Abstract
Veel gram-negatieve bacteriën, waaronder pathogene Yersinia spp. Tewerk type III secretie systemen effector eiwitten verplaatsen in eukaryote doelcellen. Binnen de gastheercel de effector eiwitten cellulaire functies te manipuleren ten behoeve van de bacteriën. Om beter inzicht in de controle van het type III secretie tijdens gastheercel interactie, gevoelige en nauwkeurige tests om translocatie te meten zijn vereist. We beschrijven hier de toepassing van een assay op basis van de fusie van een Yersinia enterocolitica effector eiwitfragment (Yersinia buitenste eiwit; YopE). TEM-1 beta-lactamase voor kwantitatieve analyse van translocatie De test berust op de splitsing van een cel permeant FRET dye (CCF4 / AM) door translocatie beta-lactamase fusie. Na splitsing van het cefalosporine kern van CCF4 door de beta-lactamase, FRET van cumarine fluoresceïne wordt verstoord en excitatie van de cumarine eenheid leidt tot blauwe fluorescentie-emissie.Verschillende toepassingen van deze werkwijze zijn beschreven in de literatuur benadrukken zijn veelzijdigheid. De werkwijze maakt analyse van translocatie in vitro en in in vivo, bijvoorbeeld in een muismodel. Detectie van de fluorescentie signalen kan worden uitgevoerd met plaatlezers, FACS-analyse of fluorescentiemicroscopie. In de hier beschreven in vitro translocatie van effector fusies in HeLa-cellen door verschillende Yersinia mutanten opstelling wordt bewaakt door laser scanning microscopie. Opname intracellulaire omzetting van de FRET van de reporter door beta-lactamase fusie effector in real-time werkt krachtig kwantitatieve resultaten. We tonen hier voorbeeldgegevens, waaruit blijkt verhoogde translocatie door Y. enterocolitica YopE mutant in vergelijking met de wild type stam.
Introduction
Type III secretie systemen zijn gespecialiseerd eiwit-exportmachines gebruikt door verschillende genera van Gram-negatieve bacteriën bacterieel gecodeerde effector eiwitten rechtstreeks te leveren in eukaryote doelcellen. Terwijl de secretie machinerie zelf is sterk geconserveerd zijn gespecialiseerde reeksen effector eiwitten ontstaan tussen de verschillende bacteriesoorten cellulaire signaalwegen te manipuleren en specifieke bacteriële virulentie strategieën 1 vergemakkelijken. Bij Yersinia, maximaal zeven effector eiwitten, zogenaamde YOPS (Yersinia buitenste eiwitten), translocatie bij gastheercel contact en samenwerken om immuun cel responsen zoals fagocytose en cytokineproductie, namelijk ondermijnen, op extracellulaire overleven van de bacteriën mogelijk 2-4. Het proces van translocatie wordt streng gecontroleerd in verschillende stadia 5. Er is vastgesteld dat de primaire activering van de T3SS wordt geactiveerd door het contact met het doel cell 6. De precieze mechanisme van deze initiatie moet nog worden opgehelderd. In Yersinia een tweede niveau van zogenoemde fine-tuning van translocatie wordt bereikt door omhoog of omlaag reguleren van activiteit van de cellulaire Rho GTP-bindende eiwitten Rac1 of RhoA. Activering van Rac1 bijvoorbeeld door invasine of cytotoxische necrotiserende factor Y (CNF-Y) leidt tot een verhoogde translocatie 7-9, terwijl de GAP (GTPase activerend eiwit) functie van de translocatie YopE down-reguleert Rac1 activiteit en bijgevolg vermindert translocatie door een negatieve feedback soort mechanisme 10,11.
Valide en nauwkeurige methoden zijn een voorwaarde om te onderzoeken hoe translocatie tijdens Yersinia gastheercel interactie wordt gereguleerd. Vele verschillende systemen zijn gebruikt voor dit doel, elk met specifieke voordelen en nadelen. Sommige benaderingen afhankelijk lysis van geïnfecteerde cellen maar geen bacteriën door verschillende detergentia, gevolgd door Western blotanalyse. The gemeenschappelijke nadeel van deze methode is dat kleine, maar onvermijdelijke bacteriële lysis mogelijk vervuilt het cellysaat met bacteriën-geassocieerde effector proteïnen. Echter, behandeling van cellen met proteinase K extracellulaire effector eiwitten en het daaropvolgende gebruik van digitonine voor selectieve lysis van de eukaryotische cellen afbreken voorgesteld om dit probleem te 12 minimaliseren. Belangrijk is dat deze assays mate afhangen van hoogwaardige anti-effector antilichamen, die meestal niet in de handel verkrijgbaar. Pogingen om translationele fusies van effector eiwitten en fluorescerende eiwitten gebruiken, zoals GFP translocatie controleren waren niet succesvol waarschijnlijk door de bolvormige tertiaire structuur van het fluorescente eiwitten en het onvermogen van de secretie inrichting om te ontvouwen voor afscheiding 13. Echter, verschillende reporter tags zoals de cya (calmoduline-afhankelijk adenylaatcyclase) domein van de pertussistoxine Bordetella cyclolysin 14 of de Flash-tag werden met succes gebruikt om translocatie te analyseren. In het eerste assay de enzymatische activiteit van cya wordt gebruikt om het signaal van de intracellulaire fusieproteïne amplificeren, terwijl de Flash tag, een korte tetracysteine (4Cys) motief tag, maakt labeling met biarsenical kleurstof Flash zonder het proces van secretie verstoren 15.
De hier toegepaste aanpak werd gerapporteerd voor het eerst Charpentier et al. En is gebaseerd op de intracellulaire omzetting van de Förster resonantie energieoverdracht (FRET) kleurstof CCF4 door translocatie effector TEM-1 beta-lactamase fusies 16 (Figuur 1A). CCF4 / AM is een cel-permeant verbinding waarbij een coumarine derivaat (donor) en een fluoresceïne-groep (acceptor) worden verbonden door een cefalosporine kern. Bij passieve binnenkomst in de eukaryote cel, wordt de niet-fluorescerende veresterde CCF4 / AM verbinding verwerkt door cellulaire esterasen tot de geladen en fluorescerende CCF4 en daardoor gevangenbinnen de cel. Excitatie van de cumarine eenheid bij 405 nm resulteert in FRET het fluoresceïne groep, die een groene fluorescentie uitzendt bij 530 nm. Na splitsing van het cefalosporine kern door beta-lactamase FRET wordt verstoord en excitatie van de cumarine eenheid leidt tot blauwe fluorescentie-emissie at460 nm. Verschillende toepassingen van deze werkwijze zijn beschreven in de literatuur benadrukken zijn veelzijdigheid. De werkwijze maakt analyse van translocatie in vitro en in in vivo, bijvoorbeeld, de techniek gebruikt in een muis infectie model om de leukocyt populaties gericht voor translocatie in vivo 17-19 identificeren. Uitlezen van signalen kan worden uitgevoerd met behulp plaatlezers, FACS-analyse of fluorescentiemicroscopie. Opmerkelijk is de werkwijze ook de mogelijkheid om te controleren translocatie in real-time door levende cellen microscopie gedurende het infectieproces 20,21. Hier werd laserscanning fluorescentiemicroscopie aangevraagd readout van fluorescentiesignalen omdat het hoogste gevoeligheid en nauwkeurigheid. Met name de mogelijkheid om het uittreevenster met nanometerprecisie in combinatie met high-detectoren vergemakkelijkt fluorescentiedetectie geoptimaliseerd en minimale overspraak te passen. Daarnaast kan deze microscoop setup worden aangepast voor real-time monitoring van translocatie en mogelijk maakt voor gelijktijdige analyse van gastheer-pathogeen interactie op het cellulaire niveau.
In deze studie translocatie tarieven van een Y. enterocolitica wild type stam en een YopE deletiemutant vertonen een hypertranslocator fenotype 10,11 werden voorbeeldig geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Peak Emissie en Cross-talk bepalen (zie ook figuur 2)
- Om de emissiepieken en de hoeveelheid overspraak tussen de donor (coumarine derivaat V450) en acceptor (fluoresceïne) kleurstoffen bepalen, voeren spectrale scan van cellen gemerkt met zowel individuele fluoroforen bij 405 nm excitatie.
- Bepaal een 10 nm bandbreedte de piek van elke kleurstof die wordt gebruikt voor de donor en acceptor kanalen (hier 455-465 nm en 525-535 nm). Plot van de genormaliseerde intensiteit over de golflengte en bereken het gemiddelde percentage van de cross-talk van de donor kleurstof in de acceptor kanaal en vice versa (figuur 2).
2. Bereiding van Y. enterocolitica stammen voor Cultuur van de Cel Infectie
- Gebruik de volgende stammen: WA-314 PMK-ova (WA-314 getransformeerd met de plasmiden PMK-bla 17 en PMK-ova 17, respectievelijk) en WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-314ΔYopE getransformeerd met het plasmide PMK-bla 17)
- Ten minste twee dagen voor de infectie streak Y. enterocolitica stammen WA-314 PMK-eicellen, WA-314 PMK-bla en WA-314ΔE PMK-bla van cryo voorraden op LB-agar platen met de vereiste antibiotica (kanamycine voor WA-314 PMK-bla en WA-314 PMK-eicellen ; kanamycine en tetracycline voor WA-314ΔE PMK-bla) en groeien O / N bij 27 ° C. Daarna houden de platen gedurende één week bij 4 ° C.
- Een dag voor de infectie enten 3 ml LB-medium bevattende de gewenste antibiotica met een kolonie van de respectievelijke stammen en geïncubeerd O / N bij 27 ° C in een schudinrichting bij 180 rpm.
- Op de dag van infectie inoculeren van 2 ml O / N kweek in 40 ml vers LB-medium zonder antibiotica en incubeer gedurende 90 minuten bij 37 ° C in een schudinrichting bij 180 opm om expressie van het type III secretiesysteem induceren.
- Breng de kweken in een geschikte buis houdt de kweken op ijs of bij 4 ° Cvanaf nu. Centrifugeer de kweken gedurende 10 minuten bij 5000 xg en 4 ° C.
- Resuspendeer de bacteriële pellet in 2-3 ml ijskoude PBS. Verdun de bacteriële suspensie tot een concentratie van 8 x 10 8 cfu / ml met behulp van een spectrofotometer. Bepaal de bijbehorende optische densiteit afzonderlijk. Bewaar deze schorsing op ijs tot het infecteren van de HeLa-cellen.
3. Plating HeLa-cellen
- Een dag voor de infectie zaad 1,5 x 10 4 cellen HeLa-cellen in 200 ul DMEM met 10% hitte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) in putjes van een 96 putjesplaat en cultiveren in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C. Seed drie putjes per stam (drie verschillende incubatietijden).
4. Infectie van HeLa-cellen en laden met CCF4
- Infect HeLa-cellen door het toevoegen van 3,5 ul van de bacteriële suspensie aan het medium en meng door voorzichtig pipetteren het medium tweemaal. Laat de bacteriën in het sediment opde cellen bij een MOI (rest van infectie) van ongeveer 100 bacteriën per cel. Voor een tijdsverloop beginnen infecties op -90 min, -60 min en -30 min en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator tot 0 min tot een gemeenschappelijk eindpunt te bereiken.
- Wanneer de incubatie is voltooid, zorgvuldig het medium te zuigen zonder het verwijderen van HeLa-cellen en voeg 50 pl PBS dat 20 ug / ml chlooramfenicol om expressie van effectors en 2,5 mM probenecid stoppen om export CCF4 verminderen.
- Op dat moment dragen de 96-wells plaat in de microscooptafel en definieert geschikte plekken voor latere analyse in elk putje. Eindig deze stap binnen 10 minuten (voor details van de overname zie rubriek 5.1).
- Per putje, voeg 70 pl CCF4 / AM-lading-oplossing (0,24 ul oplossing A, 1,2 pi oplossing B, 18,56 pi oplossing C (oplossing A, B en C die binnen CCF4 / AM loading kit) en 50 gl PBS (bevattende 20 gg / ml chlooramfenicol en 2,5 mM probenecid) een multi pipette en incubeer gedurende 5 min bij RT. Vanaf nu werken zonder onderbrekingen.
- Zuig het laden oplossing en voeg 100 pl PBS dat 20 ug / ml chlooramfenicol en 2,5 mM probenecid een multi pipet. Vervolgens snel overdracht van de 96 goed plaat in de microscoop podium en beginnen overname binnen 10 min van aspiratie van de laad-oplossing.
5. laser scanning microscopie en analyseren van gegevens
- Beeldacquisitie
- Stel de beeldvormende omstandigheden in een manier om de totaaltelling foton maximaliseren en minimaliseren fototoxiciteit, fotobleken en cross-excitatie.
- In een moderne confocale laser scanning microscoop, gebruik dan een 20X hoge numerieke lensopening immersie objectief, opent de detector pinhole tot 2,5 Airy-eenheden (dwz breed optische sectie), kiest u een hoge gevoeligheid GaAsP-detectoren met gelijktijdig actief donor en acceptor kanalen, 8 bit diepte , ~ 750 nm pixelgrootte, 3-voudig kader middeling en Excite met 10% van een 405 nm diodelaser.
- Om correcte kwantificatie stel de detector versterking van beide kanalen dezelfde waarde en alle verzadigde pixels voorkomen.
Opmerking: Hier werden de winsten ingesteld op 150%.
- Zorg continue onderdompeling door het verspreiden dompelmedium naar de bodem van de putjes, bijvoorbeeld met een injectiespuit 1 ml en opsluiten van luchtbellen te vermijden.
- Activeert het doorgelaten licht en het vinden van een vertegenwoordiger gezichtsveld in elk goed. Gebruik een geijkt automatische fase en markeer de positie in de software.
- Na verwijdering van de plaat voor kleuring (zie paragraaf 4.3), plaatst u de plaat en voeg een gewicht op de top te focale drift te voorkomen. Bekijk de opgeslagen positie met de laser scanning modus en de focus en laterale positie aan te passen goed.
- Stel de tijdspanne tot 2 min, de duur tot 2 uur en beginnen met acquisitie.
- Stel de beeldvormende omstandigheden in een manier om de totaaltelling foton maximaliseren en minimaliseren fototoxiciteit, fotobleken en cross-excitatie.
- Afbeelding kwantificering (voorbeelden worden gegeven voor Bitplane Softwzijn zoals Imaris)
- Importeer de dataset in software die rekenkundige bewerkingen van pixel matrices mogelijk maakt. Doe dit door te slepen en het bronbestand die zowel de donor en de acceptor-kanaal op de software-icoon.
- Trek de achtergrond in beide kanalen met dezelfde offset. Om dit te doen, klikt u op Menu en vervolgens op Afbeelding> Verwerking> Baseline aftrekken. Selecteer elk kanaal en voer de basislijn waarde.
- Corrigeer de doorbloeding van de donor kanaal (kanaal 1) in de acceptor kanaal (CH2) met de vooraf bepaalde correctiefactor f (zie 1.1), het creëren van een nieuw kanaal:
Ch2 '= CH2 - Ch1 * f
OPMERKING: Een doorbloeding van de acceptor in de donor kanaal was niet aantoonbaar over het niveau van lawaai.- Klik op Menu> Beeldverwerking> Channel Arithmetics en voer abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Daarna verwijderen Kanaal 2 door te klikken op Menu> Bewerken> Kanalen Verwijderen. Zorg ervoor dat debloeden-through gecorrigeerd acceptor-kanaal blijft de nieuwe Channel 2. Optioneel: Wijzig het kanaal kleur van grijs naar de oorspronkelijke kleur door te gaan naar Menu> Bewerken> Eigenschappen afbeelding. Selecteer Channel 4> Toegewezen Kleur> Base Kleur en verander het naar bv, groen.
- Maak een nieuw kanaal met de volgende bewerking om de relatieve FRET coëfficiënt te bepalen:
Ch3 Ch2 = '/ (K1 + Ch2')- Ga naar Menu> Beeldverwerking> Channel Arithmetics en voer ch2 ./ (ch1 + CH2)
- Voor een goede visualisatie van de FRET-kanaal in een afbeelding met 8 bits, maakt een vierde kanaal:
CH4 = 255 * Ch3- Ga naar Menu> Beeldverwerking> Channel Arithmetics en voer 255 * ch3. Verander het kanaal kleur door te gaan naar Menu> Bewerken> Eigenschappen afbeelding. Selecteer Channel 4> Toegewezen Kleur> Kleur Tabel Bestand> Jet.
- Pas een 3x3 mediaan filter om kanalen Ch3 en CH4 that zal de ruis in het beeld te verminderen. Om dit te doen, klikt u op Menu> Beeldverwerking> Smoothing> Median Filter. Selecteer beide kanalen en het toepassen van een filter grootte "3x3x1".
- Voor kwantificering van cellulaire signalen, detecteert de cellen in Ch4 door juiste instelling van de offset en filteren de structuren grootte te klein structuren uitsluit.
- Selecteer de Surpass bekijken en klik op het icoon "Voeg nieuwe Surfaces". Definieer de algoritme parameters in de Surface venster. Voor een snellere verwerking, het activeren van de twee vakjes "Segment slechts een regio van belang" en "Process hele Image eindelijk". Definiëren de regio van belang door zijn afmetingen te bewerken.
- Selecteer Channel 4 als de bron kanaal en stel de drempel door Thresholding> Achtergrond aftrekken (Local Contrast) en ingesteld met een diameter tot 10 urn. Stel de minimale intensiteit drempel handmatig op 0 en de maximale drempel om de maximale intensiveringty. Filter de structuren per gebied en zet de minimale waarde tot bijvoorbeeld 187 μm². Eindig het oppervlak detectie.
- Pak de gemiddelde waarden voor de donor fluorescentie-intensiteit (H1) en relatieve FRET-coëfficiënt (Ch3) en hun standaarddeviaties in de cellulaire entiteit. Om dit te doen, ga dan naar de oppervlakte-eigenschappen. Verander het uiterlijk van de structuren door het selecteren van Surfaces Style / Kwaliteit> Surface. Selecteer alle structuren door te klikken op de tab filters. Verenigen de gedetecteerde structuren door te gaan naar Proces Selection> Unify. Het oppervlak statistieken naar MS Excel exporteren door te klikken op het tabblad statistieken> Exporteer alle statistieken naar bestand.
- Plot van deze waarden in de tijd. Identificeer de 10 minuten interval van de maximale helling van de donor kanaal fluorescentie verhoging voor elke conditie als een redelijke parameter om het bedrag van translocatie effector vertegenwoordigen. Bereken de helling als m = Δ donor fluorescentie-intensiteit / Δ tijd (min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het vermogen van de beschreven werkwijze demonstreren kwantitatief analyseren effector translocatie in doelcellen, werden twee verschillende stammen Yersinia translocatie kinetiek bestudeerd: Y. enterocolitica wild type stam WA-314 (serogroep O8, herbergt de virulentie plasmide pYVO8 22) en zijn afgeleide WA-314ΔYopE (WA-314 herbergen pYVO8ΔYopE 23). Eerder werk toonde aan dat Y. enterocolitica mutanten ontbreekt functionele YopE vertonen een significant hogere Yop translocatie tarief 10. Beide stammen werden getransformeerd met vectoren die coderen voor fusies van de N-terminale secretiesignaal van YopE en TEM-1 beta-lactamase (PMK-bla) 17. WA-314 werd tevens getransformeerd met een vector coderend voor een fusie respectievelijke YopE ovalbumine (PMK-ova 17) om te dienen als een negatieve controle. Incubatietijden van 30, 60 en 90 min werden om de method`s effectieve bereik verder beoordelen toegepastnd geschiktheid voor kwantificering. Twee verschillende uitlezingen werden gebruikt voor gegevensanalyse: donor fluorescentie (kanaal 1) en relatieve FRET coëfficiënten (Ch3 Ch2 = '/ (K1 + Ch2)) (figuur 1B en 1C).
Voor de negatieve controle stam WA-314-PMK-eicellen plotten van donor kanaal intensiteiten (K1) in de tijd vertoont geen stijging van de fluorescentie-emissie, ongeacht de incubatietijd (Figuur 1B). In tegenstelling, in de WA-314-PMK-bla geïnfecteerde cellen een toename van de fluorescentie-intensiteit in de tijd werd ontdekt waaruit de aanwezigheid van YopE beta-lactamase fusie in het doel cel cytoplasma. Zoals verwacht de maximale helling van fluorescentie-intensiteit is positief gecorreleerd met de lengte van de infectie (30 min infectie: 0,10 / min, 60 min infectie: 0,33 / min, 90 min infectie: 0,76 / min) dat aangeeft dat verschillende concentraties van translocatie beta- lactamase worden onderscheiden. In overeenstemming met eerdere studies WA-314ΔYopE-PMK-bla geïnfecteerde cellen vertonen een snellere toename van fluorescentie-intensiteit in vergelijking met de wild type stam (30 min infectie: 1,28 / min, 60 min infectie: 1,53 / min, 90 min infectie: 1,41 / min). Interessant uitbreiding infectie 90 min niet verder versnellen de opkomst van donor fluorescentie vergeleken met 60 min infectie (figuur 1B). Deze bevinding kan waarschijnlijk worden verklaard door de geleidelijke cytotoxische effect uitgeoefend door WA-314ΔYopE-PMK-bla, die ofwel kan remmen efficiënte translocatie na 60 min infectie of leiden tot verlies van fluorescentie kleurstoffen als gevolg van verstoring van de plasmamembraan integriteit. De met de relatieve FRET coëfficiënt (CH3) analyseresultaten zijn in goede overeenstemming met de door de donor zender alleen resultaten. In sommige omstandigheden (WA-314ΔYopE-PMK-bla, 60 en 90 min infectie) die zeer grote hoeveelheden translocatie beta-lactamase fusie uiteraard de CCF4 substraat wasvoortdurend verwerkt voordat beeldvorming kan worden gestart. Deze voorwaarden zou niet toestaan dat voor de berekening van een redelijke maximale negatieve helling omdat het betreffende deel van de curve wordt gemist in deze data representatie (figuur 1C). Beelden van de relatieve FRET coëfficiënt kanaal bieden de mogelijkheid om te vergelijken verschillen tussen individuele cellen (figuur 1D).
Figuur 1. Kwantitatieve analyse van effector translocatie van TEM-1 YopE fusies in Y. enterocolitica. (A) Hydrolyse van CCF4 substraat door translocatie TEM-1 beta-lactamase werd gevolgd door laser scanning microscopie. Excitatie bij 405 nm geleid groen fluorescentie-emissie (530 nm) van het intact substraat en blauwe fluorescentie-emissie (460 nm) van het gesplitste hydrolyse product (cumarine). (B, C) Microscopie gegevens werden kwantitatief geanalyseerd door het uitzetten van de donor kanaal intensiteit (K1) of de berekening en plotten van de relatieve FRET coëfficiënten (Ch3 Ch2 = '/ (K1 + Ch2')). De gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. (D) afgebeeld microfoto (FRET kanaal) werden genomen van representatieve films op de aangegeven tijdstippen. WA-314ΔE PMK-bla-geïnfecteerde cellen vertonen een snellere afname van de relatieve FRET coëfficiënten in vergelijking met het wild type WA-314-PMK-bla (60 min infectie). Schaal bar, 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Cross-talk bepaling van de fluoroforen V450 en FITC.De spectra beide afzonderlijke fluoroforen werd gemeten met de confocale microscoop. Bloeden-through van de donor V450 in de acceptor kanaal binnen de 525-535 nm detector range werd berekend uit een lineaire regressie (insert). Het gemiddelde percentage van overspraak berekend uit twee metingen gelijk aan 0,33. Bloeden-through van de acceptor FITC in de donor kanaal (455-465 nm) was niet aantoonbaar over het niveau van lawaai. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hier succes toegepast een TEM-1 beta-lactamase reporter gebaseerde test voor de kwantitatieve analyse van effector translocatie door Y. enterocolitica. Vele andere variaties van deze gevoelige, specifieke en relatief eenvoudige techniek zijn beschreven in de literatuur. In deze studie werd laser scanning microscopie uitgevoerd voor de meest gevoelige en nauwkeurige detectie van fluorescentiesignalen. Specifiek de correctie voor overspraak tussen de donor en acceptor kleurstoffen en de individueel instelbare detectie bandbreedtes zorgen voor superieure nauwkeurigheid van de meting ten opzichte van andere varianten van de werkwijze. De resultaten tonen duidelijk dat de werkwijze kan kwantitatief analyseren translocatie. Verschillende incubatietijden die verschillende concentraties van intracellulaire beta-lactamase werden positief gecorreleerd met de helling van de donor fluorescentie-intensiteit. Ook een significant hogere translocatie koers van de WA-314ΔYopE vergelijkingde wild type stam WA-314 kon worden aangetoond.
Twee alternatieve mogelijkheden voor data-analyse werden toegepast: Donor kanaal intensiteiten en relatieve FRET coëfficiënten. Het voordeel van de donor kanaal dat het direct vertegenwoordigt de accumulatie van een CCF-4 hydrolyseproduct (cumarine). Deze aanpak kan in een microscopisch opstelling, omdat anders dan in een plaatlezer correctie voor verschillen in celdichtheden met een verhouding donor / acceptor niet noodzakelijk. Echter, de export van de CCF4 kleurstof of de hydrolyse producten is nog steeds een mogelijke verstorende factor in deze aanpak. Dit nadeel kan worden ondervangen door de relatieve FRET coëfficiënt.
In de beschreven opstelling experimenten werden uitgevoerd in 96 well platen. Dit formaat maakt het mogelijk voor het testen van meerdere omstandigheden in een enkel experiment en helpt om dure chemicaliën (specifiek CCF4 / AM laden kit) te redden. In de beschreven workflow is het essentieel om im te beginnenleeftijd verwerving op een bepaalde tijdstip kort na toevoeging van de CCF4 / AM beladingsoplossing vanwege hydrolyse van CCF4 door de translocatie beta-lactamase begint meteen. In het geval van de verwerking van vele omstandigheden in een keer, kan aanpassing van de focus en de laterale positie (stap 5.1.4) te lang duren en belemmeren een tijdige start van het beeld acquisitie. Daarom is het maximum aantal parallelle monsters moet individueel bepaald.
Een van de belangrijkste problemen met deze methode was de aanzienlijke uitvoer van CCF4 substraat door de HeLa-cellen bij 37 ° C. Dit verschijnsel kan onvoldoende worden tegengegaan door behandeling van de cellen met probenecide. Daarom hebben wij, in plaats van op translocatie tijdens het lopende infectie zoals hierboven beschreven, eerst volledig infectie en daarna laden van de cellen met het CCF4 / AM kleurstof. Met deze benadering is het mogelijk de verwerking van het substraat CCF4 bij KT controleren. Onder deze omstandigheden reduCED export van CCF4 werd waargenomen. Het bedrag van de export van CCF4 substraat lijkt cellijn specifiek te zijn; de hier beschreven configuratie zorgt voor een betrouwbare analyse van translocatie ook cellijnen, die sterk uitvoeren CCF4 bij 37 ° C.
Export van CCF4 geen probleem in sommige andere cellijnen waardoor de microscopie setup vast controle op de processen van infectie en translocatie gelijktijdig in real-time. Dit geeft de mogelijkheid om translocatie in individuele cellen te analyseren en kunnen worden gebruikt om translocatie specifieke gebeurtenissen gastheercel interactie zoals bacteriële adhesie of vorming van micro-kolonies 20 correleren. Daarom is deze test is een waardevol instrument aan de opheldering van de mechanismen hoe translocatie in het samenspel van bacteriën en gastheercellen wordt geregeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
