ScanLag: Высокая пропускная Количественная оценка колонии роста и время запаздывания

Introduction

Бактерии эволюционировали, чтобы реагировать на множество стрессовых условиях. Общей чертой адаптации к стрессу является изменение динамики роста ^1,2. Динамика роста характеризуются в основном двумя параметрами: экспоненциальный темп роста и времени задержки, а именно время, необходимое для адаптации к новым условиям. В то время как большое количество методов высокой пропускной сосредоточиться на измерении скорости роста, временной лаг часто забывают параметр, хотя это является ключевым параметром для характеристики адаптации к новым условиям. Количественная оценка адаптации к меняющимся условиям традиционно выполняется с помощью кропотливой ручной методов ^3,4. Совсем недавно, передовые технологии были разработаны для анализа одиночных клеток ^5,6. Тем не менее, он по-прежнему трудно отличить нормального роста вследствие задержки в росте (а именно временной лаг) ^2,3 от медленного роста. Автоматизированный метод был построен, ScanLag ^7, чтобыразличие между этими двумя подобных фенотипов.

Ярким примером важности изучения распределения задержки времени раскрывается под лечения антибиотиками. Многие антибиотики и другие стрессы убить только активно растущие клетки, и, таким образом, клетки, которые "отстающие" защищены ^8. Для контроля времени задержки, можно наблюдать отдельные клетки под микроскопом и контролировать время, чтобы первый дивизион. Основным недостатком этого метода является то, что динамический диапазон время ограничено; эти клетки, которые растут в начале покрывают поверхность в геометрической прогрессии, и уменьшая таким образом рост клеток с более длительным временным лагом. Использование проточных камерах несколько обходит этот ^5, но ограниченное число клеток могут быть отслежены и доля бактерий, которые выходят из лаг-фазу после большинство населения начал расти не может быть обнаружено. Несмотря на эти ограничения, некоторые исследования оценивали влияние уровня диили цепи напряжений на распределение задержки времени при помощи одной клетки микроскопии ^9-12. Еще один способ контролировать распределение задержки времени через измерений мутности ^13,14. Многие параллельные культуры, каждый начали из одной клетки, выращивают в оптической плотности читателю, что измеряет количество бактерий в культуре с течением времени. Этот способ ограничен точности экстраполяции и с числом скважин в тарелке.

Автоматизированный метод был разработан, называется ScanLag, что позволяет по времени задержки и распределения времени рост должны быть оценены, даже для небольшой процент бактерий в популяции, которые имеют очень длинные по времени задержки. Метод основан на обнаружении колоний на обычных питательных чашках с агаром ¹⁵ (рис. 1). Для автоматизации-определение ^16,17 массив коммерческих сканеров ^18, которые направлены на в доме программного обеспечения периодически получать изображения из пластин, была спроектирована. Программное обеспечение былопредназначен для автоматического анализа изображений и извлекать количественные параметры ^19,20, такие как время появления каждого колонии и роста время каждой колонии, которая определяется здесь как раз вырастет с 20 пикселей до 80 пикселей. Здесь мы приводим метод подробно, в том числе настройки системы и использования автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений, который был улучшен с лучшим пользовательским интерфейсом.

Этот метод может быть выполнен с возможностью измерения другие характеристики колоний, таких как морфологии и цвета. Измерение этих типов параметров позволит использовать системы в многомерных phenomics. Поскольку метод обнаруживает колонии из отдельных клеток, система может выявить новые фенотипы, которые не могут быть измерены с помощью измерений на уровне популяции. Методика позволяет обнаруживать и поиск редких вариантов, и облегчает скрининг для желательных черт.

Protocol

1. Постройте Setup

1. Выберите Планшетный сканер с оптическим разрешением: 4800 DPI; Разрешение Оборудование: 4800 х 9600 точек на дюйм; глубина цвета немного: 48 бит, который может работать на соответствующих уровнях температуры и влажности.
2. Чашки Петри имеют значительный объем, в отличие от бумаги, как правило, используется на коммерческих сканеров. Колонии лежат на верхней части слой агара, примерно в 5 мм над поверхностью сканера. Примечание: Для большинства сканеров колонии будет в центре внимания.
3. Некоторые сканер компании не позволяют подключать более одного экземпляра сканера того же типа на том же компьютере. Убедитесь в том, что более чем один сканер может быть присоединен и определены однозначно.
4. Подготовьте аксессуары, указанные ниже:
   1. Подготовка кусочки стерильной черной фетровой ткани для покрытия пластин (рис. 1 шаг 2).
   2. Для удержания чашки Петри на месте, подготовить белые держатели пластины (Материалы и методы), которые соответствуют сканеры и которые имеют 6 праздникиэс размер блюд (рис. 1 шаг 3).
5. При необходимости для роста микроорганизма, туда сканеры в контролируемой температурой окружающей среды. Подключите сканеры на компьютер.
6. Дополнительно: Подключить реле к компьютеру и обойти включения / выключения сканера для преодоления перепада температур.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это реле является для очень чувствительны к перепадам температур микроорганизмов. Это выключает сканер так, чтобы электроника не нагревать поверхность неравномерно. Использование только часть поверхности сканера может достичь аналогичных результатов.

2. Установите сканирование Manager

1. Скопируйте все файлы приложения "сканирующего Управляющего в определенной папке с http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html.
2. Настройка ScanningManager.exe.config файл по именам сканеры, как они появляются в Управление компьютером-> Менеджер-> Устройства обработки изображений устройств (
3. Для устранения неполадок приложения "Сканирование менеджер ', см. файл Read Me.
4. Для получения дополнительной документации о применении «Сканирование менеджер ', см. Documentation.html.

3. Провести эксперимент

1. Подготовьте чашки Петри (рис. 1):
   1. Развести культуру примерно 2000 КОЕ / мл. Пластинчатый 0,1 мл культуры равномерно на поверхности пластины.
   2. Чтобы получить хороший контраст между колониями и блюдо и впитывать влагу, накройте тарелку с куском стерильной черной фетровой ткани. Положите крышку на тарелке.
2. Место пластин в держателях на сканеры.
3. Запустите сканирования Диспетчер (рис. 3): Выберите участвующие сканеры из списка подключенных сканеров. Выберите количество изображений, которые будут приняты (повторений), временной интервал между последующими изображений (промежуток времени), а время задержки перед началом тон экспериментировать (запускается после).

4. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: наброски вычислительных методов обеспечивается для анализа фотографий в MATLAB, используя "ScanLag", который находится в свободном доступе для некоммерческого использования в http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. HTML. Дополнительные функции, доступные подробно описаны в руководстве по программному обеспечению, и пример кода дополняется.

1. Сортировать изображения с каждого сканера в отдельные папки.
2. Использование командное окно Matlab, то необходимо запустить следующие процедуры. Параметры, необходимые для запуска этих процедур определены в руководстве по программному обеспечению.
   1. Запустите PreparePictures выполнять предварительную обработку: В предварительной обработки, изображения со сканера выравниваются. Каждое блюдо Петри обрезается от каждой последовательности изображений. Время, в которое каждое изображение было собрано извлекается из метки времени.
   2. Запуск TLAllPlates для выполнения обнаружение и сопровождение В еАх Петри отдельно, колонии обнаружены и присваивается идентификационный номер.
   3. Анализ извлеченных данных: размеры каждого обнаруженного колонии измеряют как функцию времени. Чтобы извлечь распределение появление колоний использовать следующие функции в окне командной строки от Matlab (дополнительную информацию можно получить в руководстве по программному обеспечению):
      1. Запустите ScanLagApp для отображения анализ определенной чашку Петри вместе с графиком колоний размер в зависимости от времени (рис. 4).
         1. Используйте ползунок, чтобы изменить текущее время пластины. Сроки также будет обозначено соответствующим вертикальной линии на колонии области графика.
         2. Нажмите на колонию, чтобы увидеть его, связанного кривую, и наоборот, нажмите на кривой, чтобы найти связанный с ним колонию. После выявления колонию, фенотип может быть восстановлена, выбирая колонию из идентифицированного чашке Петри.
         3. Фильтровать дефекты автоматического анализа по чупеть колонию и нажав кнопку исключить. При нажатии исключить ряд колонии станет желтой.
      2. Пройдя через результатам анализа каждой пластины, подвести итоги:
         1. Запустите AddHistograms создать гистограмму раз внешний вид.
         2. Запустите plotDeathCurve создать представление выживания кривой распределения.
         3. Запустите GetAppearanceTimes, чтобы получить время появления всех колоний в эксперименте.

Representative Results

В качестве примера извлечения распределения времени запаздывания, Рисунок 5 показывает способность ScanLag для выявления и отслеживания каждой колонии с конкретными характеристиками на одной пластине в течение долгого времени, как будет сделано в скрининге.

Когда культура микроорганизма является гетерогенным, различные субпопуляции может проявляют себя в процессе анализа. Например, на рисунке 6 показан внешний вид количественного и таким образом показывает распределение бимодальная лаг времени в мутантного штамма E. палочка.

Темпы роста клеток влияет на время появления колонии. Когда колонии растут с той же скоростью, позднее появление может быть связано с временным лагом (рис. 7).

Для подтверждения того, что метод действительно измеряет время задержки отдельных клеток, мы сравнили результаты ScanLag с результатами, полученными с помощью одноклеточных микроскопии; Эта проверка по убываниюribed подробно в предыдущей публикации ^7. Этот метод позволяет осуществлять мониторинг многих больше ячеек, чем может быть оценена с микроскопией. Распределения, полученные с помощью микроскопии и получены с использованием ScanLag многом совпадают. Распределение ScanLag несколько шире; теоретический анализ предсказать расширение быть порядка стандартного отклонения с временным разделением. Если время роста отличается для каждого штамма, происхождение задержки появления должны быть дополнительно исследованы с помощью других методов.

Влияние ранних с виду колоний на появление более поздних колоний был рассмотрен. Контрольные эксперименты ⁷ подтвердили, что позднее появление не повлияет тот факт, общее число колоний на чашку не превышала 200 (рис. 8). Другой контрольный эксперимент подтвердил, что расположение колонии на пластинке не влияя на его внешний вид ⁷ раз.

Анализ рLates откалиброван на конкретные пороги, которые могут потребовать модификации в зависимости от питательных веществ, присутствующих в среде роста или типа микроорганизма. Тем не менее, анализ вполне надежный для широкого спектра порогов, как показано на рисунке 9.

Рисунок 1. Принципиальная схема шагов, необходимых для создания распределения колония вид.

Рисунок 2. Снимок экрана диспетчере устройств показывает имена прикрепленных сканеры и конфигурационного файла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большеверсия этой фигуры.

Рисунок 3. Снимок экрана сканирующей Manager.

Рисунок 4. Снимок экрана ScanLagApp. Изображение пластины на левой панели, и кривые роста каждой колонии находятся на правой панели, как описано в руководстве. Шипы в некоторых из кривых колонии области возникают, когда объединить два или более колоний. При объединении колоний происходит, площадь этих колоний рассматривается как совместное области.

Рисунок 5. Представитель результат анализа одной пластины. (A) изображение на выходе приложения обнаружения в конце эксперимента. Каждая область колония идентифицируется, цветные и присваивается уникальный идентификационный номер. Стрелки указывают на представительных колоний, измеренных в В. Колония обнаруживается на основании порога интенсивности (для кишечной палочки колоний на LB агар или М9 агар этот порог составляет 0,03. Для других СМИ или бактерий, этот порог может быть скорректирована в функциональных ProcessPictures ). Только объекты выше 10 пикселей подсчитываются (этот порог может быть изменен в функциональных MatchColonies). Обнаружение колонии начинается примерно в 10 ⁵ бактерий. (B) Земельные области в пикселях в зависимости от времени из четырех представительных колоний в этой пластине. 'Время появление' каждой колонии, когда колония обнаружено. 'Время роста' из каждой колонии определяется здесь как раз расти сюдам 20 пикселей до 80 пикселей (эти границы могут быть настроены на функцию getAppearanceGrowthByVec). Программное обеспечение исключает колонии, которые объединены до достижения верхней границы. Идентификация конкретной колонии по своим характеристикам является легко благодаря идентификационным номером и цветом, назначенным каждой колонии. Например колонии № 1, 56, 77 и 124 выделены обоих графиках.

Рисунок 6. Внешний вид количественное может выявить бимодальное распределение задержки времени. Сравнение анализа ScanLag гистограмм раз внешний вид для двух разных штаммов. Синяя линия: штамм дикого типа растет в геометрической прогрессии (Всего: 1320 колонии); красная линия-высокая устойчивость мутант обогащенный отстающих бактерий (всего: 1529 колоний). (А) из нормализованной внешний вид гистограммы. Пикпоявления экспоненциально растущих клеток типичное время вырастет до выявляемым колонии. Врезка: же гистограмма мутантного штамма после вычитания времени пике экспоненциальной культуры, чтобы получить фактическое время задержки на лог-разнесены бункеров, показывающих бимодальное распределение задержки времени. (B) функция Выживание и тех же данных, как в (А) на логарифмической шкале. Это представление усиливает позднее появление хвост мутантного штамма.

Рисунок 7. Распределение Внешний вид и распределение времени рост. (А) и (Б) показывают, двумерные гистограммы времени появления и время роста двух различных условиях (Программное обеспечение исключает колонии, которые объединены до достижения верхней границы). (C) сравнение гистограммиз двух штаммов показать разницу во времени появления, тогда как раз роста (D) схожи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8. Появление ранних колоний не мешает появлению поздних колоний. (A) отставать распределение по времени клетках дикого типа металлизированных в покое. (B) отставать распределение по времени только холодной чувствительного штамма, после перевода в разрешающей температуре. (C) распределение времени запаздывания обоих штаммов высевали вместе в тех же условиях. Черная линия представляет ожидаемое распределение на основе полученных при измерении каждого штамма отдельно данных. ХорошийGreement между ожидаемыми и измеренных распределений получается, пока общее число колоний на чашку ниже 200.

.. Рисунок 9 порог обнаружения не влияет на форму распределения колония внешний вид Распределение колония появление анализировали на том же наборе данных с использованием двух различных пороговых размеров; (А) пороговый размер составляет 10 пикселей; (В) пороговый размер 50 пикселей. Количество клеток на гистограмме: прибл. 1500. Отличается порог обнаружения приводит только к сдвигу времени обнаружения.

Рисунок 10. Измерение температуры стабильность ACROSS поверхность сканера. (А) Изображение пластины с колониями Bacillus subtillis выращенных на сканере без управления питанием. Поверхность теплее на дне и поэтому колонии растут быстрее. Постепенное линия рядом с пластиной представляет собой схематическое изображение теплового градиента. (В) Стабильность Температура измерялась двух термопар, размещенных по всей поверхности сканера. Сканер нагревается во время каждого сканирования и с течением времени. (С) с системой управления питанием, температура равномерна и колонии расти с такой же скоростью. (D) То же, что (В) с модулем управления питанием. Температурная стабильность ± 0,2 ° С.

Рисунок 11. Различия в распределении появление может быть связано с диfferences в объемах твердой среде. То же самое бактериальную культуру высевали на чашках с различными объемами LB-агар, в результате чего разной высотой поверхности агара. Различные высоты привела к различным непрозрачности пластин и, следовательно, разное время обнаружения. Разница между пластины была проверена и разница между различными условиями высоты. (А) Типичные различия между пластинами равных объемов 30 ± 0,5 мл LB агаре. (B) Разница между различных условиях высоты: распределение появление измеряли для пластин с объемами 20 ± 0,5 мл (красный), 30 ± 0,5 мл (зеленый) и 40 ± 0,5 мл (синий). Каждое условие представляет собой среднее из 6 различных пластин. Пока объем пластин находится в диапазоне ± 5 мл, непрозрачность аналогично и приводит к аналогичным распределением времени внешний вид.

Discussion

Микроскопические методы, основанные на непосредственном наблюдении часто рассматриваются как «золотой стандарт» для изучения поведения одноклеточных. ScanLag, которая позволяет измерять распределение времени запаздывания в бактериальных популяций, предоставляет данные хорошо согласуются с распределением, полученным из анализа одноклеточных и достигает гораздо более высоких статистику.

Несколько важных шагов должны быть выполнены для этого метода, чтобы хорошо работать: во-первых, не идти на компромисс в разрешении сканера, который должен быть 4800 х 9600, чтобы получить хорошие изображения. Во-вторых, помните, что без модуля управления питанием (шаг 1.6), градиент температуры может развиваться на поверхности планшета и повлиять на рост. Другим важным шагом является фильтрация дефектов, таких как пыль, которые могут быть ошибочно подсчитанных как колонии с помощью программного обеспечения. Встроенный вычитание фона программного обеспечения, как правило, преодолевает эти недостатки, но иногда "ложных" колонии должныфильтровать вручную.

Основные действия по устранению неполадок может обратиться изменение между пластиной в настройках, по нескольким причинам: (а) Темпы роста микроорганизмов зависит от температуры. Различные температурно-влажностный режим может произойти из-за неравномерного вентиляции или расположения блюдо в инкубаторе. (Б) электроника сканера может нагреть и вызвать температурный градиент по всей поверхности сканера. Рисунок 10 показывает влияние такой пространственной тепловой градиент на Bacillus бактерий, вместе с измерениями температуры на поверхности сканера до и после внедрения модуля управления питанием (шаг 1.6). Заметим, что этот модуль не может быть необходимо для новых сканеров, и, если только часть поверхности сканера используется, управление мощностью может быть ненужным. (С) Плиты с различной непрозрачностью агара питательных веществ может привести к различным уровням обнаружения. На рисунке 11 показано йэ терпимость к различным объемов питательного агара, которые приводят к различным помутнения.

Экспериментально техника ScanLag легко выполнить и требуется только к пластине микроорганизмов на стандартных чашек Петри, и разместить их на поверхности сканера. Программное обеспечение, которое было разработано контролирует всю процедуру. Приобретение изображение делается автоматически, и анализ изображений для отслеживания колонии также автоматическая. Кроме того, система может быть расширена, чтобы измерять различные условия в то же время. Наконец, метод основан на коммерческих офисных сканеров и, следовательно, низкую стоимость.

Этот метод может быть расширен для изучения микроорганизмов, которые отличаются от Е. палочка К-12, однако несколько соображений должны быть сделаны. Во-первых, влияние ранних колоний, возникающих на более поздних должен быть оценен, как подробно описано в предыдущей публикации ^7. Для Е. Coli K-12,максимальная плотность КОЕ на пластине 200. Другие штаммы с различными размерами колоний, и другие возможные перекрестные помехи между колоний, может потребовать различную плотность. Во-вторых, анализ пластин откалиброван для конкретных программных основе пороговых значений, которые, возможно, потребуется изменение, в зависимости от контраста между твердой среде и в колониях. Программное обеспечение может быть продлен также для извлечения другие характеристики колонии, за отставание и скорости роста. Программный код открыт и может быть изменен, чтобы извлечь форму колонии, яркость, гладкость и цвет.

Поскольку измерения производятся на колониях, которые происходят из одной клетки, данные открывают новые фенотипы, которые не могут быть измерены с помощью измерений на уровне популяции. Важность распределения задержки времени раскрывается в присутствии антибиотиков. Многие антибиотики, как известно, эффективны только против растущих клеток; Поэтому тех пор, пока клетки остаются в лаг-фазы и не растут, они прозащищены от последствий этих антибиотиков ^21. Когда количество выживших бактерий оцениваются на временных интервалах во время лечения антибиотиками ^15,22,23, субпопуляции бактерий, называется persisters, часто обнаруживается. В некоторых случаях, иммунитет к лечению антибиотиками происходит от длительного отставания. Используя эту настройку, это отставание раскрывается и часто имеет нетривиальное распределение ²⁴ (рис. 6). Этот метод также позволяет извлечение редких мутантов. Например, после посева на мутагенезу население, мутанты могут быть определены на основе фенотипа и выделен непосредственно, без выбора. Установка может также контролировать межклеточных взаимодействий путем измерения роста колоний в зависимости от плотности соседних колоний и количественно такие явления, как кворума или распространение роящимися бактерий. Многомерные информация раскрыта на будущих экспериментов, использующих этот метод приведет к улучшению характеристик микробной популяциис и достижениям в медико-экологических исследований.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto agar	BD	214010
Difco LB broth	BD	240230
Petri dish 90 mm	Miniplast	20090-01
Epson Perfection v37	Epson	B11B207201	Flatbed Scanner with Optical resolution: 4,800 dpi, Hardware Resolution: 4,800 x 9,600 dpi, color bit depth 48-bit.
Epson Perfection v200	Epson	B11B188011
Epson Perfection 3490	Epson	B11B177011
ADU200 USB Relay	ONTRAK
Pieces of sterile black felt cloth	Custom made		Approximatly 100 x 100 mm
White plate holders	Custom made		Surface size, with 6 x 99 mm diameter hole
Delerin rings the size of the Petri dish	Custom made		Inner diameter: 72 mm Outer diameter: 86 mm Top outer diameter: 90 mm