Lokalisering, Identifikation og Excision af murint fedt-depoter

Summary

På grund af den drastiske og negative sammenhæng mellem fedme og andre co-morbiditet, forskning om den rolle fedt spiller i sygdom og helbred er berettiget. Vi præsenterer en protokol til isolering og udtagelse af adipose depoter gør det muligt at studiet af fedt ved hjælp af in situ og in vitro metoder.

Introduction

Adipose gjort en bemærkelsesværdig optræden i mediernes søgelys på grund af fedme dramatiske stigning i løbet af de sidste årtier af det 20. århundrede. Fedme i dag berører mere end en tredjedel af de voksne og 17% af børn og unge i USA (US) ^1. Spanning alle etniske grupper, har statistisk forskning omkring fedmeepidemien vist, at ikke-spansktalende sorte har den højeste alder justeret sats af fedme (49,5%) sammenlignet med mexicanske amerikanere (40,4%), alle latinamerikanere (39,1%) og ikke- Hispanic hvide (34,3%) ^2. Den økonomiske effekt af fedme er også en voksende bekymring for sundhedssystemet. I 2012 blev det anslået, at den årlige helbredsundersøgelse udgifter til pleje for fedme i USA i 2005 var 190200 millioner dollars, næsten 21% af den samlede medicinske udgifter budget. Desværre blev fedme blandt børn skønnes at være ansvarlig for 14 milliarder dollar i direkte medicinske omkostninger alene. Statistisk set blev det bestemt, at den gennemsnitlige medicinske omkostninger vedpersoner med fedme var 2741 dollar højere om året end dem uden denne sygelighed ^3-5.

Fedme er en væsentlig risikofaktor for en række af tilstande, såsom: type 2 diabetes, dyslipidæmi, kardiovaskulær sygdom, kræft, muskel- knoglelidelser og kronisk inflammation. Fedme er dybt bundet til patogenesen af metabolisk syndrom og andre kroniske sygdomme ^6-8. Med sådanne drastiske og negative sammenhænge mellem fedme og andre co-morbiditet, har den videnskabelige forskning fokuseret opmærksomhed for bedre at forstå den aktuelle epidemi og de forskelligartede og afgørende roller ved fedt spillet.

Historisk blev fedtvæv betragtes ligegyldig og blot blev betragtes som en simpel påfyldning væv. I øjeblikket har fedt vist sig at spille mange vigtige roller i kroppens funktion i: stofskifte, hormon regulering, inflammation, beskyttelse og isolering ^9. Fedtvæv er sammensat primært afadipocytter, men indeholder også pericytter, endotelceller, monocytter, makrofager og pluripotente stamceller ^8. Fedtvæv er fordelt i hele kroppen i forskellige depoter. De vigtigste depoter kan findes subdermalt, subkutant, intramuskulært, og viscerally ^10. Adipose depoter er blevet vist at have depot specifikke metaboliske profiler, som har vist et depot specifik tilbøjelighed til fedme og beslægtede lidelser ^8.

Traditionelt har fedtvæv blevet klassificeret i to store typer: hvid fedtvæv (WAT) og brunt fedtvæv (BAT); selvom nyere litteratur angiver tilstedeværelse af en tredje gruppe døbt brite eller beige fedt ^11. Fedtvæv har vist sig at have forskellige farver, morfologier, metaboliske funktioner, biokemiske træk og genetiske ekspressionsmønstre ^10. Adipocytter i WAT har en enkelt, stor lipid dråber og varierende mængder af mitokondrier. WATer overvejende fundet i subkutane og viscerale lokaliteter i kroppen. WAT fungerer primært som en lokalitet af energilagring og beskyttelse orgel. Adipocytter i BAT har en multilokulært morfologi og rigelige mitokondrier. BAT ligger primært i nakken og store blodkar i thorax samt skulderbladene ^12. BAT primært funktioner i energi-expending adfærd, der regulerer termogenese ^7. Brite eller beige adipose har vist sig at dele en analog morfologi og udtryk for BAT, men har vist sig at være stammede fra hvide adipocytter ^11.

Den beskrevne kirurgiske metode i dette manuskript giver forskere med kapacitet til at analysere forskellige effekter, at faktorer som: miljø, lægemidler, og genetik, har på fedt; samt den gavnlige eller skadelige rolle fedt spiller i sygdom og helbred. Også, som giver mulighed for at identificere og isolere forskellige typer af fedtvæv tilgive mulighed for bedre at forstå de biokemiske forbindelser og forskelle mellem depoter. Dette kan hjælpe til at bestemme forholdet mellem placering, funktion og typer af fedt i kroppen. Denne beskrevne metode opnår dette ved at stille de midler til grov visualisering, genekspression analyse proteinekspression analyse, histologisk undersøgelse og isolering af primære cellelinier for in vitro-studier. I øjeblikket er der mange artikler, der giver indsigt i den metaboliske adfærd forskellige adipose depoter, samt deres anatomiske steder; men giver ikke en grundig metode til at specifikt lokalisere, identificere og isolere disse depoter. Denne kirurgiske metode giver en præcis teknik, der giver mulighed for isolering af flere depoter med en minimal mængde af dissektion og kontaminering i forhold til andre metoder beregnet til isolat af en eller to depoter ^13-14.

Målet med denne protokol er at giveen præcis fremgangsmåde til identifikation og isolering af forskellige typer af fedtdepoter fra flere anatomiske steder.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev udført med godkendelse af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of Cincinnati og i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr fra National Institutes of Health (NIH publikation nr . 85-23, Revideret 1996).

1. Afliv og Steriliser Mouse

1. Placer musen i en dropbox indeholder en supratheraputic dosis af isofluran og lad det inhalere til effekt. Når musen aflivet, fjernes fra kassen.
2. Cervically forskyde som et andet middel til dødshjælp.
3. Steriliser den ydre overflade af musen ved udrensning dyret med 70% ethanol.

2. Identifikation og isolering af tre forskellige fedt-depoter

1. Brunt fedtvæv (BAT) Isolation:
   1. Sørg for, at pelsen er våd fra alkoholen udrensning for at hjælpe med at skære gennem den epidermale og dermale Layers.
   2. Anbring musen i rygleje med ryggen mod bordet.
   3. Grab huden lige under mellemgulvet med pincet, elevator og incise med en saks.
   4. Skæres tværs rundt om omkredsen af ​​musen for at blotlægge peritoneum.
   5. Reveal sommerfuglen-formede BAT depot ved degloving den øverste halvdel af musen. Hold nedre lemmer og bagkrop i den ene hånd og trække huden op mod hovedet.
   6. Vend musen, så den er placeret tilbøjelige på bordet. Pas på ikke at forurene den udsatte depot med hår.
   7. Rene kirurgiske instrumenter og ændring til en frisk par handsker.
   8. Find skulderbladene og tilsvarende depot. Fjern forsigtigt eventuelle overfladisk hvid fedt på toppen af ​​sommerfugl og derefter dissekere sommerfuglen af ​​interscapular brunt fedt. Vær omhyggelig med at undgå musklen tæt forbundet med den brune fedt.
      BEMÆRK: Anvendelse af en dissektion mikroskop anbefales til fjernelse af white adipose, samt separation af den brune fedtvæv fra skulderbladene.
   9. Fjern fedt depot og overføre til et 2 ml mikrocentrifugerør.
   10. Hvis RNA eller protein, der skal ekstraheres, fryse vævet ved nedsænkning i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. Frys prøven på én gang for at forhindre nedbrydning. Hvis dyrkning, dækker vævet i DMEF-12 og sæt på is indtil alle prøver er indsamlet til kultur (supplerende info).
2. Isolering af subcutant fedtvæv (SQ), en hvid fedtvæv Depot (WAT):
   1. Tag en frisk par handsker for ikke på tværs af forurene mellem fedtdepoter.
   2. Reveal lyskelymfeknuder, trekantede SQ depoter af DE-gloving den nederste halvdel af musen. Hold øvre lemmer og thorax i den ene hånd og trække huden ned mod fødderne med den anden hånd.
   3. Vend musen i liggende stilling og samtidig være omhyggelig med ikke at forurene den udsatte depot med hår.
   4. Clean surgical instrumenter og skifte til en ny par handsker.
   5. Dissekere forsigtigt trekanter af SQ fedt. Pas på ikke at forurene prøven med muskler, tilstødende fedt, mælkekirtler eller ved at skære alle fartøjer og forurene prøven med blod.
      BEMÆRK: Brugen af ​​en dissektion mikroskop anbefales, hvis grænser ikke er klart defineret.
   6. Fjern fedtdepoter og overførsel til 2 ml mikrocentrifugerør.
   7. Hvis RNA eller protein, der skal ekstraheres, fryse vævet ved nedsænkning i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. Frys prøven på én gang for at forhindre nedbrydning.
   8. For farvning, fastsætte eller indlejre i oktober Hvis dyrkning, dækker vævet i DMEF-12 og sæt på is indtil alle prøver er indsamlet til kultur (supplerende info).
3. Isolering af gonade Fat en Visceral fedtvæv (moms) og White fedtvæv (WAT) Depot:
   1. Tag en frisk par handsker for ikke på tværs af forurene mellem fedtdepoter.
   2. Med scissors, skære peritoneum tværs, direkte under membranen. Skær bughinden fra membranen til rektum midten coronalt at eksponere abdominale organer.
   3. Find testiklerne eller æggestokke og identificere den vedlagte hvide fedtvæv, kendt som epididymal fedt hos mænd eller gonadal fedtvæv hos kvinder.
   4. Rene kirurgiske instrumenter og skifte til en ny par handsker
   5. Dissekere forsigtigt begge epididymale fedtdepoter fra testiklerne, epididymides og Vasa deferentia. Eller hvis hun forsigtigt dissekere både gonadale fedtpuder fra æggestokkene.
   6. Fjern fedtdepoter og overføre dem til 2 ml mikrocentrifugerør.
   7. Hvis RNA eller protein, der skal ekstraheres, fryse vævet ved nedsænkning i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. Frys prøven på én gang for at forhindre nedbrydning.
   8. For farvning, fastsætte eller indlejre i oktober Hvis dyrkning, dækker vævet i DMEF-12 og sæt på is indtil alle prøver er indsamlet til kultur (supplerende info).

   3. Isolering af Perivaskulær fedtvæv (PVAT)

   1. Isolering af Heart:
      1. Læg mus i rygleje med øvre og nedre lemmer forlænget udad.
      2. Sikker vedhæng anvender kirurgisk tape.
      3. Efter placering af musen som anført ovenfor, skabe spænding ved at løfte op i formet som et sværd proces med pincet. Skær vandret gennem membranen, udsætter den nedre del af brysthulen.
      4. Samtidig med at spænding, ved at løfte op i formet som et sværd proces, skære gennem brystkassen overlegent mod hovedet, lige til den side af brystbenet.
      5. Saml brystkassen lige ringere kravebenet, og skæres langs den nedre længde af kravebenet ud mod armhulen i begge retninger. Brysthulen og dens indhold (hjerte, lunger, etc.) skulle nu være klart synlige.
      6. Rengør brysthulen af ​​uvedkommende blod og væske ved hjælp af steril gaUze til at absorbere væsken. Hvis indsamling organer eller fartøjer være sikker på at rigelig (supplerende info).
      7. Når området er ryddet af væske, skære bronkier og knyttet fartøjer til at fjerne lungerne, så bedre eksponering af hjertet.
   2. Lokalisering og udtagelse af Aorta Perivaskulær fedtvæv (PVAT):
      1. Fjern følgende organer at identificere ringere dele af aorta bedre: lever, mave, milt, bugspytkirtel, tarme, og colon.
      2. Først starte med identifikation af maven og spiserøret. Skær spiserøret på gastro-øsofageal junction at frigøre maven fra kroppen.
      3. Dernæst identificerer tarmene og omgivende mesenterium. Skær overfladisk gennem mesenteriet, som den ligger meget tæt på den renale del af aorta, og derefter "køre tarmen."
      4. Skær colon slippe så tæt på endetarmen som muligt. Således frigør maven, tarmen og colon fra mus.
      5. Reflytte mave, tarm, colon, bugspytkirtel og milt ved at skære gennem fastgørelse mesenterium og fartøjer. Bugspytkirtlen og milt bør komme fri med maven, tarmen og colon.
      6. Tag leveren ved at skære gennem den hepatiske vener og fastgørelse mesenterium, fjerne alle lapper.
      7. Klip det viscerale lag og fedt omgiver nyrerne. Lad nyrer til aorta in vivo til at tjene som geografiske markører for forskellige segmenter af aorta.
      8. Skyl området med sterilt 1x PBS og fjern alt væsken ved absorption med en steril gaze.
      9. Brug af mikro-saks og mikro-pincet, adskille aorta fra dens dorsale tilknytning til rygsøjlen og dens ventral fastgørelse til spiserøret.
      10. Isoler aorta ved at følge og afmontering af aorta længden af ​​aorta descendens fra oprindelsen i hjertet til bifurkationen i iliaca region.
      11. Identificere og isolere subclavia fartøjer. Isoler disse fartøjerfra halsen til aortaroden til bedre at udsætte aorta krydset og rod i hjertet.
      12. Fjern thymus derefter sender brachiocephale arterie, den venstre, fælles carotidarterie, og den venstre arteria subclavia, tillader bevægelse af hjertet.
      13. Med hjælp fra en dissektion mikroskop, se perivaskulære fedtvæv (PVAT) lag omgiver aorta.
      14. Tager stor omhu at ikke klemme eller presse PVAT, træk forsigtigt PVAT vej fra aorta med mikro-pincet. Skåret forsigtigt fastgørelsen af ​​PVAT til aorta med mikrosakse starter ved thorax region blot overlegen hvor membranen er placeret.
          BEMÆRK: Det anbefales dissektion mikroskop.
      15. Gentag denne proces hele længden af ​​aorta, efterbehandling på den infrarenale aorta region, som ligger lige overlegen bækkenforgreningen af ​​aortakarret.
      16. Hvis der ønskes aortabuen PVAT, brugte samme metode til at fjerne PVAT fra mindre curvature af buen.
      17. Placer PVAT prøver i 2 ml mikrocentrifugerør (s).
      18. Hvis RNA eller protein, der skal ekstraheres, fryse vævet ved nedsænkning i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. Frys prøven på én gang for at forhindre nedbrydning. Hvis dyrkning, dækker vævet i DMEF-12 og sæt på is indtil alle prøver er indsamlet til kultur (supplerende info).
          BEMÆRK: Yderligere adipose depoter til at overveje, hvis de er interesseret i en omfattende fedt depot analysen indeholde: retroperitoneal, mesenterisk, oment, pericardial og knæhaselymfeknuderne.

Representative Results

Identifikation og lokalisering af lyske- subkutan adipose, interscapular brown adipose, visceral epididymal adipose (figur 1), samt aortabuen perivaskulær adipose, thorax aorta adipose, suprarenal aorta adipose og den infrarenale aorta adipose (figur 2) blev opnået med succes ved hjælp af den beskrevne kirurgiske metode. Histologisk undersøgelse og differentiering mellem BAT og Wat prøver blev positivt evalueret under anvendelse af hematoxylin og eosin (H & E) farvning (Figur 3). Analyse af RNA niveauer af adiponectin (AdipoQ), peroxisomproliferatoraktiveret receptor gamma (PPAR-γ), celledød-inducerende DFFA-lignende effektor a (CIDEA), og andet fedt specifikke markører blev målt for alle ovennævnte isolerede og udskårne depoter (data ikke vist).

Primære cellelinjer af subkutane adipocytter og perivaskulære adipocytter blev dyrket og differentieret fra preadipocyte s til adipocyter succes til microarray analyse. De dyrkede præadipocytter konverteres til adipocyter blev bekræftet med Oil Red O-farvning (figur 4). Vellykket isolation, kultur og differentiering af adipocytter blev opnået til brug i in vitro-studier, og protein-aktivitet lykkedes målt. Enzymatisk aktivitet af matrix metaloprotease-2 (MMP2) blev målt i en behandlingsgruppe sammenlignet med kontrollen. Aktiviteten af MMP2 blev målt in situ i en primær perivaskulær adipocyt line via zymografi (figur 5).

Figur 1. Anatomiske placeringer af C57BL / 6 mandlige mus adipose depoter. (A) interscapular brunt fedt fedt depot. (B) Inguinal subkutant fedt fedt depot. (C) Visceral epididymal fedt fedt depot.w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2. anatomiske steder af PVAT depoter i en C57BL / 6 hanmus. (A) aortabuen perivaskulær fedt depot. (B) thorax aorta perivaskulær fedt depot. (C) suprarenal aorta perivaskulær fedt depot. (D) infrarenale aorta perivaskulær fedt depot. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3. H & E farvning af BAT og WAT fedt. (A) H 8 E farvning paraformaldehyd faste, paraffinindlejret C57BL / 6 hanmus prøve af WAT adipose ved en 40X forstørrelse (B) H & E farvning paraformaldehyd faste, paraffinindlejret C57BL / 6 hanmus prøve af BAT ved en 40X forstørrelse.. Venligst klik her for et større version af dette tal.

Figur 4. Oil Red O-farvning af dyrkede PVAT præadipocytter og adipocytter. (A) Oil Red O-farvning af dyrkede aorta perivaskulære præadipocytter ved baseline af differentiering på 20X forstørrelse med fase kontrast. (B) Oil Red O-farvning af dyrkede aorta perivaskulære adipocytter efter 5 dages differentiering ved 20X forstørrelse med fase kontrast.es / ftp_upload / 52174 / 52174fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5. Zymografi af differentierede adipocytter isoleret fra perivaskulær fedtvæv, viste en nedsat aktivitet af MMP2 frigivet efter behandling sammenlignet med ubehandlede (kontrol) celler, * P <0,01 sammenlignet med kontrol.

Discussion

Fedme kan føre til en stor masse morbiditeter og fuld forståelse af den rolle, som fedtvæv spiller, er ikke fuldt forstået; derfor fortsat forskning på området for fedt er nødvendig. Dyremodeller specifikt murine modeller er ideelle til indledende forskning i udviklingen af ​​sygdomme og afprøvning af potentielle farmaceutiske behandlinger. Ved at bruge disse modeller, præcis isolation og udtagelse af adipose depoter er et yderst vigtigt og nødvendigt redskab i studiet af patologi adipøst ramt sygdomme.

I den nuværende litteratur om adipose depoter, der er en betydelig mængde litteratur om metabolisk adfærd og variation mellem fedt-depoter, såvel som deres anatomiske steder. Men der er få, der giver en grundig metode til at specifikt lokalisere, identificere og isolere disse depoter. På baggrund af gennemgangen af ​​de nuværende isolation metoder til fedt, er der en lille delmængde af protokoller that give metode for, hvordan at isolere en eller to depoter ad gangen. Men en præcis teknik, der giver mulighed for isolering af flere depoter med en minimal mængde af dissektion og forurening samt adresser forskellige metoder til at studere de indsamlede prøver er karakteristisk for denne protokol ^13-14.

Inden for denne metode, er der flere trin, der er af afgørende betydning for isolering og renheden af ​​prøven. Rengøringsredskaber, handsker og overflader ofte for at fjerne hår og forurenende stoffer er en absolut nødvendighed skridt til at undgå depot forurening. Når skære i huden tværs omkring omkredsen af ​​musen til at blotlægge peritoneum for degloving, er det afgørende at undgå at skære for dybt. Skæring bughinden vil gøre degloving meget vanskeligt og vil øge risikoen for forurening af prøven. Når udskæring af SQ adipose depoter er det afgørende at identificere de trekantede grænser depotet før udtagelse nogen af ​​annoncenipose. Desuden bør omhyggelige snit gøres for at undgå muskel, og tilstødende fartøjer, kirtler og fedt. Dette vil forhindre kontaminering af prøven fra alternativ adipose, kirtelvæv, muskel- eller blod.

Den største begrænsning for isolation og udtagelse af adipose depoter, i denne metode, og andre lignende metoder kan findes i fastlæggelsen af ​​grænserne for visse depoter. På grund af de dårligt definerede grænser i depoter, såsom subkutane depoter, kan isolation mangler en lille mængde af forurening fra nabolandet fedt være udfordrende. En anden begrænsning kan findes i at sikre nok væv indsamles til supplerende eksperimenter i vaskulære forbundet depoter. Denne begrænsning kræver undertiden pooling af prøver, selv om dette er afhængig af stedet for isolation og kost forbundet med dyret.

Efter adipose depoter isoleret, kan de anvendes til en række assays. Det fedt kan være brugd for molekylære undersøgelser såsom proteinekspression enzymaktivitet og genekspression analyse. Derudover kan man isolere adipocyter til primær cellelinie in vitro-undersøgelser. Immortaliserede cellelinier kan også anvendes til in vitro-undersøgelser har imidlertid udødelige celler er ikke så troværdig som primære isolerede cellelinjer. Endelig kan adipose fastsættes eller frosset i OCT til histologisk undersøgelse for at identificere leukocytinfiltration, protein lokalisering samt karakterisering af adipocyt morfologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
DMEF-12	Sigma Aldrich	D-6421	Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes	Midsci	MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK