Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

Summary

Apresenta-se um método de citometria de fluxo com base para examinar o desenvolvimento das células T In vivo Usando camundongos geneticamente manipulados em um tipo selvagem ou de fundo do receptor de células T transgênico.

Abstract

Um sistema imunitário saudável requer que as células T respondem a antigénios estranhos, permanecendo tolerante para auto-antígenos. Rearranjo aleatório do receptor de células T (TCR) e loci α β gera um repertório de células T com grande diversidade de especificidade antigénica, tanto a auto-e estrangeiras. A selecção do repertório durante o desenvolvimento do timo é crítico para a geração segura e úteis células T. Defeitos de selecção tímica contribuir para o desenvolvimento de doenças auto-imunes e da imunodeficiência ^1-4.

Progenitores de células T do timo entrar como duplamente negativos (DN) timócitos que não expressam CD4 ou CD8 co-receptores. Expressão da αβTCR e ambos os co-receptores ocorre na fase dupla (DP) positivo. Interacção do αβTCR com auto-péptido-MHC (pMHC) apresentado pelas células do timo determina o destino do timócito DP. Interações de alta afinidade levar a seleção negativa e eliminaçãoção de auto-reactivos timócitos. Baixa afinidade interacções resultam na selecção positiva e desenvolvimento de CD4 ou CD8 positivas únicas células (SP) T capazes de reconhecer antigénios estranhos apresentados pelo MHC próprio ^5.

Selecção positiva pode ser estudada em ratinhos com um anticorpo policlonal repertório de TCR (tipo selvagem), observando a geração de células T maduras. No entanto, eles não são ideais para o estudo de selecção negativa, o que envolve a eliminação de pequenas populações específicas de antigénio. Muitos sistemas de modelos têm sido utilizados para estudar a selecção negativa, mas variam na sua capacidade para recapitular eventos fisiológicos ^6. Por exemplo, a estimulação in vitro de timócitos falta o ambiente do timo, que está intimamente envolvido na selecção, ao passo que a administração de antigénio exógeno pode levar à supressão não específica de timócitos ^7-9. Atualmente, as melhores ferramentas para estudar na seleção negativa vivo são ratos que expressam uma transgenic específica TCR para endógena antígeno próprio. No entanto, muitos modelos clássicos TCR transgénicos são caracterizados pela expressão prematura da cadeia TCRα transgénico no estádio de DN, resultando em prematuro de selecção negativa. O nosso laboratório desenvolveu o HY modelo ^CD4, no qual a transgénico HY TCRα condicionalmente está expresso na fase de DP, permitindo a selecção negativa para ocorrer durante a transição para DP SP como ocorre em ratinhos de tipo selvagem ^10.

Aqui, nós descrevemos um protocolo de citometria de fluxo com base em examinar selecção positiva e negativa do timo no modelo do rato HY ^CD4. Enquanto a selecção negativa nos ratos ^CD4 HY é altamente fisiológico, estes métodos podem também ser aplicados a outros modelos de TCR transgénicas. Nós também irá apresentar as estratégias gerais para a análise de seleção positiva em um repertório policlonal aplicáveis ​​a quaisquer camundongos geneticamente manipulados.

Protocol

Consulte a Figura 1 para um esquema geral do protocolo experimental.

1. Dissecação

1. Coloque tela de malha de aço estéril em 60 15 mm x placa de Petri. Uma unidade é necessária por amostra de tecido.
2. Adicionar 5 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) para cada prato. Mantenha pratos no gelo.
3. Euthanize ratos com CO _2.
4. Rato seguro para a superfície, dissecção lado ventral para cima. Pulverização do rato com etanol a 70% para a esterilização e para assegurar que a pele é opaco para baixo.
5. Utilizando uma tesoura cirúrgica, dissecção começar por fazer uma inc....

Results

Em fisiológicas modelos TCR transgênicos e camundongos WT, a seleção positiva começa na fase DP ^brilhante antes de passar à fase DP ^aborrecido após encontro antígeno. Timócitos DP ^maçantes em seguida, digite um CD4 ⁺ fase de transição CD8 ^lo antes de se tornar CD4SP ou timócitos CD8SP (Figura 2B). Timócitos maduros SP são caracterizados pela expressão de TCR e da elevada perda de CD24 (Figura 2C). Enquanto o CD8 por CD4 perfil pode .......

Discussion

O protocolo aqui apresentado pode ser usado para examinar a selecção positiva e negativa, em não-transgénicos TCR e ratinhos transgénicos TCR. Este protocolo descreve a coloração de antigenes de superfície. Para uma análise mais aprofundada dos mecanismos moleculares, é muitas vezes necessário efectuar a coloração intracelular. Nós usamos o BD Biosciences Kit Cytofix / Cytoperm para a maioria das proteínas intracelulares e da BD Biosciences kit de coloração Foxp3 para fatores de transcrição. Nós geralmente adquirem noss.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
HyClone solução salina balanceada de Hank	Thermo Scientific	SH30030.02
Telas de malha de metal	Cedarlane	CX-0080-E-01
Placas de Petri (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	877221
Seringas (3 ml)	BD Biosciences	309657
Tubos cônicos (15 ml)	Sarstedt	62.554.205
Microscópio	Zeiss - Primo Star	415.500-00XX-000
Hemocitômetro	HausserCientífico	3110
Placa de 96 poços	Sarstedt	82.1582.001
Pipeta multicanal	Fisherbrand	21-377-829
Soro fetal de vitela	PAA	A15-701
Salina tamponada com fosfato	Fisher Scientific	SH3025802
A azida de sódio	IT Baker Chemical Co.	V015-05
Reagente de bloqueio FcR			Clone 2.4G2
Anti-rato HY TCR	eBioscience	XX-9930-AA *	Clone T3.70
Anti-CD4 de ratinho	eBioscience	XX-0042-AA *	Clone RM4-5
Anti-rato CD8u	eBioscience	XX-0081-AA *	Clone 53-6,7
Anti-mouse CD24	eBioscience	XX-0242-AA *	Clone M1/69
Anti-rato TCRβ	eBioscience	XX-5961-AA *	Clone H57-597
Anti-CD69 rato biotinilado	eBioscience	13-0691-AA *	Clone H1.2F3
Anti-rato CD5 biotinilado	eBioscience	13-0051-AA *	Clone 53-7,3
Estreptavidina	eBioscience	XX-4217-AA *
Citómetro	BD Biosciences - FACS Canto	338962
FACS tubos	BD Biosciences	352052
Fluxo de software de análise de citometria	TreeStar - FlowJo	FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640	Thermo Scientific	SH30027.01
			* XX varia de acordo com fluorocromo e YY varia com o tamanho do frasco.