉与氯胺酮/甲苯噻嗪（在项目1.5中所述的相同剂量）动物和它们放在一个加热垫的顶部在37 ° C。注入100罗丹明B异硫氰酸-葡聚糖（20毫克/毫升的PBS）静脉注射液的血流量，让未来的可视化。
- 公开肾移植的胸腺，根据先前在项目1.6中所述的协议。
- 为了防止肾脏返回到原来的位置，紧密缝合皮肤切口的侧面。
- 放置一个PBS浸泡过的棉花片的器官，以保持湿润的顶部。
- 将动物持有人阶段（图2A）顶部加热垫。
- 把对动物的持有人，器官最多（图2B）在加热垫的顶部动物。
- 捏住两侧钳位米的器官薄铝箔的ADE（图2C）。
- 关闭动物的持有人及地方顶部加热器探头尽可能靠近你的组织（图2D）。这种热水器探头不断措施器官的温度，并将此信息发送到加热器调整电流，保持在37 ° C。
- 取出PBS浸泡过的棉花，并在30 ° C准备顶部添加低熔点琼脂糖（2％）的PBS。
- 盖顶部加热器（图2E）的准备。在此加热器的光圈有一个玻璃罩隔离琼脂糖从客观（图2F）。监视鼠标麻醉和注射半剂量升压，每40分钟。图像采集后，安乐死与CO 2的动物。
注：铝箔剪辑和顶部加热器的图片图3 。
3。双光子成像收购
我们用一个堂堂正正的“草原终极XY”双光子显微镜。我们的系统配备了钛：蓝宝石激光，四大光电倍增管同时进行多达4个通道的收购和20倍水浸泡的目的。
- 打开的钛蓝宝石激光和整个显微镜系统。
- 添加分色镜和过滤器设置，根据所需的波长。在我们的例子中，我们使用奥林巴斯BX2色度持有五十〇分之五百二十五纳米过滤（Foxp3的GFP信号），和一个50分之595纳米过滤（葡聚糖 - 罗丹明- B的血管内的信号包含一个565纳米的分色镜， ）。使用激光的波长范围是880至900纳米之间。
- 添加动物架显微镜，连接并打开加热器，加水顶部加热器光圈，放入水中仔细较低的目标，并重点对船只或一些GFP - Tregs的。
- 用显微镜x，Y，Z外部控制，迅速调查的组织，以找到一个地区利益。
- 调整优化分色和最小化的实现足够的信号超过背景所需的激光量的光电倍增管的增益。尝试使用少量的激光，以避免您的组织的光损伤。
- 一旦利益的地区是位于开始的时间推移成像。在我们的例子中，一个典型的5D（X，Y，Z，T，和颜色）的收购协议，由获得50微米深入组织体积，除以Z -步骤，X和Y的长度为140微米到4.0微米的连续图像每个。每卷30秒左右被收购。因此，60收购将执行图像采集约30分钟。
- 将数据传输到体制服务器和使用ImageJ，Imaris，或Volocity软件进行多维呈现和细胞跟踪。
4。代表性的成果
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图1。胚胎胸腺验收和功能的骨髓恢复后，胚胎胸腺移植骨髓再造动物;胸腺移植两周后，这些老鼠被放血每周一次的监测与抗CD4或抗CD8染色T细胞亚群的百分比单克隆抗体。我们认为胸腺是成功地在动物与CD4接受：CD8周围1.5-2.0:1的比例（一）。要确认它的功能，我们牺牲了一些胸腺移植的动物，并比较不同（二）WT小鼠胸腺细胞亚群的百分比。亚群（抗CD25和抗CD44单克隆抗体染色），双阳性（DP的CD4 + CD8 +胸腺细胞）;（ - - CD8 +胸腺细胞CD4 + DN）和单阳性（SP）的CD4 +双负的百分比+或CD8 +胸腺细胞之间的这些动物类似。
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图2。动物持有人大会。深深地麻醉后，动物是加热垫之上，以前安装在顶部的动物持有阶段（一）。肾移植的胸腺是朝上（二）。铝箔夹微妙捏整个肾脏（三）保持它在的地方。图1C插入显示详细钳。 （四）地方动物持有人的上半部分。从顶部的器官，取而代之的是温暖的低熔化琼脂糖，PBS浸泡过的棉花被删除，并添加顶部加热器（五）。最后，整个大会转移到显微镜，这里的目标（F）的代表。
图3。持有部分的详细信息，这些图片展示的铝箔夹（一）持有肾（二）。还要注意在移植的胸腺是位于地区。这大约表明该地区削减胸腺囊，口袋，把胚胎胸腺。顶部加热器玻璃罩（三）固定用硅酮胶，其底部（d）部分。
电影1。Foxp3的- GFP +充氧和温度（37℃）的生理水平，在整个过程中保持胸腺内的胸腺细胞的活体成像。注血流量的调节性T细胞和运动。这些速度可测，并与公布的数据相比，点击这里查看电影。
电影2。活体成像的调节性T细胞内收购胸腺图像30 ° C.注意运动和圆形细胞尽管维持血液流动的情况下，点击这里查看电影。
Discussion
在本文中，我们展示了一个活的动物胸腺细胞内双光子成像的程序。我们还介绍了一些参数，应仔细控制，如血流量的延续和器官的温度维持在成像过程。然而，尽管小心努力保持稳定的器官，如“器官漂流”的运动伪影，可发生。后路图像校正可以由专门为此目的而设计的算法的发展。进一步的图像分析，也可以是新的发展协议，旨在最大限度地减少错误的源。
胸腺器官，所有的T细胞产生的，因此，它是在兴趣了解γδ代的免疫学家在机关，CD4或CD8 + T细胞，将集中他们的注意力。大多数关于T细胞的研究是基于数字的差异和/或这些C稳定英语学习者后，在体外/体内操作的不同。然而，只有后在体内的可视化，我们可以观察到参与维持动态平衡 3-7免疫系统细胞之间的相互作用。因此， 在体内观察胸腺细胞可能是最重要的失踪信息，以便更好地了解T细胞生物学之一。活体TPM提供了T细胞的运动和相互作用的详细情况，我们将演示如何，它可以详细的胸腺细胞研究。然而，每个技术都有其局限性。虽然活体成像收购是反映身体内部的细胞行为的最准确的系统，它也是如此explanted器官的图像采集少费力，并已用于收集有关免疫系统8,9的重要信息。此外，一个不能否认活体成像方法需要暴露于麻醉动物组织和血管的手术，本身可能导致在整个器官的生理10变化。不过，也有非侵入性的方法， 取消 11外科手术新方法造成的文物正在开发，更好地提前做好准备要使用的 12只动物。因此，新的手术程序和收费，将最大限度地减少或绕过实际收购活体成像的局限性，并成为科学界越来越多的访问。
我们已经证明，我们所描述的方法是可行的， 它在体内系统性的操作，这类药品监督管理局报告所有，我们已经使用。因此，我们建议使用这种方法与已有的体外技术，以补充和加强有关胸腺细胞发展的进一步研究。
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们要感谢这个手稿的严格审查，努诺莫雷诺博士为物流Foxp3的碘化钾GFP / GFP的实物捐赠有助于建立我们的动物持有人及电热垫和维杰-光Kuchroo博士大卫博士Olivieri小鼠。这项工作是由“Fundação第Ciência发送Tecnologia”（FCT，葡萄牙），授予＃PTDC/EBB-BIO/115514/2009支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
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