Protocol
नोट: सभी प्रयोग प्रोटोकॉल फ्रेंच पशु प्रयोगों और आचार समिति ने मंजूरी दे दी है और संख्या एक-75-2065 के साथ "सेवा संरक्षण एट Sante Animales, Environnement" द्वारा मान्य किया गया। नमूना आकार प्रयोगों के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए चुना है, और पशु नैतिक विनियमन के 3R के अनुसार कर रहे हैं।
माउस के 1. तैयारी
- अनेस्थेसिया
- इमेजिंग की छोटी अवधि (कम से कम एक घंटा) के लिए, Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) युक्त एक खारा समाधान के 200 μl की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ माउस चतनाशून्य।
- वैकल्पिक रूप से, इमेजिंग की लंबी अवधि के लिए (4 घंटा तक), एक अनुकूलित मुखौटा के माध्यम से ओ 2/2 एन ओ के एक 70/30 मिश्रण में वाष्पीकृत isoflurane के 2.5% की साँस लेना के साथ माउस चतनाशून्य।
- नोट: इस तरह से और अधिक स्थिर बेहोशी के लिए प्रदान करता है और दवाओं के धारावाहिक intraperitoneal इंजेक्शन से बचा जाता है। माउस anesthetized है एक बार, शिकंजा के साथ पैर पैड की उत्तेजना के माध्यम से बेहोशी के लिए जाँच करें।
- संवहनी धुंधला / अतिरिक्त धुंधला
- संवहनी धुंधला के लिए:, पूंछ नस में नसों के Rhodamin-dextran के 200 μl (2 एमडीए, खारा बफर में 10 मिलीग्राम / एमएल) इंजेक्षन।
- न्युट्रोफिल धुंधला के लिए: नसों पूंछ नस में खारा समाधान के 100 μl में (क्लोन 1A8) Ly6G पीई के 2 माइक्रोग्राम प्रति इंजेक्षन।
- स्थिरीकरण
- स्थिरीकरण के लिए, माइक्रोस्कोप के लिए और संवेदनाहारी गैस inhalator के लिए अनुकूलित एक कस्टम बनाया स्टीरियोटैक्टिक धारक का उपयोग करें।
नोट: sterotactic धारक पशु के सिर को कसने के लिए अन्य हटाने योग्य और अनुकूलनीय दो धातु प्लेट कोष्ठक, एक तय किया जा रहा है और, के साथ एक धातु का समर्थन है। - साँस लेने आंदोलनों से अलगाव सुनिश्चित करने के लिए बनाए रखने की प्लेटों के बीच माउस के सिर को स्थापित करें। को बनाए रखना प्लेटें और एसके फैलाने के लिए सिर के बीच कान कसोमें। स्थिरता और जानवर की सांस लेने कल्याण के लिए जाँच करें।
- स्थिरीकरण के लिए, माइक्रोस्कोप के लिए और संवेदनाहारी गैस inhalator के लिए अनुकूलित एक कस्टम बनाया स्टीरियोटैक्टिक धारक का उपयोग करें।
- खोपड़ी निकालें
- ध्यान से आंखों के साथ संपर्क से बचने, एक बाँझ applicator के साथ खोपड़ी के बाल गीला करने के लिए इथेनॉल 70% का उपयोग करें।
- पूरी तरह से ललाट हड्डी को पार्श्विका हड्डी के पिछड़े से खोपड़ी को हटाने के लिए बाँझ कैंची और शिकंजा के साथ त्वचा में कटौती। व्यापक रक्तस्राव को रोकने के लिए आँखें और कान से 3 मिमी तक दूर रखें। खोपड़ी (periosteum) को कवर ढीली संयोजी ऊतक निकालें। गर्म पीबीएस लथपथ कागज तौलिया के साथ शेष बाल धो लें।
- विसर्जन प्रणाली की स्थापना
- सीधे वितरण को नियंत्रित करने के लिए एक छोटे गेज सुई का उपयोग खोपड़ी पर शल्य गोंद के साथ 18mm व्यास की एक रबर की अंगूठी चिपकाएं। (30 μl पर्याप्त होना चाहिए) रिसाव को रोकने के लिए रबर की अंगूठी के पूरे परिधि गोंद।
- पीबीएस लथपथ कागज तौलिया के साथ अंगूठी के तहत एक आखिरी बार खोपड़ी साफ करें और फिर से पूर्ण विसर्जन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस जोड़नेखोपड़ी। आंख सूखापन से बचने के लिए माउस के हर आंख पर सोडियम क्लोराइड 0.9% समाधान या विशिष्ट नेत्र मरहम की एक बूंद जोड़ें। उद्देश्य के तहत स्टीरियोटैक्टिक धारक खींचें।
- लगभग सीधा प्रसारण के माध्यम से माइक्रोस्कोप आंख का उपयोग कर क्षेत्र की स्थिति।
2. दो photon इमेजिंग अधिग्रहण
- चुनिंदा 680 से 1080 एनएम के लिए tunable, NIR से प्रकाश की 140fs दालों प्रदान करता है जो नीलमणि क्रिस्टल लेजर, और लेजर सत्ता पर नियंत्रण के लिए एक acousto ऑप्टिक न्यूनाधिक: एक तिवारी के साथ मिलकर multiphoton माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। दो dichroic दर्पण (565 एनएम और 690 एनएम), 565/610 और 500/550 bandpass फिल्टर के संयोजन के साथ (3 फ्लोरोसेंट चैनल के साथ रिकॉर्डिंग है कि सक्षम) 3 बाहरी गैर descanned डिटेक्टरों (NDD) सहित एक विन्यास का प्रयोग करें, और एक 20 (एनए = 1) पानी विसर्जन उद्देश्य × एक योजना Apochromat साथ 485 कम पास फिल्टर,।
- Anaes की अच्छी homeothermy अनुमति देने के लिए हीटिंग चैम्बर सेटthetized माउस।,
नोट: तापमान बेहतर स्थिरता के लिए सत्र इमेजिंग से पहले एक घंटा सेट किया जा सकता है। हमारे मामले में, 32 डिग्री सेल्सियस anaesthetized माउस का इष्टतम शरीर के तापमान (36-37 डिग्री सेल्सियस) प्राप्त करने के लिए चुना गया है और 4 घंटा अप करने के लिए बनाए रखा है। इस तापमान इस्तेमाल किया (डिजिटल जांच इस बिंदु की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस्तेमाल हीटिंग चैम्बर काला / अंधेरा है और बाहरी प्रकाश संक्रमण से बचने के लिए प्रणाली (उद्देश्यों और मोटर चालित प्लेट) का एक हिस्सा शामिल किया गया है। - प्रणाली पर बारी
- नीलम लेजर, तो पूरे माइक्रोस्कोप प्रणाली: तिवारी चालू करें। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर लॉन्च। 870 एनएम लेजर तरंग दैर्ध्य सीमा निर्धारित करें। रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त NDD का चयन करें।
नोट: हमारे मामले में, दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) 19 और सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ECFP) 485 कम पास फिल्टर के बाद NDD से पता चला रहे हैं। 500/550 bandpass फिल्टर और rhodamin-dextran टी ने पता लगाया है के बाद ECFP भी NDD से पता चला हैवह NDD 565/610 bandpass फिल्टर के बाद।
- नीलम लेजर, तो पूरे माइक्रोस्कोप प्रणाली: तिवारी चालू करें। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर लॉन्च। 870 एनएम लेजर तरंग दैर्ध्य सीमा निर्धारित करें। रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त NDD का चयन करें।
- अधिग्रहण सेटिंग्स समायोजित करें
- सॉफ्टवेयर की "लाइव अधिग्रहण" इमेजिंग आदेश का उपयोग करें और माइक्रोस्कोप दिशात्मक नियंत्रण का उपयोग कर, ECFP और rhodamine संकेत के साथ एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने को समायोजित। न्यूनतम तस्वीर-नुकसान के साथ सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए कम से कम करने के लिए लेजर शक्ति निर्धारित करें।
नोट: प्रयुक्त बिजली सेटिंग ब्याज के क्षेत्र की गहराई के अनुसार बदलता रहता है। आमतौर पर AOM सेटिंग्स 15 मेगावाट के आसपास उद्देश्य से परे एक लेजर शक्ति का प्रतिनिधित्व करता है, जो चारों ओर 20%, सेट कर रहे हैं। यह प्रत्येक NDD फोटो विरंजन और फोटो-नुकसान को कम करने के लिए PMTs पर लाभ शक्ति को बढ़ाने के लिए बेहतर है। ठेठ अधिग्रहण सेटिंग्स एकल 1.58 μs के एक पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय के साथ स्कैनिंग, और एक 1.5 बढ़ाई के साथ 512 x 512 पिक्सल के एक संकल्प हैं।
- सॉफ्टवेयर की "लाइव अधिग्रहण" इमेजिंग आदेश का उपयोग करें और माइक्रोस्कोप दिशात्मक नियंत्रण का उपयोग कर, ECFP और rhodamine संकेत के साथ एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने को समायोजित। न्यूनतम तस्वीर-नुकसान के साथ सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए कम से कम करने के लिए लेजर शक्ति निर्धारित करें।
- ब्याज की चुनिंदा क्षेत्रों
- रिकॉर्डिंग के मापदंडों सेट कर रहे हैं एक बार, फिर से, "" जी अधिग्रहण आदेश का उपयोगऔर वास्तविक समय में निगरानी रखी जा करने के लिए एक वांछित (एक्स, वाई, जेड) क्षेत्र का चयन करने के लिए ऊतक सर्वेक्षण।
नोट: आमतौर पर, हम संवहनी और parenchymal क्षेत्रों सहित दोनों एक क्षेत्र चुना है। - "स्थिति" सॉफ्टवेयर कमांड के साथ क्षेत्र रजिस्टर।
नोट: इस आदेश को एक्स, वाई, विभिन्न सुदूर क्षेत्रों के Z निर्देशांक memorizes। - का चयन करें और एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर (3 तक) के ब्याज की अतिरिक्त क्षेत्रों रजिस्टर।
- चुना बढ़ाई के साथ आवश्यक मात्रा के अनुसार पहली याद स्थिति पर "z ढेर" सॉफ्टवेयर कमांड के साथ एक 3 डी z ढेर सेट करें। पहला गहरी स्थिति, और फिर उच्चतम स्थिति याद। गहराई के साथ लेजर शक्ति मानक के अनुसार।
नोट: एकाधिक सहवर्ती क्षेत्र इमेजिंग के लिए, हम 12 माइक्रोन मोटाई की मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक क्षेत्र के लिए 3 माइक्रोन Z-चरणों के द्वारा अलग 5 स्लाइस के अधिग्रहण। ये सेटिंग्स अध्ययन सेल के प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
- रिकॉर्डिंग के मापदंडों सेट कर रहे हैं एक बार, फिर से, "" जी अधिग्रहण आदेश का उपयोगऔर वास्तविक समय में निगरानी रखी जा करने के लिए एक वांछित (एक्स, वाई, जेड) क्षेत्र का चयन करने के लिए ऊतक सर्वेक्षण।
- लॉन्च अधिग्रहण
- चुनना220; समय श्रृंखला "सॉफ्टवेयर कमान और समय अंतराल की अवधि और चक्रों की संख्या का चयन करें। "प्रयोग शुरू" सॉफ्टवेयर आदेश का चयन करके आवश्यक समय व्यतीत हो और अवधि के अनुसार समय चूक इमेजिंग शुरू करो।
नोट: हमारे मामले में, हम 30 मिनट के वास्तविक समय का प्रतिनिधित्व 60 चक्र के दौरान एक मात्रा प्रत्येक 30 सेकंड के अधिग्रहण। छोटे समय व्यतीत हो जाने के रक्त वाहिका में तेजी से सेल रोलिंग ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। इस मामले पतले z ढेर और कोई और अधिक से अधिक 2 अलग अलग क्षेत्रों में एक ही समय में दर्ज किया जा सकता है। - सेट अप की नियमित निगरानी।
- हमेशा यह बेहोश है सुनिश्चित करने के लिए पशु की निगरानी।
नोट: मूंछ या जानवर के पैरों के झटकों पुनरुद्धार के संकेतक हैं। पशु की सांस लेने झटकेदार है मामले में, isoflurane की मात्रा से थोड़ा कम किया जा सकता है। अधिग्रहण के दौरान मजबूत ऊतक बहाव माउस पुनरुद्धार का सूचक है। - उद्देश्य यह सुनिश्चित ठीक से डूब जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस betwee नवीनीकृतn दो अधिग्रहण (30 मिनट)।
नोट: अधिग्रहण के दौरान संकेत के प्रगतिशील लापता होने पीबीएस रिसाव का सूचक है।
- हमेशा यह बेहोश है सुनिश्चित करने के लिए पशु की निगरानी।
- चुनना220; समय श्रृंखला "सॉफ्टवेयर कमान और समय अंतराल की अवधि और चक्रों की संख्या का चयन करें। "प्रयोग शुरू" सॉफ्टवेयर आदेश का चयन करके आवश्यक समय व्यतीत हो और अवधि के अनुसार समय चूक इमेजिंग शुरू करो।
- प्रक्रिया के अंत
- आवश्यक वीडियो रिकॉर्ड हो जाने के बाद, तेजी से पुनर्जीवन से पहले ग्रीवा अव्यवस्था से पशु euthanize।
नोट: घाव भरने अनुदैर्ध्य इमेजिंग प्रदर्शन करने की संभावना को सीमित करता है, जो 24 से 48 घंटे में एक पपड़ी के गठन की ओर जाता है।
- आवश्यक वीडियो रिकॉर्ड हो जाने के बाद, तेजी से पुनर्जीवन से पहले ग्रीवा अव्यवस्था से पशु euthanize।
3. डेटा विश्लेषण
- बहाव सुधार
- 3 डी स्वचालित ट्रैकिंग के लिए Imaris Bitplane सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
- Imaris पर 3 डी छवि अनुक्रम खोलें। चुनें कमांड "हाजिर", और समान क्षेत्र में वितरित यदि संभव हो तो, 4 अलग लंगर अंक की एक न्यूनतम के लिए सभी समय बिंदुओं के लिए मैन्युअल ट्रैकिंग (माउस क्लिक करे + पाली) उत्पन्न करते हैं।
- "संपादित ट्रैक" टैब में "सही बहाव" आदेश का उपयोग बहाव सुधार लागू करें।
- टी के लिए जाँच करेंवह एक्स में सुधार, वाई और विशेष रूप से Z में की गुणवत्ता artefactual ढुलमुल से बचने के लिए।
नोट: सुधार नहीं संतोषजनक है, तो अन्य लंगर अंक प्रयास करें या विश्लेषण से वीडियो बाहर।
- सेल ट्रैकिंग
- कमांड "नए स्थानों को जोड़ने" का प्रयोग करें और कलन विधि सेटिंग "समय के साथ ट्रैक स्पॉट 'का चयन करें। अगले चरण पर जाएँ।
- "स्रोत चैनल" आदेश का उपयोग ब्याज की पूरी चैनल पर या तो स्वत: सेल ट्रैकिंग प्रक्रिया को लागू करें। 10 माइक्रोन के लिए सेट वस्तुओं (यानी, कोशिकाओं) व्यास। अगले चरण पर जाएँ।
नोट: चुनाव मापा संकेत की वस्तुओं और विशिष्टता के बीच अंतर पर निर्भर करेगा। संक्षेप में, पूरे चैनल पर स्वचालित ट्रैकिंग का पता चला संकेत ब्याज की वस्तु के लिए विशिष्ट है तभी संभव है यदि। एसएचजी और ECFP दोनों 485 कम पास फिल्टर के बाद NDD से पता चला रहे हैं क्योंकि, ट्रैकिंग और अधिक विशिष्ट और 5 के बाद NDD द्वारा दर्ज ECFP संकेत का उपयोग कर कुशल हो जाएगा00/550 bandpass फिल्टर। संकुल या घने पैक वस्तुओं 3.1.2 कदम करने के लिए इसी तरह की व्यक्तिगत वस्तुओं का मार्गदर्शन चयन की आवश्यकता होगी। - , "गुणवत्ता" फिल्टर प्रकार का चयन करें unspecific वस्तुओं की ट्रैकिंग बाहर करने के लिए सीमा निर्धारित। अगले चरण पर जाएँ।
- दो स्थानों के बीच "अधिकतम दूरी" और "गैप आकार 'का सही मानकों के साथ" ब्राउनियन एल्गोरिथ्म मोशन "चुनें। ट्रैक पीढ़ी को मान्य।
- पटरियों स्वचालित रूप से गणना कर रहे हैं एक बार, "ट्रैक अवधि" फिल्टर प्रकार का चयन पटरियों (4 समय अंक का प्रतिनिधित्व) से कम 120 सेकंड को समाप्त करने के लिए सीमा निर्धारित।
- अनिवार्य: स्वचालित ट्रैकिंग के बाद, पटरियों की गुणवत्ता की जांच।
- वस्तुओं को ट्रैक रास्तों का अनुसरण करें कि जाँच करने के लिए बार बार उतारना। , "संपादित करें" टैब में उपलब्ध ट्रैक बिंदु सुधार के विकल्पों का उपयोग नहीं करते हैं: "हटाना" कमांड (किसी भी ट्रैक पी हटाना साथ गलत या अनुचित पटरियों को नष्टoint व्यक्तिगत रूप से) "काटना" कमांड के प्रयोग से। ट्रैक पथ असंतत है, तो लापता समय अंक (माउस क्लिक करे + पाली) को जोड़ने के लिए एक दिया ट्रैक पर सभी बिंदुओं का चयन करें, और प्रयोग "संपादित ट्रैक" टैब में कमांड "कनेक्ट"।
- मात्रा का ठहराव मापदंडों
- "प्राथमिकताएँ" आदेश में "आँकड़ा" टैब का चयन करें सूची में ब्याज की गतिशील मापदंडों का चयन करें। चुनें कमान और उत्पन्न एक्सेल फाइल को बचाने के "फाइल करने के लिए सभी आँकड़ों में निर्यात करें"।
नोट: कई गतिशील मापदंडों को सीधे इस ट्रैक लंबाई, तात्कालिक वेग, मतलब वेग के रूप में सॉफ्टवेयर से प्राप्त किया है, और सीधा ट्रैक कर रहे हैं। गतिशीलता गुणांक 6, 20 निर्धारित किया जा सकता है, लेकिन सीधे सॉफ्टवेयर के द्वारा प्रदान नहीं की है। - प्रत्येक कक्ष के लिए, समय (δt) के प्रत्येक अवधि के लिए विस्थापन का मतलब गणना (एक 30 सेकंड का समय व्यतीत हो फिल्म के लिए, δt 30, 60, 90 सेकंड, आदि) हो जाएगा।समय के अंतराल के एक समारोह के रूप में वर्ग विस्थापन का मतलब साजिश है। वक्र के रैखिक भाग के ढलान की गणना के द्वारा गतिशीलता गुणांक प्राप्त करते हैं।
- "प्राथमिकताएँ" आदेश में "आँकड़ा" टैब का चयन करें सूची में ब्याज की गतिशील मापदंडों का चयन करें। चुनें कमान और उत्पन्न एक्सेल फाइल को बचाने के "फाइल करने के लिए सभी आँकड़ों में निर्यात करें"।
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Representative Results
माउस खोपड़ी संरचना intravital इमेजिंग द्वारा अस्थि मज्जा शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा अवसर प्रदान करता है। सामने के पार्श्विका आसपास के क्षेत्र पतली होने की हड्डी, यह हड्डी के घर्षण के बिना medullar niches के लिए पहुँच पाने के लिए संभव है। एक एक MacBlue ट्रांसजेनिक माउस की खोपड़ी की एक विस्तृत 2D क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है चित्रा। हड्डी मैट्रिक्स मुख्य रूप से एसएचजी 19 से मैं आसानी से detectable कोलेजन से बना है। Rhodamin-dextran के इंजेक्शन अस्थि मज्जा की संवहनी नेटवर्क दाग और हड्डी मैट्रिक्स और जहाजों से 14 के बीच parenchymal अस्थि मज्जा आलों की पहचान के लिए अनुमति देता है। ECFP कोशिकाओं अस्थि मज्जा के दो डिब्बों में वितरित की, लेकिन हड्डी मैट्रिक्स से अनुपस्थित रहे हैं। Monocytes मैन्युअल रूप से ऊतक के भीतर अपने स्थान के अनुसार वर्गीकृत कर रहे हैं। संवहनी monocyte पूरे सेल पोत के आकार की अनदेखी, वाहिका संरचना के भीतर है जब परिभाषित किया गया है। केवल बड़ी इकट्ठा करने venules हमारे एक से बाहर रखा गया हैnalysis। सेल vasculature और हड्डी मैट्रिक्स के बीच स्थित है जब parenchymal monocyte परिभाषित किया गया है।
ब्याज (अनुपूरक वीडियो 1 और 2) के विशिष्ट क्षेत्र की समय चूक इमेजिंग या तो नाड़ी (2A चित्रा) या parenchymal (चित्रा 2B) monocytes के लिए समय के साथ अलग-अलग सेल प्रक्षेपवक्र की गणना के लिए अनुमति देता है। ट्रैक की लंबाई parenchymal monocytes प्रदर्शन संवहनी monocytes की तुलना में विस्थापन कम है कि पता चलता है। समय के साथ विस्थापन का विश्लेषण दोनों डिब्बों (चित्रा -2) में monocytes के माध्य वेग तुलना करती है। समय के एक समारोह के रूप में मतलब वर्ग विस्थापन बेतरतीब गति के स्थानिक हद तक का एक उपाय है। गतिशीलता गुणांक (चर्चा अनुभाग देखें) वक्र के रैखिक भाग की ढलान से निर्धारित होता है और सेल विस्थापन की एक बेहतर विचार प्रदान करता है। संवहनी monocytes (एमसी = 71μm² / एस) की गतिशीलता गुणांक गतिशीलता coefficie तुलना में अधिक हैparenchymal monocytes के NT (एमसी = 4.4μm² / एस)।
अधिग्रहण के समय संकल्प औसत सेल वेग के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। रॉलिंग संवहनी monocytes एक कम समय में देरी के भीतर महत्वपूर्ण विस्थापन बना सकते हैं। एक और अधिक सटीक सेल ट्रैकिंग के लिए, अधिग्रहण के समय अंतराल को कम करने के लिए बेहतर। चित्रा 3 दो अलग अलग समय-संकल्प के साथ monocyte ट्रैकिंग का एक उदाहरण से पता चलता है। एक 30 सेकंड समय के अंतराल में 10 सेकंड के समय के अंतराल की तुलना में सटीकता के साथ ही (हरी धराशायी लाइन में) रास्ते की लंबाई कम कर देता है।
अंत में, चित्रा 4 monocytes के लिए समन्वित रूप से एक और सेल सबसेट का विश्लेषण करने की संभावना दिखाता है। Ly6G परिपक्व माउस neutrophils के एक विशिष्ट मार्कर है। (इस मामले Phyco-erythrin में) एक fluorochrome के साथ संयुक्त विरोधी Ly6G के इंजेक्शन सीधे vivo में इमेजिंग अनुक्रम दाग न्यूट्रोफिल से पहले 5 मिनट। यह दृष्टिकोण एक अतिरिक्त मंद प्रदान करता हैविश्लेषण और संभावना के ension अलग सेल सबसेट के व्यवहार की तुलना करें। इस तरह के दृष्टिकोण monocyte डिब्बों में कैंपेन्स परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
खोपड़ी अस्थि मज्जा संगठन की चित्रा 1. वाइड क्षेत्र। MacBlue माउस से खोपड़ी स्थिर राज्य अस्थि मज्जा के vivo दो photon लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी छवि। (लाल रंग में) vasculature इमेजिंग सत्र से पहले 2MDa Rhodamin-dextran 5 मिनट की पूंछ व्यर्थ इंजेक्शन से सना हुआ है। हड्डी दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (नीला) द्वारा कल्पना की है। ECFP + monocytes (सियान) parenchymal आलों (वाहिका संरचना और हड्डी के बीच अंधेरे क्षेत्रों) के भीतर स्थित है और वाहिकाओं के भीतर कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. वास्तविक समय सेल ट्रैकिंग। (ए) vasculature और (बी) पैरेन्काइमा भीतर monocytes के समय के साथ प्रतिनिधि ट्रैक पथ। प्रत्येक कक्ष के लिए पटरियों (ग्रीन लाइन) स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। लाल धब्बे नज़र रखी कोशिकाओं के द्रव्यमान का केंद्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। संवहनी और parenchymal monocytes के बीच (सी) मतलब वेग तुलना। मान व्हिटनी सांख्यिकीय विश्लेषण *** संवहनी और parenchymal monocytes के लिए प्रस्तुत किया जाता है समय के एक समारोह के रूप में पी <0001। (डी) मतलब चुकता विस्थापन (एमएसडी) का प्रतिनिधित्व करता है, प्रदर्शन किया गया है। रेखीय वक्र एक गैर विवश वातावरण में यादृच्छिक चल इंगित करता है जबकि asymptotic वक्र, समय के साथ कोशिकाओं के विवश विस्थापन इंगित करता है। गतिशीलता गुणांक सेल विस्थापन की हद तक इंगित करता है और सी के ढलान से निर्धारित होता है रेखीय प्रतिगमन द्वारा गणना urve। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
रोलिंग monocytes के अध्ययन में चित्रा 3. समय अंतराल संकल्प। प्रतिनिधि छवि दृश्यों वृद्धि समय संकल्प रोलिंग सेल प्रक्षेपवक्र की शुद्धता में सुधार दिखा। 10 सेकंड के समय अंतराल के साथ (उत्तर प्रदेश) छवि अनुक्रम। 30 सेकंड के समय अंतराल के साथ (नीचे) छवि अनुक्रम। ट्रैक पथ की गुणवत्ता में सुधार हुआ है और उसी या विपरीत के लिए दो अलग अलग कोशिकाओं पर विचार का खतरा कम हो जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Medullar न्यूट्रोफिल और monocytes के विवो सह स्थानीयकरण में 4 चित्र। यह आंकड़ा एक fluorochrome के साथ संयुक्त विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी इंजेक्शन लगाने के द्वारा, समन्वित रूप से monocytes साथ vivo में एक और सेल सबसेट का पता लगाने के लिए संभावना दिखाता है। Ly6G-पीई एंटीबॉडी के 2 माइक्रोग्राम प्रति 5 मिनट MacBlue माउस की खोपड़ी अस्थि मज्जा इमेजिंग से पहले नसों इंजेक्ट कर दिया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Parenchymal monocytes के पूरक वीडियो 1. प्रवासी व्यवहार। एक MacBlue माउस की खोपड़ी अस्थि मज्जा पैरेन्काइमा में monocytes के स्थिर राज्य प्रवासी गतिविधि के vivo 3 डी इमेजिंग। ECFP + संकेत सियान में है। प्रत्येक कोशिका (लाल डॉट) के लिए प्रवासी रास्तों हरे रंग में दिखाई देते हैं।
संवहनी monocytes के पूरक वीडियो 2. प्रवासी व्यवहार। एक MacBlue माउस की खोपड़ी अस्थि मज्जा vasculature में monocytes के स्थिर राज्य प्रवासी गतिविधि के vivo 3 डी इमेजिंग। ECFP + संकेत सियान में है। (2 एम डीए) rhodamine-dextran अस्थि मज्जा वाहिका (लाल) भेद करने के लिए इमेजिंग सत्र से पहले इंजेक्ट किया गया था। प्रत्येक कोशिका (लाल डॉट) के लिए प्रवासी रास्तों हरे रंग में दिखाई देते हैं।
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Discussion
vivo इमेजिंग पद्धति के महत्वपूर्ण बिंदुओं इमेजिंग की अवधि को अधिकतम करने और भड़काऊ कोशिकाओं की गतिशीलता को प्रभावित कर सकता है, जो जीवाणु संक्रमण और सूजन के जोखिम को कम करने के लिए ध्यान केंद्रित करने की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं। सर्जरी अस्थि मज्जा के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए कम से कम है प्रदर्शन के रूप में खोपड़ी अस्थि मज्जा की इमेजिंग इन लक्ष्यों की इस प्रकार है। बाँझ सामग्री और दवाइयों का उपयोग सेल homeostasis में गड़बड़ी उत्पन्न हो सकता है कि संक्रमण के जोखिम को सीमित करने के लिए आवश्यक है।
स्टीरियोटैक्टिक धारक के विकास चुनौतीपूर्ण हो सकता है और (उद्देश्य और motorized खुर्दबीन के मंच, संज्ञाहरण के लिए गैस inhalator के उपयोग के बीच की दूरी) विशिष्ट प्रत्येक प्रणाली के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। यह एक व्यापक इमेजिंग सतह पहुँच के लिए संभव के रूप में क्षैतिज रूप में माउस का सिर लाने के लिए महत्वपूर्ण है। पशु तैनात है एक बार, यह कई मिनट requir हो सकता है कि संभावना हैएड फोकल हवाई जहाज़ का अच्छा स्थिरता प्राप्त करने के लिए। इसलिए, यह अधिग्रहण रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले ऊतक बहाव के लिए जाँच करने के लिए सिफारिश की है। हित के क्षेत्रों के चयन के साथ एक साथ इस प्रक्रिया को थोड़ी देर के लिए पिछले सकता है, क्योंकि यह भी नियमित रूप से Ketamin / Xylazin इस्तेमाल किया गया है अगर पशु बेहोश है कि जाँच करने के लिए, और रिसाव और वाष्पीकरण रूप में कर सकते उद्देश्य के समुचित विसर्जन के लिए जाँच करने के लिए सिफारिश की है होते हैं।
खोपड़ी पर रबर की अंगूठी की अच्छी स्थिति प्रक्रिया में एक और महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है। Cyanoacrylate गोंद स्थिरता और सीलिंग के मामले में अच्छे परिणाम प्रदान करता है, लेकिन एक ऊतक के हित के क्षेत्र के लिए खोपड़ी और ब्लॉक का उपयोग शामिल किया जा सकता है, जो गोंद की अत्यधिक लोड हो रहा है, को रोकने के लिए की जरूरत है। एक गिलास coverslip के बिना खोपड़ी के प्रत्यक्ष विसर्जन का लाभ हड्डी की गहरी क्षेत्रों के लिए उपयोग हो रहा है। खोपड़ी एक सादे सतह नहीं है, क्योंकि इसके अलावा, इस चुनाव के लिए इमेजिंग क्षेत्र की सीमा नहीं होगीचित्रा 1 में प्रदर्शित के रूप में एक विस्तृत इमेजिंग क्षेत्र की इजाजत दी खोपड़ी और coverslip के बीच चातुर्य सतह,।
सभी इमेजिंग तकनीक के लिए, अधिग्रहण की गति और गुणवत्ता के संकल्प के बीच चुनाव एक समझौता है। इस प्रकार, संख्या और समय की प्रति इकाई छवियों की गुणवत्ता सीमित कर रहे हैं, और चुनाव संबोधित वैज्ञानिक सवाल पर निर्भर करता है। Parenchymal monocytes धीमी गति से गतिशील या बिना डंठल कर रहे हैं, जबकि आम तौर पर, संवहनी monocytes तेजी, कोशिकाओं चल रहे हैं। रोलिंग कोशिकाओं का एक सटीक ट्रैकिंग चित्रा 2 में दिखाया गया है अधिग्रहण के उच्च समय संकल्प की आवश्यकता है। बिना डंठल कोशिकाओं के लिए उच्च इमेजिंग दर बेकार और उच्च एक्स, वाई है, जेड संकल्प उदाहरण के लिए dendrites के फैलने योग्य गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए पसंद किया जा सकता है। फास्ट कोशिकाओं Z में उनके विस्थापन की एक लंबी ट्रैकिंग पाने के लिए मोटा मात्रा की आवश्यकता होगी।
समय के एक समारोह के रूप में मतलब वर्ग विस्थापन सॉफ्टवेयर Imaris द्वारा प्रदान नहीं की है। सिद्धांतोंइस तथ्य पर आधारित इस प्रतिनिधित्व के ले किसी भी मुठभेड़ या संरचनात्मक कसना बिना ballistically यात्रा का एक उद्देश्य के लिए, यह यात्रा की दूरी समय अंतराल (चित्रा 2 डी) के लिए आनुपातिक होगा, कि। इस प्रकार ढलान के linearity एक गैर विवश वातावरण में एक यादृच्छिक चल इंगित करता है। इसके विपरीत, वक्र के asymptotic आकार सेल की आबादी के समय के साथ एक विवश विस्थापन को प्रतिबिंबित करेगा। इस गणना का दूसरा फायदा वेग कभी कभी द्रव्यमान का केंद्र की artefactual विस्थापन द्वारा overestimated है। इस फैलने योग्य गतिविधि के साथ धीमी गति से गतिशील सेल के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, रेखीय प्रतिगमन द्वारा गणना की वक्र के ढलान से गतिशीलता गुणांक की गणना cellover समय 21 के एक असली विस्थापन इंगित करता है।
Vivo में Ly6G धुंधला इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान विश्लेषण का एक नया पैरामीटर जोड़ने की संभावना दिखाता है (चित्रा 3 एट अल) का सुझाव दे अपनी गतिशीलता में कोई दोष मनाया है। संवहनी neutrophils के 98% से अधिक ठीक से लेबल कर रहे हैं, अस्थि मज्जा neutrophils के धुंधला कम कुशल है, और मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता दृढ़ता से अस्थि मज्जा पैरेन्काइमा की ओर एंटीबॉडी की कम पहुंच, सुझाव कम है (डेटा) नहीं दिखाया। सेल कार्यों के लिए Rhodamin dextran, क्वांटम डॉट्स, या ऐसे DAPI, propidium आयोडाइड के रूप में apoptotic या परिगलित कोशिकाओं के अन्य विशिष्ट रंजक, Sytox 22, या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ऐसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों 23 के उत्पादन के रूप में, इमेजिंग के दौरान पूंछ नस के माध्यम से नसों के द्वारा जोड़ा जा सकता है प्रक्रिया और इस तरह के सेल मौत, phagocytosis और न्युट्रोफिल कोशिकी जाल के रूप में कार्यात्मक गुण यों के लिए एक अच्छा अवसर प्रदान करते हैं। Mazo एट अल 12 अच्छी तरह से दो अलग अलग संवहनी रंगों का इस्तेमाल कियाबेहतर विपरीत पैरेन्काइमा और vasculature को कम और उच्च आणविक वजन के साथ। फ्लोरोसेंट रंजक की पसंद अलग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के सहवर्ती अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है। दरअसल, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य सभी इस्तेमाल फ्लोरोसेंट रंगों के बीच सबसे अच्छा समझौता पाने के लिए तदनुसार चुना जाएगा।
इस के साथ साथ इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल विवो में अब तक मुश्किल था अध्ययन, जिनमें से एक सेल डिब्बे, की जैविक गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए यह संभव बनाता है। अस्थि मज्जा ऊतक के histological विश्लेषण आमतौर पर पतली धारा अनुमति देने के लिए हड्डी विकैल्सीकरण की लंबी तैयारी की आवश्यकता है, और यह केवल ऊतक का एक स्थिर दृष्टिकोण प्रदान करता है। गतिशील दृश्य पैरेन्काइमा और अस्थि मज्जा sinusoids के बीच सेल विनिमय की दर पर प्रकाश डाला गया। यह तेजी से प्रक्रिया भड़काऊ संकेत 5 या myeloaplasive कीमोथेरेपी शर्त पर सेल जुटाना तंत्र की एक बेहतर समझ के लिए आदेश में समझने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है6 आहार। हम सेल intravasation 6 की घटना की सूचना दी है, लेकिन इस प्रक्रिया की वजह से लगातार राज्य में कम आवृत्ति करने के लिए मुश्किल से detectable है। हालांकि, यह भड़काऊ सिगनल पर बढ़ाया होने की संभावना है। ऐसे CCR2, CX3CR1 या CXCR4 के रूप में केमोकाइन रिसेप्टर्स अत्यधिक, intravasation की प्रक्रिया में सेल प्रवास के रास्ते में उपन्यास मौलिक अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए इन रिसेप्टर्स की आनुवंशिक रद्द की इसलिए उपयोग फंसा रहे हैं
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Acknowledgments
लेखकों संपादकीय सहायता के लिए ऐनी Daron और पियरे लुइस Loyher शुक्रिया अदा करना चाहता, दो photon माइक्रोस्कोप और सहायता प्रजनन चूहों के लिए जानवरों की सुविधा "एनएसी" और केमिली Baudesson साथ सहायता के लिए Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS)। अनुदान समझौते के तहत इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है (FP7 / 2007-2013) एन 304,810 ° - छापे, और एन Université पियरे एट मैरी क्यूरी से Inserm से 241,440-Endostem, ° "उभार "ला से" "से," लीग contre Le कैंसर एसोसिएशन ला Recherche सुर ले कैंसर डालना "और" से एजेंस नेशनल डे ला Recherche "कार्यक्रम उभार 2012 (ANR-Emma-050)। पीएच ला "लीग contre Le कैंसर" द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
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