Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

Summary

Apresenta-se um método de citometria de fluxo com base para examinar o desenvolvimento das células T In vivo Usando camundongos geneticamente manipulados em um tipo selvagem ou de fundo do receptor de células T transgênico.

Abstract

Um sistema imunitário saudável requer que as células T respondem a antigénios estranhos, permanecendo tolerante para auto-antígenos. Rearranjo aleatório do receptor de células T (TCR) e loci α β gera um repertório de células T com grande diversidade de especificidade antigénica, tanto a auto-e estrangeiras. A selecção do repertório durante o desenvolvimento do timo é crítico para a geração segura e úteis células T. Defeitos de selecção tímica contribuir para o desenvolvimento de doenças auto-imunes e da imunodeficiência ^1-4.

Progenitores de células T do timo entrar como duplamente negativos (DN) timócitos que não expressam CD4 ou CD8 co-receptores. Expressão da αβTCR e ambos os co-receptores ocorre na fase dupla (DP) positivo. Interacção do αβTCR com auto-péptido-MHC (pMHC) apresentado pelas células do timo determina o destino do timócito DP. Interações de alta afinidade levar a seleção negativa e eliminaçãoção de auto-reactivos timócitos. Baixa afinidade interacções resultam na selecção positiva e desenvolvimento de CD4 ou CD8 positivas únicas células (SP) T capazes de reconhecer antigénios estranhos apresentados pelo MHC próprio ^5.

Selecção positiva pode ser estudada em ratinhos com um anticorpo policlonal repertório de TCR (tipo selvagem), observando a geração de células T maduras. No entanto, eles não são ideais para o estudo de selecção negativa, o que envolve a eliminação de pequenas populações específicas de antigénio. Muitos sistemas de modelos têm sido utilizados para estudar a selecção negativa, mas variam na sua capacidade para recapitular eventos fisiológicos ^6. Por exemplo, a estimulação in vitro de timócitos falta o ambiente do timo, que está intimamente envolvido na selecção, ao passo que a administração de antigénio exógeno pode levar à supressão não específica de timócitos ^7-9. Atualmente, as melhores ferramentas para estudar na seleção negativa vivo são ratos que expressam uma transgenic específica TCR para endógena antígeno próprio. No entanto, muitos modelos clássicos TCR transgénicos são caracterizados pela expressão prematura da cadeia TCRα transgénico no estádio de DN, resultando em prematuro de selecção negativa. O nosso laboratório desenvolveu o HY modelo ^CD4, no qual a transgénico HY TCRα condicionalmente está expresso na fase de DP, permitindo a selecção negativa para ocorrer durante a transição para DP SP como ocorre em ratinhos de tipo selvagem ^10.

Aqui, nós descrevemos um protocolo de citometria de fluxo com base em examinar selecção positiva e negativa do timo no modelo do rato HY ^CD4. Enquanto a selecção negativa nos ratos ^CD4 HY é altamente fisiológico, estes métodos podem também ser aplicados a outros modelos de TCR transgénicas. Nós também irá apresentar as estratégias gerais para a análise de seleção positiva em um repertório policlonal aplicáveis ​​a quaisquer camundongos geneticamente manipulados.

Protocol

Consulte a Figura 1 para um esquema geral do protocolo experimental.

1. Dissecação

1. Coloque tela de malha de aço estéril em 60 15 mm x placa de Petri. Uma unidade é necessária por amostra de tecido.
2. Adicionar 5 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) para cada prato. Mantenha pratos no gelo.
3. Euthanize ratos com CO _2.
4. Rato seguro para a superfície, dissecção lado ventral para cima. Pulverização do rato com etanol a 70% para a esterilização e para assegurar que a pele é opaco para baixo.
5. Utilizando uma tesoura cirúrgica, dissecção começar por fazer uma incisão ventral na pele abdominal acima da genitália. Estender para cima da incisão para o queixo.
6. A partir da linha média, estender a incisão para baixo ao longo de todos os membros. Puxe a pele solta e fixá-lo para a superfície dissecção.
7. Colheita do timo:
   1. Levante a ponta inferior do esterno para fazer uma incisão.
   2. Evitando o fígado, o diafragma cortado para separar a caixa torácica e depois cortar a caixa torácica para cada lado. Corte as costelas para cima em cada lado, tendo o cuidado de evitar os pulmões eo coração.
   3. Com cuidado, puxe a parte de trás da caixa torácica com uma pinça. O timo é um órgão, branco bilobado localizado acima do coração. Usando a ponta plana do fórceps para agarrar o fundo dos lobos, puxe o timo e colocá-lo na tela de malha.
8. Colher o baço:
   1. O baço é um vermelho, o órgão em forma de prancha de surf localizada no lado esquerdo da cavidade abdominal do rato, abaixo do fígado.
   2. Fazer uma incisão na cavidade abdominal. Retire cuidadosamente o baço com um par de fórceps, usando o segundo par de provocar o tecido conjuntivo. Coloque o baço em uma tela de malha separada.

2. Preparação de células

1. Usando um êmbolo de uma seringa de 3 ml, moerórgãos para a tela de malha até que o tecido conjuntivo e apenas restos de gordura. Lavar malha com HBSS do prato três vezes. Usar um êmbolo para cada amostra de tecido.
   1. Outras opções para a homogeneização do tecido pode ser usado em lugar deste método.
2. Contar as células utilizando um hemocitómetro.
3. Células de pelotas por centrifugação a 335 xg durante 5 min a 4 ° C.
4. Esplenócitos Ressuspender em 500 ul de tampão de lise ACK (0,15 M NH ₄ Cl, 10 mM KHC0 _3, 0,1 mM Na ₂ EDTA, pH 7,2) durante 10 min à temperatura ambiente. Timócitos Ressuspender em 20 x 10 ⁶ células / ml em tampão FACS (PBS, 1% de FCS, 0,02% de azida de sódio) e de lado em gelo.
5. Retornar esplenócitos de isotonicidade pela adição de 5 ml de HBSS. Esplenócitos de pelotas por centrifugação e ressuspender em 20 x 10 ⁶ células / ml em tampão de FACS. Se as células precisam permanecer estéril, você pode usar estéril RPMI + FCS 10%.

3.Células coradas para citometria de fluxo

O objectivo deste protocolo é traçar estratégias para a análise de seleção positiva e negativa utilizando tipo selvagem (WT) e camundongos ^CD4 HY. Para considerações gerais sobre a citometria de fluxo experimental design, aquisição, análise e, nos referimos aos leitores uma excelente revisão por Tung et al. ¹¹

1. Alíquota de 4 x 10 ⁶ timócitos por exemplo citometria de fluxo para cada cavidade de uma placa de 96 poços, bem como 1 x 10 ⁶ por esplenócitos WT controlo de compensação. Se usar camundongos transgênicos, você deve incluir um mouse como controle WT em sua experiência.
2. Bloquear os receptores Fc, por incubação com células anti-CD16/32 (clone 2.4G2) durante 10 min em gelo.
3. Girar em placas a 335 xg a 4 ° C durante 5 min. Retire a tampa e dissipar líquido de poços mexendo na placa de uma vez, de bruços em uma pia. Ressuspender a cada poço em 200 ul de tampão de FACS. Repetir a lavagem.
4. Preparar cocktails de anticorpo tal como enumeradas a seguir, utilizando a concentração óptima de cada anticorpo com base na diluição de 200 ul de tampão de FACS por poço. A concentração óptima de cada um dos anticorpos é definido como a concentração mínima necessária para se obter a maior separação de populações positivas e negativas. Se não houver uma população negativa para um dado anticorpo, um anticorpo isotipo devem ser incluídas. O volume total por poço pode ser reduzida (por exemplo, a 100 ul por poço), se desejado.
   1. WT timo: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ou anti-CD5, anti-CD24
   2. ^CD4: HY timo anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ou anti-CD5, anti-CD24
      Para obter uma melhor separação entre a CD69 e CD69 ^eis em populações ^hi timócitos, recomenda-se que um anticorpo biotinilado anti-CD69 primário ser utilizado, seguido de uma mancha secundária contendo estreptavidina conjugada com fluorocromo. Nós use a mesma estratégia para CD5 coloração.
5. Incubar as células com 200 uL de mistura de anticorpos em tampão de SCAF, durante 30 minutos em gelo no escuro.
6. Concomitante com coloração coquetel de anticorpos, cada mancha controlo de compensação com um anticorpo conjugado com fluorocromo único. Idealmente, a coloração compensação envolve os mesmos anticorpos, usado no cocktail de anticorpos. No entanto, a coloração para cada antigénio individual pode não ser praticável para experiências maiores quando muitos antigénios estão a ser ensaiados. Por isso, tanto para a coloração anti-CD4 ou anti-CD8 é recomendado devido à elevada expressão destes antigénios, ou a utilização de esferas de compensação. Mancha em tampão de FACS durante 30 minutos em gelo no escuro. Deixe um controle de compensação imaculada.
7. Lave as células duas vezes com tampão FACS.
8. Ressuspender as células em tampão de SCAF e transferência para tubos de FACS.
9. Adquirir amostras no citômetro de fluxo. Incluem a aquisição de FSC-A e FSC-W para umGUARDE para a discriminação gibão.

4. Análise de citometria de fluxo de dados - Ratos não transgénicos TCR

Usamos FlowJo para a análise de dados de citometria de fluxo. Consulte a Figura 2A para a estratégia de propagação para os ratos não-transgênicos TCR.

1. Usando FSC-A por SSC, portão eletrônico sobre a população "linfócitos".
2. Dentro da população "linfócitos", use FSC-A pelo FSC-W para eletronicamente população portão ^eis FSC-W para excluir doublets celulares e aggregrates. Este é o "singleto" portão.
3. Usando os eventos no "singlet" portão, lote CD8 por CD4. Desenhe portas para DN, ^maçante DP, ^brilhante DP, CD4 ⁺ CD8 populações ^eis CD4SP e CD8SP conforme ilustrado na figura 2B.
4. Sob os portões e CD4SP CD8SP, criar TCRβ por CD24 parcelas. Utilize a ferramenta gating quadrante para desenhar portas como mostrado na Figura 2C.
5. Criar um new enredo da "singlet" porta: TCRβ por CD69. Desenhar portas A, B, C, D, conforme ilustrado na Figura 2D.
6. Criar outra trama do "singlet" porta: TCRβ por CD5. Desenhar portões i, ii, iii, iv, como representado na Figura 2E. Esta é uma outra estratégia para a análise de selecção positiva.
7. Aplicar DN, DP ^opaca, DP ^{brilhante, int} CD4, CD4SP e CD8SP portões de debaixo "singleto" para portões i, ii, iii, iv A, B, C, D (Figura 2D, E).
8. Calcule o número de células em um subconjunto específico multiplicando celularidade órgão pela freqüência de cada portão posterior até chegar ao seu público-alvo. Por exemplo, o número de TCRβ CD69 ^hi-CD8SP timócitos seria determinado por timo celularidade x% TCR bhi CD69-(fracção D) x CD8SP%.
   1. Contando já leva em conta as células vivas e mortas para que não incluem o lymphoc "gate "YTE nos seus cálculos.

5. Análise de dados de citometria de fluxo - TCR transgênico Ratos

Consulte a Figura 3A para a estratégia de gating para camundongos transgênicos TCR.

1. Siga os passos 4.1 e 4.2 como na seção anterior.
2. Sob o título "singleto" gate, criar um T3.70 por SSC trama e portão na T3.70 ⁺ população de células para análise de células T específicas de antigénio (Figura 3B). Em algumas circunstâncias, pode ser de interesse para comparar esta população para o antigénio não específico de população celular (T3.70) T.
3. Dentro da população ⁺ T3.70, desenhar DN, DP, CD4SP e CD8SP portas (Figura 3C).
   1. Para as amostras controle WT, desenhar estas portas sob o "singlet" portão ou criar um T3.70 porta-uma vez que haverá muito poucos T3.70 ⁺ células.
4. Sob o portão CD8SP, criar umT3.70 por CD24 trama. Use a ferramenta de propagação do quadrante para dividir as células em quatro populações (Figura 3F).
5. Criar um histograma representando sobreposto expressão CD69 no compartimento DP de ratinhos WT e T3.70 ⁺ DP compartimento de camundongos ^CD4 HY (Figura 4A). Repetir para examinar a expressão CD5 (Figura 4B).
6. Calcula-se o número absoluto de células em cada subconjunto de interesse como em 4.8.

Results

Em fisiológicas modelos TCR transgênicos e camundongos WT, a seleção positiva começa na fase DP ^brilhante antes de passar à fase DP ^aborrecido após encontro antígeno. Timócitos DP ^maçantes em seguida, digite um CD4 ⁺ fase de transição CD8 ^lo antes de se tornar CD4SP ou timócitos CD8SP (Figura 2B). Timócitos maduros SP são caracterizados pela expressão de TCR e da elevada perda de CD24 (Figura 2C). Enquanto o CD8 por CD4 perfil pode ...

Discussion

O protocolo aqui apresentado pode ser usado para examinar a selecção positiva e negativa, em não-transgénicos TCR e ratinhos transgénicos TCR. Este protocolo descreve a coloração de antigenes de superfície. Para uma análise mais aprofundada dos mecanismos moleculares, é muitas vezes necessário efectuar a coloração intracelular. Nós usamos o BD Biosciences Kit Cytofix / Cytoperm para a maioria das proteínas intracelulares e da BD Biosciences kit de coloração Foxp3 para fatores de transcrição. Nós geralmente adquirem noss...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
HyClone solução salina balanceada de Hank	Thermo Scientific	SH30030.02
Telas de malha de metal	Cedarlane	CX-0080-E-01
Placas de Petri (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	877221
Seringas (3 ml)	BD Biosciences	309657
Tubos cônicos (15 ml)	Sarstedt	62.554.205
Microscópio	Zeiss - Primo Star	415.500-00XX-000
Hemocitômetro	HausserCientífico	3110
Placa de 96 poços	Sarstedt	82.1582.001
Pipeta multicanal	Fisherbrand	21-377-829
Soro fetal de vitela	PAA	A15-701
Salina tamponada com fosfato	Fisher Scientific	SH3025802
A azida de sódio	IT Baker Chemical Co.	V015-05
Reagente de bloqueio FcR			Clone 2.4G2
Anti-rato HY TCR	eBioscience	XX-9930-AA *	Clone T3.70
Anti-CD4 de ratinho	eBioscience	XX-0042-AA *	Clone RM4-5
Anti-rato CD8u	eBioscience	XX-0081-AA *	Clone 53-6,7
Anti-mouse CD24	eBioscience	XX-0242-AA *	Clone M1/69
Anti-rato TCRβ	eBioscience	XX-5961-AA *	Clone H57-597
Anti-CD69 rato biotinilado	eBioscience	13-0691-AA *	Clone H1.2F3
Anti-rato CD5 biotinilado	eBioscience	13-0051-AA *	Clone 53-7,3
Estreptavidina	eBioscience	XX-4217-AA *
Citómetro	BD Biosciences - FACS Canto	338962
FACS tubos	BD Biosciences	352052
Fluxo de software de análise de citometria	TreeStar - FlowJo	FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640	Thermo Scientific	SH30027.01
			* XX varia de acordo com fluorocromo e YY varia com o tamanho do frasco.