Summary
Доставка остается основной проблемой для терапевтического реализации малых интерферирующих РНК (миРНК). Этот протокол предусматривает использование многофункционального и биосовместимого доставки миРНК платформы, состоящей из аргинина и микрочастиц пористого кремния полиэтиленимина привитые.
Introduction
Малые интерферирующие РНК (киРНК) являются двухцепочечные молекулы РНК, которые могут подавлять экспрессию генов. В последние годы, siРНК, были разработаны в качестве нового поколения биопрепаратов, которые показывают терапевтический потенциал для будущего использования в клинической практике 1-5. Тем не менее, успешная реализация миРНК терапии остается значительной проблемой, из-за ухудшения нуклеазами, плохое внутриклеточного поглощения, низкой эффективности трансфекции и неэффективного освобождения из эндосом / лизосом 5. Многие из этих препятствий могут быть преодолены путем разработки платформ доставки, которые могут безопасно и эффективно доставки миРНК в пораженной ткани. По сравнению с вирусными перевозчиков, невирусные платформы обеспечивают ряд преимуществ, таких как безопасность, низкая стоимость и простота кроя. В частности, катионных наночастиц, таких как полимеры и липиды, которые оказались полезными для миРНК доставки 3.
Ранее мы разработали дисковидные DRмкг система доставки, называемый многоступенчатый вектор (MSV). Эта платформа основана на последовательных стадиях, в котором одно транспортное средство освобождается от другой. На первом этапе автомобиль микрочастиц изготовлены из биоразлагаемого пористого кремния (PSI), в то время как второй этап транспортные средства наночастицы, заполненные препаратов или контрастных агентов 6,7. Наночастицы, которые встроены в PSI материала, постепенно выпущен как деградирует Si 8. Преимущество использования Si частиц является то, что морфология и поверхностные характеристики могут быть легко адаптированы для достижения оптимального биораспределение и высвобождение лекарственного средства. В последнее время успешное использование MSV платформы для доставки миРНК липосом в опухолевую ткань была показана в яичника и рака молочной железы мыши модели 9, 10.
В этой работе мы изготовили универсальную систему доставки для миРНК на основе принципов в MSV платформы. Эффективность этой системы доставки ранее было показано намичисле различные Серна молекул 11. Система поликатион функционализованную пористый кремний (PCPS) перевозчик, состоящий из Пси привитого полиэтиленимином (PEI) и аргинина (Arg). PEI может помочь в формировании электростатических взаимодействий с миРНК, а Arg и PSI может служить, чтобы уменьшить токсичность PEI, как ранее организованы показы 11. Кроме того, присутствие PEI может помочь в внутриклеточного поглощения и эндосом побег, а микрочастицы пси включить защиту миРНК и замедленное высвобождение. Частицы PSI постепенно разрушаются в физиологических условиях, в результате чего в формировании Arg-PEI / миРНК наночастиц (рис 1), которые имеют ярко выраженный морфологию и узкое распределение по размерам 11. Для получения подробной информации об устойчивости системы PCPS / миРНК, пожалуйста, обратитесь к исследовании Shen и др., 11. Это PCPS платформа отличается от обычного MSV, начиная со второй наночастицы этап изначально не Пресент в носителе, но формируются с течением времени, как первой стадии носитель ухудшает 11, 12. миРНК загрузки эффективность, цитотоксичность и молчания генов эффективность системы лечащего врача была оценена в пробирке. Эффективность трансфекции измеряли с помощью миРНК против атаксии телеангиэктазии мутировал (ATM) онкоген, который участвует в репарации ДНК 10. Ранее подавление ATM, как было показано, чтобы уменьшить рост опухоли в модели рака молочной железы 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCPS Получение частиц
- Окислите без функционализированных частиц пористого кремния в 30% -ном растворе перекиси водорода при 95 ° С в течение 2 ч. Aminate окисленные частицы в 2% (3- аминопропил) триэтоксисилана раствора в изопропиловом спирте в течение 2 дней при 65 ° С при осторожном перемешивании.
- Центрифуга раствор в течение 30 мин при 18800 х г и промыть частицы два раза в изопропиловом спирте и трижды в этаноле, с использованием ультразвука краткое приостановить осадок. Оставьте частиц в растворе этанола при выполнении шага 1,3 и 1,4.
- Добавить известный объем суспензии частиц (например, 10 мкл) в 10 мл изотонных разбавителем и подсчета частиц с помощью анализатора частиц подсчета, чтобы определить концентрацию частиц в маточном растворе.
- Активируйте кислотной группы L-аргинина (0,1 нмоль) с N - (3-диметиламинопропил) - -ethylcarbodiimide гидрохлорид N '(EDC, 0,1 нмоль) / N
- Кратко разрушать ультразвуком фондовый частиц раствор и добавить 1000000000 частиц в L-аргинина решения и оставить реакцию 18 ч при комнатной температуре при осторожном перемешивании.
- Активировать первую группу аспарагиновой кислоты N - (трет-бутоксикарбонил) -L-аспарагиновой кислоты (Boc-Asp-OH, 1 нмоль) с EDC (0,1 нмоль) / NHS (0,1 нмоль) в 20 мл этанола в течение 4 ч при 4 ° С при осторожном перемешивании.
- Растворите 50 мг полиэтиленимин в 10 мл этанола и добавляют раствор к смеси Boc-Asp-OH. Пусть реакцию проводили в течение 24 ч при комнатной температуре при осторожном перемешивании.
- Активация второй группы аспарагиновой кислоты в раствор Boc-Asp-OH / PEI с EDC (0,1 нмоль) / NHS (0,1 нмоль) при 4 ° С в течение 6 ч при осторожном перемешивании.
- Чтобы получить PCPS частицы, добавляют раствор частиц с шага 1,5 в раствор Вос-Asp-OH / PEI с шагом 1,8. Оставляют реакционную протекать в течение 18 ч при комнатной температуре при осторожном ст irring.
- Центрифуга раствор в течение 30 мин при 18800 х г и мыть раствора частицы три раза с этанолом, с использованием ультразвука краткое приостановить осадок.
2. PCPS частиц Характеристика
- Измерение размера частиц с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM).
- Поместите каплю суспензии частиц (10000 частиц / мкл в этаноле) на чистой двуокиси кремния SEM образца заглушки и дайте высохнуть при комнатной температуре под вакуумом.
- Измерьте SEM изображения на 8 кВ с 3-5 мм рабочее расстояние с использованием детектора в-линзы.
- Измерение дзета-потенциал частиц с использованием системы анализатора частиц.
- Смешайте 10 мкл суспензии частиц (10000 частиц / мкл) в этаноле с 1 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4).
- Загрузите образец в сложенных клеток капилляров и измерения дзета-потенциала в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Высушите частицы PCPS (от стадии подготовки PCPS частиц 1,9) в вакууме O / N.
- Добавить Серна (4 мкг) в нуклеазы без воды (20 мкл) в высушенных частиц PCPS и соникатные кратко. Используйте следующую частицу отношений миРНК: 2 × 10 5 частиц / 0,2 мкг миРНК, 4 × 10 5 частиц / 0,2 мкг киРНК, 6 × 10 5 частиц / 0,2 мкг миРНК, 8 × 10 5 частиц / 0,2 мкг киРНК, 10 × 10 5 частиц / 0,2 мкг миРНК и 12 × 10 5 частиц / 0,2 мкг киРНК.
- Инкубируют в течение 3 часов при 4 ° С на качалке (1000 оборотов в минуту), чтобы обеспечить св зывание с миРНК частиц.
4. Оптимизация соотношения частиц миРНК / PCPS
- Добавить погрузки ДНК красителя 20 мкл PCPS / контроля частиц миРНК с другой частицей соотношениях миРНК (см загрузку миРНК в PCPS частиц).
- Загрузите СэмPles в 2% агарозном геле, содержащем ДНК из геля пятно.
- Выполнение электрофореза при постоянном напряжении 120 В в течение 20 мин в проточной буфера.
- Анализ гель с приобретением изображения и программного обеспечения для анализа.
5. Выпуск миРНК от лечащего врача частиц
- Смешайте 20 мкл PCPS / контроля частиц миРНК с другой частицы к миРНК отношений (см шаг 3) в додецилсульфата натрия (SDS, 2%) и дать постоять в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Добавить загрузки ДНК краситель для образцов.
- Образцы груз в 2% агарозном геле, содержащем ДНК из геля пятно.
- Выполнение электрофореза при постоянном напряжении 120 В в течение 20 мин в проточной буфера с использованием ДНК-электрофореза и источник питания.
- Анализ гель с приобретением изображения и программного обеспечения для анализа.
6. конфокальной микроскопии из PCPS частиц
- Добавить 5 мкл PCPS / люминесцентных частиц миРНК управления (10 × 10 5 частиц / 0.2 мкг миРНК / 20 мкл) с покровным стеклом.
- Визуализация слоев частиц с помощью конфокальной микроскопии.
7. Характеристика Arg-PEI / управления миРНК наночастиц
- Для ухудшить кремния материал и образуют Arg-PEI наночастиц / управления миРНК, добавить PCPS / миРНК частицы (10 × 10 6 частиц лечащего врача / 2 мкг миРНК) к 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером и встряхивают (1000 оборотов в минуту) при 37 ° С в течение 2 дней.
- Центрифуга образца в течение 30 мин при 18800 х г и собирать надосадочную жидкость.
- Измерить размер образующихся Arg-ПЭИ / миРНК наночастиц с динамического светорассеяния (DLS).
- Смешайте 10 мкл супернатанта с 1 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) и поместить в полиэтиленовый кювете.
- Измерьте размер частиц с использованием системы анализатора частиц в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Определить размер и морфологию образующегося Arg / PEI-миРНКнаночастицы с атомно-силовой микроскопии.
- Взять 10 мкл супернатанта и места на кремниевой пластине.
- Визуализация частиц с атомно-силовой микроскопии (АСМ).
8. Культура клеток
- Культура MDA-MB-231 рака молочной железы человека клетки в клеточной культуральной среде, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина в 5% СО 2, 95% влажности и 37 ° C.
9. конфокальной микроскопии живых клеток с PCPS частиц
- Пластина клеток в культуре 2-а скользит при плотности посева от 3 х 10 5 клеток / лунку в течение 24 ч.
- Добавить PCPS частицы, загруженные с флуоресцентной управления миРНК (10 × 10 5 частиц / 0,2 мкг частиц соотношение миРНК, 50 нМ миРНК) в клетки.
- Запишите кино клеток с конфокальной микроскопии (поставляется в комплекте с камерой, 5% СО 2, 95% влажности и 37 ° С) в течение 12 ч следующего выставке частицуверен.
10. конфокальной микроскопии фиксированных клеток с PCPS частиц
- Пластина клеток в культуре 2-а скользит при плотности посева от 3 х 10 5 клеток / лунку в течение 24 ч.
- Добавить PCPS частицы, загруженные с флуоресцентной управления миРНК (10 × 10 5 частиц / 0,2 мкг частиц соотношение миРНК, 50 нМ миРНК) в клетки и инкубировать в течение 1 дня, 7 дней и 10 дней.
- Промыть клетки дважды фосфатно-буферным раствором, а затем закрепить их в 4% растворе параформальдегида в течение 10 мин.
- Промыть клеток фосфатно-буферным раствором.
- Клетки проницаемыми с 0,1% октил этоксилат фенола в течение 10 мин и затем промыть их три раза забуференным фосфатом солевым раствором.
- Блок клетки с альбумина из бычьей сыворотки (10 мг / мл) в фосфатном буферном солевом растворе в течение 10 мин при комнатной температуре при осторожном перемешивании.
- Для визуализации фибриллярного актина, инкубировать клетки с флуоресцентно меченных фаллоидином (1 мкл / 40 мклблокирующим раствором) в течение 20 мин при комнатной температуре при осторожном перемешивании, а затем промыть в солевом растворе с фосфатным буфером.
- Удалить слайды из рамы и добавить antifade реагента с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для визуализации ядро.
- Добавить покровного стекла на вершине и получать изображения клеток с конфокальной микроскопии.
11. проточной цитометрии клеток с PCPS / люминесцентных управления миРНК частиц
- Пластина клеток в 6-луночный планшет при плотности высева 3 х 10 5 клеток / лунку в течение 24 часов.
- Добавить PCPS частиц, нагруженных флуоресцентные управления миРНК (10 × 10 5 частиц / 0,2 мкг частиц с отношением миРНК, 50 нМ миРНК) к клеткам и инкубируют в течение 24 ч.
- Промыть клеток фосфатно-буферным раствором и очистить их с клеточным скребком.
- Хранить клеток в забуференном фосфатом физиологическом растворе с 2% фетальной бычьей сыворотки до анализа. Использование необработанных клеток в качестве отрицательного контроля.
- Выполните потока CYtometry.
12. Жизнеспособность клеток с PCPS частиц и PCPS / контроля миРНК частиц
- Пластина клеток в 96-луночный планшет с при плотности клеток 3 × 10 3 клеток / лунку в течение 24 ч.
- Лечить клеток с PCPS частиц (1,5 × 10 5 / лунку и 6 × 10 5 / лунку) или частицы миРНК PCPS / управления (10 × 10 5 частиц / 0,2 мкг частиц соотношение миРНК, 10 нм и 100 нм миРНК) в течение 48 ч и 72 ч. Использование необработанные клетки и клетки, обработанные с фосфатным буферным раствором (того же объема, что и добавленных частиц) в качестве контрольной группы. Пробирной каждый образец в трех экземплярах.
- Выполните анализ клеточной пролиферации в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Представление данных в виде среднего ± стандартное отклонение.
13. Вестерн-блот клеток с PCPS / ATM мутировал миРНК частиц
- Пластина клеток в 6-луночного планшета при плотности клеток 2 × 10 5 клеток / жELL в течение 24 часов.
- Инкубируйте клетки с PCPS / управления миРНК (50 нМ) частиц или лечащего врача / ATM миРНК (50 нм) частиц в течение 72 часов. Использование необработанных клеток в качестве контроля.
- Лизиса клеток с использованием реагента экстракции белка с добавлением ингибитора протеазы коктейль.
- Центрифуга клеточных лизатов в течение 10 мин при 14000 х г и извлечения супернатанта.
- Определить концентрацию белка с белком количественного анализа в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Добавить загрузки образца буфера (5 мкл 2-меркаптоэтанола / мл буфера) к образцам и нагревают их в течение 6 мин при 99 ° С.
- Загрузка образцов белка (20 мкг / мл) в 12% SDS-полиакриламидном геле в рабочем буфере и выполнять электрофореза в полиакриламидном геле (1 ч, 120 В) с помощью электрофореза и источник питания.
- Передача гель в буфере передачи (с 20% метанола) на нитроцеллюлозную мембрану (1 ч, 100 В) с помощью электрофореза иисточник питания.
- Блок мембрану с 5% сухого молока в течение 1 часа.
- Выдержите мембрану с первичными антителами ATM (от кролика) в блокировании решения (начиная с шага 13,9) в соотношении 1: 1000 разбавления O / N.
- Промыть мембраны с фосфатным буферным раствором, содержащим 0,1% полиэтиленгликоль монолаурат сорбитана, а затем инкубируют его с вторичным антителом (анти-кроличий) в блокирующем растворе (из стадии 13,9) при разведении 1: 2500 в течение 1 часа.
- Промыть мембраны с фосфатным буферным раствором, содержащим 0,1% полиэтиленгликоль монолаурат сорбитана и обнаружения полос белка с Вестерн-блот-реагента обнаружения с помощью захвата изображения и программное обеспечение для анализа.
- Для контроля загрузки, мыть мембрану и повторите шаги 13.9-13.12 помощью β-актина первичного антитела (от мышей, 1: 10000 разбавления) и вторичного антитела (анти-мышь 1: 4000 разведение).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает использование невирусной системы доставки для безопасного и эффективного миРНК трансфекции. Результаты СЭМ показывают, что частицы лечащего врача имеют цилиндрическую форму и имеют диаметр 2,6 мкм (фиг.2А). Частицы положительно заряженный с дзета-потенциал приблизительно 8,21 (фиг.2В), тем самым позволяя электростатического связывания с отрицательно заряженными нуклеотидов. Конфокальных изображений различных слоев частиц лечащего врача, показывают, что флуоресцентный контроль миРНК загружен внутри пористых частиц кремния (фиг.2с). Формирование и выпуск Arg-PEI / миРНК наночастиц из частиц PSI была подтверждена DLS и АСМ. Распределение размера частиц в диапазоне от 70-120 нм, со средним размером 94 нм (фиг 2D). АСМ изображения показывают, что наночастицы имеют сферическую форму (фиг 2E).
РатиO частиц в миРНК был оптимизирован с помощью электрофореза в агарозном геле, чтобы обеспечить высокую аффинность связывания (фиг.3А). Широкий спектр частицы с коэффициентами миРНК был использован (2 × 10 5, 4 × 10 5, 6 × 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 5 и 12 × 10 5 /0.2 мкг миРНК). Результаты показывают, что миРНК может связываться плотно частиц, когда количество частиц выше 8 × 10 5. Соотношении 10 × 10 5 лечащего врача / 0,2 мкг миРНК был выбран для дальнейших экспериментов. Кроме того, миРНК был успешно освобожден от носителя при обработке ДСН, как показано на фиг.3В.
Далее, подвал интернализации люминесцентных частиц миРНК управления лечащего врача / оценивалась в MDA-MB-231 клеток. Конфокальные снимки, сделанные после 24 часов лечения, показывают, что частицы эффективно усваивается клетками (рис 4 фиг.5 показывает, что 89% клеток были усвоены лечащего врача / миРНК частицы после 24 ч инкубации. Кроме того, процесс интернализации был записан в течение 12 ч (видео 1). Эти результаты показывают, что частицы лечащего врача может эффективно доставлять в клетки миРНК. Долгосрочное накопление миРНК внутрь клеток также была оценена с помощью конфокальной микроскопии. В 7-й день и 10 день миРНК был еще обнаруживается внутри клеток (рисунок 6).
Одним из наиболее важных факторов, которые следует учитывать при разработке системы доставки миРНК является безопасность носителя 13. PEI, как известно, образуют polyplexes с миРНК, помощь в клеточного поглощения и выпуска триггер эндосом / лизосом. Тем не менее, PEI может оказывать токсическое действие, благодаря наличию положительно заряженных первичных аминогрупп в основной цепи 14,15. Например, ПЭИ связывания с гликокаликса на поверхности клетки может привести к FOия больших кластеров 16. Чтобы устранить эту заряда, вызванного токсичностью, PEI был ковалентно конъюгированный с аргинина через линкер моста, чтобы уменьшить количество первичных аминогрупп. Жизнеспособность клеток оставались более 95% после 48 ч и 72 ч, когда частицы и миРНК были использованы в концентрации до 6 × 10 5 / лунку и 100 нМ соответственно (7А). Далее, трансфекции эффективность киРНК против онкогена ATM была оценена в MDA-MB-231 клеток. Западные результаты блот показывают, что уровни белка банкоматов уменьшается после лечения с PCPS / ATM миРНК (7В). Полученные результаты свидетельствуют о платформе PCPS является безопасным и эффективную систему доставки для миРНК.
Рисунок 1. Схематическое представление пористого кремния (PCPS) частиц поликатиона функционализованную. сильный> аргинин (Arg) -polyethylenimine (PEI) / Малые интерферирующие РНК (киРНК) наночастицы образуются после деградации кремния (Si).
Рисунок 2. Характеристика PCPS частиц. (А) сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) изображение PCPS частиц. (В) Зета потенциал PCPS частиц. (C) Конфокальные изображения различных слоев частиц управления миРНК PCPS / люминесцентные. Распределение (D) Размер аргинина Arg-пей / контроля миРНК наночастиц, освобожденных из микрочастиц пористого кремния. (E) Атомно-силовая микроскопия (АСМ) изображения Arg-PEI / контроля миРНК наночастиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. агарозном геле с целью оптимизации системы доставки PCPS / миРНК. (А) аффинность связывания между частицами лечащего врача и контролировать миРНК. Полосы представляют несвязанного Серна. (В) миРНК выпуск после инкубации с 2% SDS в течение 1 часа. Полосы представляют собой общее Серна (несвязанного и связанного). Пример 1: миРНК; образец 2: 2 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг миРНК; Примеры 3: 4 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг миРНК; Примеры 4: 6 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг миРНК; Образец 5: 8 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг миРНК; Образец 6: 10 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг миРНК; Примеры 7: 12 × 10 5 PCPS частиц / 0,2 мкг киРНК.
75 / 52075fig4.jpg "/>
Рисунок 4. конфокальной микроскопии изображения PCPS / люминесцентных частиц миРНК (красный) MDA-MB-231 клеток (24 ч инкубации). Ядро и фибриллярного актина визуализировали с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, голубой ) и фаллоидином (зеленый), соответственно. Три различные слои были обследованы (верхняя, средняя и базальной). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Количественный анализ проточной цитометрии флуоресцентных MDA-MB-231 клетки после инкубации с PCPS / контрольных частиц флуоресцентного миРНК. Необработанные клетки использовали в качестве отрицательного контроля. 89% клеток были усвоены частиц.
igure 6 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52075 / 52075fig6.jpg "/>
Рисунок 6. Конфокальные изображения люминесцентные управления миРНК (красный) внутри MDA-MB-231 клеток. Клетки инкубировали с PCPS / люминесцентных частиц контроля миРНК на 1 день, 7 дней и 10 дней. Затем клетки визуализировали с конфокальной микроскопии. Ядро и фибриллярного актина визуализировали с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, голубой) и фаллоидином (зеленый), соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7. Жизнеспособность клеток и генной глушителей в пробирке. () Жизнеспособность анализ клеток инкубировали с PCPS частиц и PCPS / контроль миРНК частиц (SCR). Эксперимент проводили в поездкисиликатное, и результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Необработанные клетки (пробел) и клетки инкубировали с PBS использовали в качестве контролей. (B) Вестерн-блот из PCPS / атаксия телеангиэктазия мутировал (ATM) миРНК частицы. Клетки подвергали воздействию PCPS / контроля миРНК (SCR) частиц и PCPS / ATM миРНК частиц. Необработанные клетки (макет) были использованы в качестве контроля. β-актина использовали в качестве контроля нагрузки.
Видео 1 . Время-зависимое поглощение лечащего врача / люминесцентных частиц контроля миРНК в живых MDA-MB-231 клеток. видео было записано в течение 12 ч после экспозиции клеток с частицами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описан способ успешной доставки и трансфекции в клетки миРНК. В частности, доставки миРНК достигается с помощью многофункционального платформу, состоящую из поликатиона функциональными частиц PSI. Использование миРНК терапии имеет большой потенциал, например, лечение рака, как и различные онкогены могут быть направлены с высокой специфичностью. Таким образом, существует потребность в разработке средств доставки миРНК, которые могут смягчить проблемы миРНК терапии. В заключение, мы наметили протокол, который показывает перспективы для безопасного и эффективного предоставления миРНК. Тем не менее, есть некоторые ключевые факторы, которые должны быть приняты во внимание при выполнении описанной методики. Например, важным фактором при получении частиц лечащего врача, чтобы справиться с миРНК тщательно, чтобы избежать деградации нуклеазами. В частности, чистые перчатки и РНКазы трубы и вода должна быть использована в любой момент времени при работе смиРНК. Если трансфекции миРНК эффективность низка, спрей, который удаляет загрязнения РНКазы может быть использован для распыления перчатки и рабочие зоны. Кроме того, если трансфекции была неудачной, миРНК должны быть испытаны с коммерческой реагента для трансфекции, чтобы определить, является ли проблема вызвана миРНК или частиц. Еще одним важным фактором для успешной реализации PCPS / миРНК системы доставки, чтобы заботиться при выполнении центрифугирования и стиральные шаги. А именно, супернатант должен быть полностью отброшены, чтобы удалить избыток реагентов, которые необходимы во всех стадий получения частиц.
Важным преимуществом системы PCPS / доставки миРНК является безопасность. Несколько миРНК трансфекции агенты имеют высокую катионный заряд, что способствует клеточной токсичности 13,15. В самом деле, большинство коммерческих протоколов, показывают, что реагенты должны быть инкубировали с клетками в течение всего лишь нескольких часов, чтобы избежать гибели клеток. Напротив, CEзаполняет могут подвергаться воздействию частиц лечащего врача в течение нескольких дней без каких-либо признаков токсичности, как это видно из результатов жизнеспособности клеток. Частицы лечащего врача может связываться миРНК с высоким сродством из-за присутствия ПЭИ. Однако заряд индуцированный токсичность PEI предотвращается уникальной настройки доставки платформы. Особенно ковалентного связывания Arg к PEI и инкапсуляции PEI внутри Si поры способствовать уменьшению токсичности. Другим преимуществом PCPS платформы является то, что миРНК трансфекции может происходить в присутствии сыворотки. Другие существующие методы, как правило, требуют использования бессывороточной среде для культивирования клеток, таким образом, добавление дополнительных шагов в процессе трансфекции и потенциально мешать обычных сигнальных путей клетки.
Дополнительным преимуществом системы PCPS является то, что он не требует какой-либо модификации молекул миРНК. В то время как некоторые современные методы требуют выполнения сложных шагов сопряжения для стабилизации Серна или позволяют Cellular интернализация 13, система PCPS опирается на простого смешивания для миРНК нагрузки. Связывание с PEI и поры в материале Si обеспечить защитную среду для миРНК, тем самым уменьшая контакт с нуклеаз. Частицы лечащего врача можно хранить в течение длительных периодов времени, как высушенного материала или в изопропиловом спирте. Кроме того, если частицы PCPS / миРНК лиофилизируют они могут храниться в течение не менее трех месяцев при 4 ° С. Лиофилизированные частицы лечащего врача должно быть приостановлено в РНКазы свободной воды непосредственно перед трансфекцией, и не должны быть сохранены в растворе. И, наконец, разрешение на PCPS платформы замедленное высвобождение миРНК, как сообщалось ранее 11, следовательно, увеличение временного периода, в котором генов-мишеней остаются подавлено. Соответственно, после того, как клеточной интернализации, частицы Si, постепенно деградируют, что приводит к образованию наночастиц Arg-ПЭИ / миРНК. Впоследствии, миРНК медленно высвобождается в цитоплазму, где он может связываться с MesseNger РНК (мРНК), тем самым оказывая биологическую активность. Хотя, лечащие врачи частицы обеспечивают несколько преимуществ по сравнению с существующими методами доставки миРНК, ограничение техники является то, что микрочастицы, не являющиеся функциональными PSI требуется в качестве исходного материала. В то время как частицы могут быть синтезированы с использованием фотолитографии и электрохимического травления 17, эти методы не являются легкодоступными во всех учреждениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
- De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Rolland, A.
- Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61 (10), 850-862 (2009).
- Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109 (2), 259-302 (2009).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 129-138 (2009).
- Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141 (3), 320-327 (2010).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29 (3), 377-384 (2008).
- Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102 (10), 3540-3549 (2014).
- Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19 (7), 1806-1815 (2013).
- Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9 (9-10), 1799-1808 Forthcoming.
- Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7 (11), 9867-9880 (2013).
- Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35 (1), 423-431 (2014).
- Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267 (1), 44-53 (2010).
- Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19 (7), 1448-1455 (2008).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212 (3), 223-231 (1985).
- Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5 (11), 815-821 (2010).
