Introduction
Oppdraget av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID) Integrated Research Facility ved Fort Detrick i Frederick MD (IRF-Frederick) er å utføre nye smittsomme sykdommer forskning for å forstå de kliniske sykdomsprosesser som korrelerer med alvorlighetsgraden av mikrobiell indusert sykdom. IRF-Fredrik har en unik evne til å utføre medisinsk bildebehandling i dyremodeller av høy konsekvens patogener i en ABSL-4 laboratorium 1. De bildediagnostikk tilgjengelig for etterforskerne er: computertomografi (CT), magnetisk resonans imaging (MRI), positronemisjonstomografi (PET), singel foton computertomografi (SPECT), ultralyd, røntgen og gjennomlysning. Forskere bruker tilgjengelige imaging evner å overvåke sykdomsutvikling og evaluere effekten av tiltak, som medikamentell behandling og vaksinering, i longitudinelle studier.
De bildediagnostikk på IRF-Fredrik var spesieltutformet for å holde de viktigste komponentene i utstyret utsiden av høy containment 2,3 og tilgjengelig for vedlikehold og reparasjon. Denne utformingen skiller bilde suite i "hot" (som inneholder patogen) og "den kalde siden." For å oppnå denne separasjon, var spesielt konstruert rør konstruert for å strekke seg med høy inneslutnings plass inn i boringene i hver avbildingsmodalitet (figur 1). I tillegg til å gi biologisk inneslutning, disse rørene beskytte tenkelig utstyr fra gasser og kjemikalier som brukes til å rense høy containment laboratorium. Imaging forskere og teknologer operere skannerne fra "kalde siden" mens komparativ medisin (CM) ansatte håndtak og overvåke dyr på "varme siden". Siden CM ansatte må jobbe tett med bilde forskere å koordinere disse eksperimentene, kan dette skillet medføre kommunikasjonsutfordringer.
Etter å ha vurdert alternativer tilgjengelig, CM ansatte var uteutstyrt med Bluetooth ørepropper som sender korte bølgelengde ultra høyfrekvente radiobølger til telefoner som brukes til å ringe bilde ansatte utenfor containment. På grunn av utformingen av anlegget, trådløse tilgangspunkter måtte bli installert i hvert av rommene for å overvinne signal-forstyrrelser forårsaket av lagene av sement og stål mellom de "varme" og "kalde sider". Dermed er kommunikasjon mellom CM ansatte iført støyende positivt trykk dresser og bildebehandling ansatte utenfor high-containment nå pålitelig. Kameraer har også blitt installert på den varme siden av imaging rom for avbildning personalet å se aktivitet på "varme siden". Med kameraene, kan bilde ansatte veilede CM teknikere med dyr posisjonering eller noen siste minutt endringer i bildeprotokollen.
Alt arbeid i IRF-Fredrik ABSL-fire suit laboratorium krever ansatte å bære positivt trykk innkapsle drakter 4. Iført disse draktene reduserer mobilitet, og den tunge sentx hansker festet til drakten pluss opptil tre ekstra lag med hansker kompromisser fingerferdighet. Resultatet er at prosedyrer ta lenger tid å fullføre, og oppgaver som krever motoriske ferdigheter er mye vanskeligere. Som biosikkerhet nivå øker, dyr håndtering og manipulasjoner blir mer krevende og tidkrevende, særlig med små dyr. Prosedyrer i en ABSL-4 laboratorium kan ta opptil 2-3 ganger lenger enn en ABSL-2 laboratorium.
Hensikten med denne artikkelen er å visuelt demonstrere utfordringene knyttet til bildebehandling dyremodeller i en ABSL-fire miljøet ved hjelp av CT-skanning av et marsvin som et eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følges disse dyr omsorg retningslinjer. Dyrene ble plassert i et anlegg akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, Seksjon for klinisk forskning, Animal Care og bruk komité og var i samsvar med dyrevernloven bestemmelser, Public Health Service-erklæring, og Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr anbefalinger.
1. Forbered CT skanner (på "Cold Side")
- Tilstand X-Ray Tube
- Kontroller at ingen medarbeider er i skanne rom og motivet tabellen er tom.
- Kjør røret condition prosedyren i samsvar med skanneren produsentens spesifikasjoner.
- Utfør Air Kalibrering
- Pass på at ingen gjenstander er i skanne feltet. Utfør luften kalibreringsprosedyre i samsvar med skanneren produsentens spesifikasjoner. På mange plattformer, er denne kalibreringen automatisk eller halvautomatisk.
- Utfør Quality Control Scan (på "Hot Side")
- Fullføre ABSL-4 drakt laboratorieprosedyrer inngangs (beskrevet i detalj med henvisning 5) med tillegg av et ekstra trinn. Hvis prosedyrer medføre eksponering for radioaktivt materiale, klipp en dosimeter til Scrubs under beskyttelsesdrakt. Slå på dosimeter hver 2 måneder for beregning av stråling.
- Plasser CT hode og kropp stiplede linjer, som er laget av luft, vann og Teflon, i den aktuelle holderen på skanne bordet.
- Utfør Quality Control Scan (på "Cold Side")
- Fra den kalde siden, fremme fantom inn i midten av boringen 6.
- Erverve en skanning ved hjelp av laboratorie standardisert kvalitetskontroll (QC) parametre til ensure skanneren er innenfor produsentens spesifikasjoner.
- Utfør QC datastyrt analyse av bilder for å beregne gjennomsnitt og standardavvik av signalintensitet innenfor områder av interesse sentrert over hver materialtype (luft, vann eller teflon) i henhold til produsentens protokoll.
- Varsle CM ansatte at CT-skanner er klar til bruk.
- Kontroller dyret informasjon (identifikasjonsnummer, vekt, fødselsdato) med CM ansatte.
- Registrer Subject Information inn pasientdatabasen.
- Ved CT-skanner konsollen (på den "kalde siden"), tilgang til skannerens radiologisk informasjonssystem (RIS). Sjekk at RIS er befolket med detaljer om skanning planen.
- Velg gjeldende emnet og demografi som identifikasjonsnummer, alder, fødselsdato, og eksamensdato; da bør den undersøkelsestypen automatisk fylle.
- skriv gjenstand vekt manuelt.
- Velg riktig subject orientering i CT gantry (f.eks hodet først, føtter første, utsatt, liggende).
2. Forbered Arbeidsområder i ABSL-4 Suit Laboratory
- Klargjør klasse II biosikkerhet kabinett (BSC) eller downdraft Tabell i Animal Prosedyre Room. Slå på BSC (eller downdraft Table) i minst 10 min før bruk.
- Ren og desinfisere indre overflater av BSC eller den øvre overflate av downdraft bordet ved hjelp av en godkjent desinfeksjonsmiddel, for eksempel 5% dual kvaternært ammonium (n-alkyl-dimetyl-benzyl ammoniumklorid, n-alkyl-dimetyl-etyl-benzyl-ammoniumklorid) desinfiserende løsning. Spray indre overflater av nevnte BSC eller den øvre overflate av downdraft bordet og tørke overflatene tørr etter 10 minutters kontakttid. Spray og tørk flater med 70% etanol for å fjerne rester av desinfeksjonsmiddel.
- Place utstyr og forsyninger som trengs i BSC eller downdraft tabellen, inkludert anestesi induksjon boksen og dyrehåndtering hansker. ol>
- Klargjør CT skanneren.
- Oppsett dyret festeanordningen på CT sengen.
- Oppsett vitale tegn overvåke for å oppdage hjertefrekvens og oksygenmetning. Hvis skanningen økten er lengre enn 10 min, overvåke temperaturen.
- Forbered Anestesi Machine.
- Sjekk isofluran volum i vaporizer og legge mer isofluran ved behov.
- Utfør en lekkasjetest ved trykksetting av bedøvelse pustekretsen med oksygen, se etter rømt gass, og visuelt inspisere anestesiapparatet for lekkasjer 1.
- Hvis det oppdages en lekkasje, finne kilden, løse problemet, og utfører en oppfølging lekkasjetest for å verifisere korreksjoner ble riktig implementert.
- Vei disponibel spylebeholderen som fanger avfall bedøvende gass. Hvis beholderen er ≥50 g over startvekt på beholderen, erstatte beholderen 7.
- Overfør Cage Housing Guinea Pig fra en av gnagere Holding rom ved siden av Imaging Suite inn i klasse II BSC.
- Kontroller dyret ID.
- Fjerne buret kort og holder med dyret.
- Åpne lokket til buret og don dyrebeskyttelsesskinnhansker i løpet av de positive trykk dress hansker. Forsiktig plukke opp marsvinet, plasserer dyr i anestesi induksjon boksen, og dekke boks med lokk.
- Ta av anestesi induksjon boksen som inneholder dyret fra klasse II BSC og plassere den på en transportvogn.
- Ved hjelp av vognen, ta dyret til CT-skanner rommet.
- I CT-skanner rommet, umiddelbart koble spylebeholderen og anestesi maskinen til induksjon boksen. Slå på oksygen gass til induksjon boksen og sette fordamper til deliver 4% isofluran for første induksjon av anestesi 8.
- Overvåk dyret under anestesi induksjon for tilstrekkelig dybde av anestesi (f.eks reagerer på ytre stimuli, muskuløs tone, stabile luft og hjertefrekvens) 8.
- Slå av anestesi til induksjon boksen når marsvinet er fullt bedøvet.
4. Ordne Subject på Imaging Seng i CT-skanner (på "Hot side")
- Fjern bedøvet marsvin fra Induksjon Box og Plasser på Imaging Bed.
- Plasser marsvin på driftsenheten pute i en utsatt posisjon.
- Påfør ophthalmic salve på begge øynene for å beskytte cornealepitelets tørker ut.
- Administrere vedlikehold isoflurananestesi.
- Plasser den nesekonus på marsvin og slå på gass for å gi en l / min oksygen til nesekonusen 8.
- Sett vaporizer å levere 2-3% avisofluran til marsvin gjennom nesepartiet.
- Når emnet har nådd den ønskede planet av anestesi (ingen bevegelse, ~ 60 pust per minutt), reduserer den fordamper innstillingen til å levere 1,0-1,5% av isofluran for opprettholdelse av anestesi.
- Overvåke vitale tegn inkludert kroppstemperatur, puls og respirasjonsfrekvens. Hvis respirasjonsfrekvens begynner å akselerere eller bremse ned, øke eller redusere prosent av isofluran, henholdsvis 9.
- Tilveiebringe en ytterligere varmekilde for å opprettholde marsvin kroppstemperatur mellom 37 og 39 ° C, om nødvendig, avhengig av den forventede lengde av datainnsamling og anestesidybde opprettholdt 8,9.
- Sikre et plastdeksel over toppen av driftsenheten pute.
- Advance bildebehandling sengen i containment tube.
5. Stille Bilde synsfelts
- Aktivere lasersystemet (avbildning personale) på den "kalde side" av CT scAnner plass til å plassere marsvin for CT skanning. Bruk tabellen "i" og "ut" for å dekke anatomien av interesse under laserkrysset.
- Slik stiller synsfeltet, bruker laser for å angi startpunktet over anatomien av interesse.
- Kontakt CM ansatte på "varme siden" for å plassere en bly skjold mellom seg selv og CT-skanner.
6. hente bilder
- Erverve undersøkelse scan for skive plassering for CT studie bilder i henhold til produsentens protokoll.
- Fore skive plassering for CT studie bilder på undersøkelsen bilder.
- Koordinere med "hot-side" personell hvis kontrast injeksjonen skal anvendes.
- Acquire studie scan henhold til produsentens protokoll.
- Rekonstruere CT-bilder på skanneren konsollen i henhold til produsentens protokoll.
- Send bilder til et bilde arkivering og kommunikasjonssystem. Utfør ytterligere kvalitative og quantitative analyser fra denne arkiveringssystem i henhold til produsentens protokoll.
7. Post-scan Recovery
- Overfør marsvin fra skanneren til et rent mikroisolatorbur bur med mat og godbiter.
- Ved hjelp av vognen, transportere bur med dyr tilbake til huset sitt område.
- Overvåk dyret til den er helt restituert fra anestesi.
- Når du er fullt restituert, tilbake i buret til høy effektivitet partikkelfilter luft (HEPA) -filtrerte ventilerte racks.
8. Desinfeksjon av Scanner Bay og utstyr
- Desinfiser skanneren bay området (f.eks overflater som var i direkte kontakt med dyr, skanneren, skanner gulvet, dørhåndtak) med en 5% dual kvartære ammonium løsning for en kontakttid på 10 min.
- Skylling flater med en 70% etanoloppløsning etter en 10 min eksponering for dual kvaternært ammonium-løsning.
- Tørk elementer som ikke kan sprøytes direktemed dobbel kvaternært ammonium-løsning (følsomt elektronisk utstyr) med en dual-kvartært-ammonium-mettet stoff etterfulgt av et etanolmettet klut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Streng overholdelse av alle sikkerhetsprosedyrer og standard operasjonsprosedyrer for dyr behandling er avgjørende for å arbeide trygt i en ABSL-4 laboratorium. Overføring av infiserte dyr i induksjons boksen fra dyret prosedyre rommet til bildebehandling suite minimerer risikoen for forurensing av vanlige korridorer. Ved å følge de prosedyrer som kreves, har ingen laboratorieinfeksjoner eller krysskontaminering av dyr fag er registrert mens drive ABSL-fire forskning på IRF-Frederick.
ABSL-4 viruspatogener kan indusere lungerelaterte sykdommer 10,11, og CT er et verdifullt verktøy for å overvåke sykdomsutvikling i dyremodeller av infeksjon. CT-bildene er opprettet fra absorpsjonen av røntgenstråling inn i vev, og bildebehandling eksperimenter kan utføres forholdsvis raskt, noe som reduserer mengden av anestesi nødvendig. I CT, jo større tetthty av objektet fotografert, slik som bein, jo lysere objektet vises (figur 2). Tettheten av organ vev har en tendens til å være av middels intensitet (grå), mens luftfylte vev slik som friske lunger, svart. CT kjøper flere røntgenbilder over en 360 graders utsikt som er bygd om til en 3-dimensjonal visning av kroppen. For større skille mellom organer og smittsomme sykdomsrelaterte sykdommer, kan intravenøse kontrastmidler brukes.
Figur 1:. Høy containment utformingen av bildediagnostikk på IRF-Frederick Denne utformingen skiller bilde suite inn i "varme" og "kalde" sider. Spesialdesignet rør forlenge høy containment plass av "varme siden" inn i boringene i hvert skanneren på "kalde siden". Imaging forskere og teknologer operere skannerne fra4;. Kalde siden "mens komparativ medisin (CM) ansatte håndtak og overvåke dyr på" varme siden " Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. CT-bilde av overkroppen av en marsvin X-ray absorpsjon er større i bein, derfor bein (A) vises este i bildet, og luft (B, lungevev) vises mørkeste, og bløtvev (C: hjerte, D: leveren). vises middels i kontrast (A) BSL-4 viruspatogener indusere lungerelaterte patologi, noe som gjør CT et verdifullt verktøy for å overvåke sykdomsutvikling i dyremodeller av infeksjon Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere artikler i denne serien har understreket omfattende opplæring, oppmerksomhet på detaljer, sikkerhetsprosedyrer, og ytterligere tekniske kontroller som kreves for å arbeide trygt i maksimalt containment laboratorium 12,13. Utføre arbeid trygt er det aller viktigste i disse laboratoriene. Denne filosofien er enda viktigere når man jobber med levende dyr på grunn av flere farer som potensialet for infiserte dyr til å påføre biter eller riper eller for å generere aerosoler 7. Disse prosedyrene understreke sikker håndtering og transport av dyr fra venterommet til bilde rom. Animal manipulasjoner og overvåkning under anestesi er vist å gi betrakteren en realistisk skildring av oppmerksomhet på detaljer og sikkerhetsmessige hensyn er nødvendig mens du arbeider i en ABSL-4 laboratorium.
Vi beskriver en protokoll for å utføre ikke-invasiv medisinsk bildebehandling i en ABSL-4 laboratorium ved hjelp av en CT-scan av et marsvinsom et eksempel. Flere trinn er avgjørende for en vellykket bildebehandling i BSL-4 laboratorium. Den første kritiske trinnet omfatter verifisere at sikkerhetssjekklister er gjennomført for å sikre at alle sikkerhetssystemer fungerer som de skal før innreise til lab 5. Personalet må følge skikkelig Åpnings- og avslutningsprosedyrer for å sikre at de fungerer sikkert i BSL-4 laboratorium. Den andre kritiske trinnet er å kontrollere at ansatte er enten ikke finnes i søket rommet eller de er bak en Bærbare bly skjold under condition av røntgenrøret og eventuelle påfølgende skanninger. Det er viktig å fastslå at CT-skanner er klar og fungerer før bedøvelse og forberede dyr for bildebehandling. Det neste viktige skritt er å utføre en kvalitetskontroll scan med en passende fantom og varsle røktere når CT-skanner er operativ og klar til bruk. Klar og effektiv kommunikasjon er også viktig å utføre bildebehandling protokoller som dyr håndtering ansatte er fysisk separrerte fra bilde teknologer som opererer skannerne på "kalde siden".
Røntgen i en BSL-4 laboratorium er en utfordrende prosedyre som alle dyr håndteringsprosedyrer må gjøres mens iført overtrykk dress og flere par hansker, inkludert tunge dress hansker. Grunnleggende dyr håndteringsprosedyrer er endret for å passe de sikkerhetsmessige betraktninger av BSL-4 laboratorium. Håndtering av våken dyr er minimert og modifisert for å redusere sjansene for å biter eller riper. For eksempel, lær arbeidshansker er slitt for å beskytte dress hansker når du plukker opp våken marsvin og andre større gnagere. Mus behandlet bare med pinsett og må bedøves først før scruffing dem for intraperitoneale injeksjoner. Injeksjonsteknikker kan måtte modifiseres for å sikre en høyere grad av sikkerhet. Tang og / eller tilbakeholdenhet enheter brukes til å utføre injeksjoner i gnagere heller enn å bruke hånden holdenhet alene. Kompleksiteten og tiden det tar å perform bildebehandling avhenger av flere faktorer, blant annet modalitet valgt og de artene som brukes. Begrensninger i å utføre CT inkluderer vanskeligheter med å administrere kontrastmidler til enkelte laboratorium dyrearter. Marsvin, i særdeleshet, har ikke lett tilgjengelige vener for administrering av et kontrastmiddel intravenøst. Vanskeligheter med denne administrasjonen er forsterket av vanskelighetene med finmotorikk manipulasjon mens iført personlig verneutstyr. I tillegg må tidspunktet for agenten injeksjoner kontrast koordineres med personalet på de "kalde siden" som opererer skanneren.
Den unike designen på bilde anlegget skaper utfordringer som krever modifikasjoner av bildeteknikker. En utfordring var problemer med kommunikasjon på grunn av fysisk separasjon av bildebehandlings teknologer som kjører skanning utstyr og røktere håndtering og overvåking dyrene. Bluetooth-telefoner med hodesett slitt innidrakt brukes til å kommunisere med bildebehandlings teknologer for å koordinere og utføre skanninger. Hvis denne kommunikasjonen metoden mislykkes, kan håndskrevet melding på hvite tavler vises gjennom laboratorie vinduer. Utformingen av hver avbildningsfunksjonalitet innbefatter en spesiell rør som strekker seg høyt oppdemning innretningen inn i boringen i hvert skanner. Etter hvert bilde gjenstand er plassert på en avbildning seng, fagene er en større avstand fra og mindre synlig for teknikere som overvåker dem mens under anestesi. Lengre anestesi kretser, overvåking kabler og infusjonslinjene er nødvendig i denne design.
IRF-Fredrik har evnen til å utføre biomedisinsk avbildning i en rekke forskjellige forsøksdyr fra mus til humane primater. CT kan brukes til å overvåke sykdomsprogresjon i en rekke dyremodeller av infeksjonssykdommer. Evaluere effekten av potensielle terapeutiske intervensjoner, inkludert vaksiner, og identifisere biomarkører for diseaSE prosesser er fremtidige anvendelser av denne teknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| CT scanner | Philips Healthcare | ||
| CT phantom | Philips Healthcare | ||
| Isovue-300 (CT contrast reagent) | Bracco Diagnostics | NDC 0270-1315-30 | |
| Ventilated rack | Lab Products | ||
| Micro-isolator cage | Lab Products | ||
| Biosafety cabinet | Nuaire | ||
| Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
| Anesthesia induction box | VetEquip | ||
| Anesthesia mask | Henry Schein | ||
| Isoflurane | Henry Schein | ||
| Waste gas scavenging canister | Fisher | F/AIR | |
| Holding cushion | |||
| Ophthalmic ointment | |||
| Vital signs monitor | Bionet | BM3Vet | |
| Mobile phone | Spectralink | 8440 | |
| Blue Tooth ear piece | |||
| Wireless access points | |||
| Sperian positive-pressure suit | Honeywell Safety Products | BSL 4-2 | |
| Outer suit gloves (latex, Ansell Canners and Handlers) | Fisher | 19-019-601 | |
| Outer suit gloves (nitrile/rubber, MAPA) | Fisher | 2MYU1 | |
| Scrubs | Cintas | 60975/60976 | |
| Socks | Cintas | 944 | |
| Duct tape | Pack-N-Tape | 51131069695 | |
| Towels | Cintas | 2720 | |
| Zip lube | Amazon | B000GKBEJA |
References
- Jahrling, P. B., et al. The NIAID Integrated Research Facility at Frederick, Maryland: a unique international resource to facilitate medical countermeasure development for BSL-4 pathogens. Pathog Dis. , (2014).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T. , Springer-Verlag. New York, NY. (2014).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th, U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. . Accessed Sept. 4, 2014 (2009) http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/. (2009).
- Janosko, K., et al. Safety precautions and operating procedures in an (A)BSL-4 laboratory: 1. Laboratory suite entry and exit procedures. J Vis Exp. , (2016).
- Diagnostic Radiology Committee Task Force on CT Scanner Phantoms. Phantoms for evaluation and quality assurance of CT scanners. , American Association of Physicists in Medicine. Chicago, IL. (1977).
- Collins, B. ACUP 712.01 Waste anesthetic gas scavenging systems. Institutional Animal Care and Use Committee. , Cornell University. Ithaca, NY. Available from: http://www.research.cornell.edu/care/documents/ACUPs/ACUP712.pdf (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
- Office of the Press Secretary. Executive order 13546. Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. The White House. , Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
- Escaffre, O., Borisevich, V., Rockx, B. Pathogenesis of Hendra and Nipah virus infection in humans. J Infect Dev Ctries. 7, 308-311 (2013).
- Sueblinvong, V., et al. Critical care for multiple organ failure secondary to Ebola virus disease in the United States. Crit Care Med. , (2015).
- Mazur, S., et al. Safety precautions and operating procedures in an (A)BSL-4 laboratory: 2. General practices. J Vis Exp. , (2016).
- Bohannon, J. K., et al. Safety precautions and operating procedures in an (A)BSL-4 laboratory: 3. Aerobiology. J Vis Exp. , (2016).
