Introduction
Overbrenging van virussen gebeurt gewoonlijk door direct of fysiek contact, maar veel belangrijke virale ziekten (bijvoorbeeld mazelen, waterpokken, influenza) worden veroorzaakt door pathogenen die door aërosol of ademhalingsdruppeltjes worden overgedragen. Dergelijke pathogenen hebben het potentieel om een pandemie met gevolgen variërend van algemeen voorkomende milde ziekte geassocieerd met verlies van gegevens veroorzaken (bijvoorbeeld verkoudheid) ernstige ziekte met hoge letaliteit (bijvoorbeeld pokken) zeldzamer. High-gevolg pathogenen die natuurlijk verspreid door aerosol of opzettelijke aerosolen (biologische wapens) zijn van bijzonder belang aërobiologie 1. Mensen kunnen raken snel geïnfecteerd met een aantal van deze ziekteverwekkers door grote respiratoire druppels of kleine deeltjes kernen en gemakkelijk verspreid deze ziekteverwekkers aan anderen door speeksel afscheidingen, hoesten en niezen 2. In de VS biodefense gemeenschap, high-gevolg pathogenen (bijv filoviruses of andere NIAID Category AC Priority Pathogens en CDC Bioterrorisme gemachtigden) zijn de focus van aerosol onderzoeksprogramma's als gevolg van hoge dodelijkheid van infecties 3,4. Belangrijke wetenschappelijke vooruitgang op het gebied aërobiologie zijn gemaakt in de afgelopen tien jaar als gevolg van de technologische vooruitgang in spuitbussen apparatuur en high containment faciliteiten 5,6. Onderzoek bij de National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIH / NIAID), Integrated Research Facility in Fort Detrick gelegen in Frederick, MD, USA (IRF-Frederick) is gericht op high-gevolg opkomende ziekteverwekkers die dierlijke bioveiligheid vereisen 4 (ABSL-4) containment. De algemene opdracht van het IRF-Frederick te evalueren en de ontwikkeling van kandidaat-vaccins en therapeutica (medische tegenmaatregelen) vergemakkelijken.
Onderzoek met high-gevolg ziekteverwekkers bij de IRF-Frederick wordt beheerst door strikte bioveiligheid en verzorging van dieren en gebruikseisen. deze requirements zijn uiteengezet in het Bioveiligheid in Microbiologische en Biomedische Laboratories (BMBL) manual 7 en de federale dierenwelzijn voorschriften. Deze vereisten kunnen het type van onderzoek dat kan worden uitgevoerd te beperken en de impact algehele opzet van het onderzoek. Zoals we eerder in dit tijdschrift beschreven, al het onderzoek uitgevoerd in een ABSL-4 omgeving vereist de nodige voorzichtigheid, zeer gespecialiseerde opleiding, en een robuuste en redundante faciliteiteninfrastructuur 8,9.
Binnenkomst in de IRF-Frederick ABSL-4 pak laboratorium vereist het aantrekken van een positieve druk inkapselen suit 8. Positieve druk chemiepakken zijn niet vereist voor het invoeren van de ABSL-4 kast laboratorium. Aantrekken van een scrub pak, rubber of nitril, en close-toed schoenen is geschikt wanneer het manipuleren Risk Group 4 besmettelijk materiaal in een gecertificeerde klasse III bioveiligheid Cabinet (BSC) in een ABSL-4 kast laboratorium 7.
Aan de IRF-Frederick, is aerosol-apparatuur ontworpen, samengesteld en wordt onderhouden in twee hermetisch afgesloten, roestvrij staal, luchtdichte, negatieve druk klasse III BSC, figuur 1. De IRF-Frederick Aerobiology Core maakt gebruik van een geautomatiseerde aerosol Management Platform ( AAMP) en besturen aerosol experimenten binnen deze BSCs figuur 2. een eerdere publicatie zet de specifieke functies van de klasse III BSC op IRF-Frederick en de verbinding met het pak laboratorium via een doorvoerpoort 5. De werkwijze voor het bereiden van de klasse III BSC vóór experimenten is specifiek voor de IRF. Andere Class III BSC's gebruikt bij andere instellingen functioneren op dezelfde wijze als de Class III BSC in gebruik bij de IRF, maar kan verschillende mechanismen voor het vervoer, de toegang, of docking te hebben.
Om verder te begrijpen hoe hoog-gevolg ziekteverwekkers besmettelijk blijven en verspreid via aerosol transmissie, veilig aerobiological experimenten moeten in deze klasse III BSC's worden uitgevoerd volgens een specifieke workflow procedure. Onderzoekers hebben zorgvuldig en grondig getraind om deze workflow wordt gevolgd in een veilige en consistente wijze te waarborgen. Voorafgaand aan niet-menselijke primaten (NHP) aerosol uitdaging, verschillende aerosol karakterisering of sham aerosol runs worden uitgevoerd om de stabiliteit en de levensvatbaarheid van een agent bij in de vorm van spuitbussen te testen. De aerosol karakterisering die bootst de werkelijke aerosol uitdaging, en de onderzoeker beoordeelt de variabelen in verband met spuitbussen studies.
Een ander deel van de workflow fysieke manipulaties, toediening of anesthetica of andere middelen of routineprocedures nemen op grafieken voor elk NHP. Deze onderwerp kaarten worden grondig geanalyseerd om procedurele consistentie en standaardisatie te waarborgen. Onderwerpen verdoofd vóór aërosol. Voorbeeld anesthetica bevatten tiletamine / zolazepam, ketamine / acepromazine en ketamine. Anesthetica zijn gekozen op basis van het minimaliseren van respiratoire onderdrukking en bevordering van de gecontroleerde, steady-state ademhaling. Extra verdoving leveringen worden onderhouden in het dier procedure kamers en getransporteerd over de overdracht kar met de NHP aan de aërobiologie ABSL-4 kast laboratorium.
Binnen het ABSL-4 pak laboratorium NHP ondergaan plethysmografie via één van de twee methoden (dwz head-out plethysmografie, respiratoire inductie plethysmografie [RIP]) om inspiratoire tidal volume te bepalen en ademhaling verandert 10-12. Deze afgeleide parameters worden gebruikt voor nauwkeurige berekening van de geschatte geïnhaleerde dosis van het pathogeen onmiddellijk vóór of tijdens een aërosol blootstelling. Head-out plethysmografie maakt gebruik van een lange, cilindrische kamer dat de NHP 13 huizen. De drukval ontstaat wanneer een dier in de cylinder wordt opgevangen door een pneumotachograaf, doorgegeven aan de versterker, verwerkt door de wisselstroom / direct current converter, en geïntegreerd in de software de bovengenoemde pulmonaire parameters afleiden. RIP gebruikt sensoren van inductieve gewikkelde koperen draden die zijn ingebed in elastische banden rond de borst van de patiënt en de buik 11,12. Een inductieve-condensator een magnetisch veld in de sensor. Ademhaling verandert het magnetisch veld en de resulterende spanningsveranderingen worden doorgegeven van een zender naast de elastische band naar een ontvanger in de computer via korte-golflengte UV-hoogfrequente radiogolven. Dedicated software bepaalt ademhaling en getijdenenergie volume van de totale thoracale verplaatsing.
De minuutvolume (MV) verkregen via plethysmografie wordt gebruikt bij de berekening van de geschatte geïnhaleerde dosis (D). Bij het genereren en bemonstering een aërosol wordt de aerosol concentratie (AC) berekend door de biosampler concentratie (BC) te vermenigvuldigen met het volume van media (V) en te delen door het resultaat van vermenigvuldiging van de stroomsnelheid biosampler (FL) van debelichtingstijd (T). De vereenvoudigde formule wordt voorgesteld als AC = BC x V ÷ FL x T. Op zijn beurt, voor de eigenlijke aerosol uitdaging in het NHP, D wordt berekend door vermenigvuldiging AC door MV en de duur van de blootstelling (tijd = T). De vereenvoudigde formule wordt voorgesteld als D = AC x MV x T.
Het doel van dit artikel is om visueel te tonen het hele aerosol uitdaging procedure met behulp van NHP's vanuit twee gezichtspunten, de ABSL-4 pak laboratorium kant en de ABSL-4 kast laboratorium kant. Hoewel deze procedures algemeen van aard kunnen zijn voor meerdere genoemde praktijken, ze zijn specifiek voor de IRF-Frederick Aerobiology Core en vertegenwoordigen de huidige praktijken die in deze instelling. Dit artikel richt zich op de bioveiligheid procedures die nodig zijn om veilig uit te voeren een aerosol uitdaging, niet de werkelijke aerosol uitdaging zelf. In deze procedures, maken we gebruik van een dummy onderworpen aan bioveiligheidspraktijken, als gevolg van de risico's geassocieerd met verlamming een NHP tonen. Echter, het proces van performing een aerosol uitdaging is geschreven in algemene zin, omdat de procedure is hetzelfde, ongeacht de high-gevolg ziekteverwekker gebruikt. Wij streven ernaar om kennis en begrip van de wetenschappers over de ontberingen van het uitvoeren van aerosol studies van grote gevolgen ziekteverwekkers onder maximale insluiting omstandigheden te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol houdt zich aan de volgende richtlijnen verzorging van dieren. De dieren werden gehuisvest in een faciliteit geaccrediteerd door de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten, Afdeling Klinische Research, Animal Care en gebruik Comite en waren in overeenstemming met de Animal Welfare Act regelgeving, GGD-beleid, en de Gids voor de zorg en het gebruik van Laboratory Animals aanbevelingen.
1. Aerobiology: Animal Biosafety Level 4 (ABSL-4) Suit Laboratory
- laboratorium Voorbereiding
- De vermelding voltooien procedures ABSL-4 pak laboratorium (in detail beschreven in 8).
- Test de functionaliteit van alle apparatuur (bijvoorbeeld plethysmografie apparatuur, laptop, biohazardous vuilnisbakken, biohazardous slijpsel containers, onder voorbehoud van controle-apparaats) die betrokken zijn bij aërobiologie procedures die binnen de ABSL-4 pak laboratorium volgens het protocol van de fabrikant.
- Zorgen Dwarswagen biologisch schoon zijn voordat het testen van de functionaliteit van de snelle overdracht poort (RTP), waarbij de transportwagen door de wand verbindt met de klasse III BSC).
- Handvat en verdun ziekteverwekker alleen binnen gecertificeerde BSC. Bereid de ziekteverwekker in de juiste formulering binnen een klasse II BSC dat geschikte ontsmettingsmiddelen bevat. Vervoeren de ziekteverwekker in een luchtdichte secundaire container gemerkt met een biohazardsymbool op nat ijs in de transportwagen. Passeren de ziekteverwekker via de RTP in de klasse III BSC in de ABSL-4 kabinet laboratorium, figuur 1.
2. plethysmografie: Animal Biosafety Level 4 (ABSL-4) Suit Laboratory
- Plethysmografie Instellingen en kalibratie
- Bepalen welke methode van plethysmografie overname(Head-out plethysmografie of respiratoire inductie plethysmografie [RIP]) zal worden gebruikt en sluit apparatuur componenten met elkaar.
- Kalibreer de plethysmograaf vóór het experiment met protocol van de fabrikant.
- plethysmografie Acquisition
- Bij het hanteren van NHP, don een externe paar latex of nitril handschoenen over de bovenkant van het pak handschoenen om kruisbesmetting te voorkomen en veilige praktijken te bevorderen. Wanneer u klaar bent het hanteren van NHP's, verwijder deze extra handschoenen en gooi in de biohazardous prullenbak in de kamer.
- Bij gebruik van head-out plethysmografie, bevestig een nieuw rubber / beflapje aan de voorzijde van de cilinder. Snijd een klein gat in de dam voor het hoofd van de NHP om door de bovenkant van de cilinder. Zittende, de dam zorgt voor een afdichting rond de nek van de NHP's.
- Bij gebruik van RIP, controleren of de RIP banden goed zijn aangebracht rond de borst en de buik van de NHP en de elektronische verbindingen zijn vastgeklikt tighTLY.
- Stuur alle gegevens verkregen uit de plethysmografie procedure om de onderzoekers in de ABSL-4 kast laboratorium. Exporteren tidal volume en minuutvolume gegevens voor elk dier door middel van een geschikt programma voor gebruik tijdens de aerosol proces.
3. humane primaten Transport en Handling: Animal Biosafety Level 4 Suit Laboratory
- NHP Handling
- Bewaken en eventuele fysieke manipulaties, administraties, of routine procedures vast te leggen op kaarten voor elke NHP.
- Wanneer een aerosol uitdaging is voltooid, plaatst u het NHP in de transportcontainer en terug te keren NHP aan de kooi zich in het dier Holding kamer.
- Bij het hanteren van een levend dier, volg dan de dwingende bepaling die vereist dat 2 medewerkers aanwezig te zijn.
- NHP Transport
- Bepaal het type van anesthesie, de duur van de anesthesie (covers transport, plethysmografie acquisition en aerosol uitdaging) en overeenkomstige dosis van anesthesie voor toediening. Volledig verdoven het NHP op basis van de door de Comparative Medicine personeel gekozen proces. Als er extra verdoving nodig is, ervoor zorgen dat alle naalden, slijpsel, spuiten en caps worden weggegooid in een naaldencontainer gelegen in een van de procedure dierenverblijven. Gebruik geen naalden niet samen te vatten na gebruik.
- Transport verdoofd NHP's in duidelijke containers die worden gedekt door een vergrendeling op het deksel van de doos transport.
- Vervoer lading containers op een mobiele kar om volledig geschikt onderzoekers vrij bewegen met behulp van ademlucht lijnen en door de luchtdruk resistente (april) deuren, figuur 1.
- Geen extra ademlucht voor NHP wordt toegevoerd aan de transporthouder, minimaliseren transporttijd.
4. Aerobiology: ABSL-4 Cabinet Laboratory
- Klasse III BSC Setup
- Gelijktijdig met dierlijke voorbereiding uitgevoerd door Comparative Medicine personeel, de voorbereiding van de klasse III BSC. Visueel controleren of onderdruk in de klasse III BSC wordt gehandhaafd binnen een bepaalde range (125 Pa of -0,5 in water gauge (wg) minimum, 250 Pa of -1,0 in wg aanbevolen). Inspecteer de klasse III BSC op mogelijke lekken of scheuren (zie figuur 1).
- Fysiek en visueel inspecteren van de klasse III BSC synthetisch rubber handschoenen en O-ringen aan de Class III BSC voor zwakke plekken, tranen, scheurt, of droogrot. Vervang de klasse III synthetisch rubber handschoenen en / of O-ringen onmiddellijk voor gebruik. Op dit punt wordt de klasse III BSC niet verontreinigd.
- Als een lek optreedt, terwijl de Class III BSC is verontreinigd, de locatie van de overtreding en alert facility management en bioveiligheid personeel. Als een klasse III BSC geïntegreerd handschoen is gescheurd of geschonden, onmiddellijk vervangen van de beschadigde handschoen door de goed opgeleide techniek en internal Class III BSC standaard procedure.
- Een geïntegreerd handschoen die een kleine scheur of breuk veranderen tijdens de belichting, eerst de scheur of breuk spuit overdreven met de juiste concentratie van een dubbele quaternair ammonium (n-alkyl dimethyl benzyl ammoniumchloride, n-alkyl dimethyl- ethyl benzyl ammoniumchloride) ontsmettingsmiddel . Heeft excessieve bewegingen niet te maken in deze tijd dat een verhoging van de luchtstroom te creëren.
- Verwijder voorzichtig de buitenste O-ring (2 daarvan) die het beschadigde geïntegreerde handschoen nog op de klasse III BSC. Beweeg de beschadigde geïntegreerde manchet uit de buurt van de haven, terwijl het waarborgen van de geïntegreerde handschoen afdichting intact blijft. Als de afdichting in het gedrang komt, klinkt een alarm met vermelding van de procedure niet correct gedaan. De geïntegreerde manchet moet vast blijven zitten aan de poort na de tweede O-ring van de Class III BSC wordt verwijderd.
- Plaats een nieuwe klasse III BSC synthetisch rubber handschoen over van de oude handschoen in dezelfde oriëntatie. Plaats deze nieuwe handschoen volledig over de haven op dezelfde wijze als de andere klasse III BSC handschoen poorten.
- Vervang de O-ring dichtst bij de klasse III BSC via nieuwe geïntegreerde handschoen. Met behulp van een aangrenzende geïntegreerde handschoen haven, trek de beschadigde klasse III BSC synthetisch rubber handschoenen in de klasse III BSC. De nieuwe klasse III synthetische rubberen handschoen zal fungeren als barrière voor insluiting te handhaven. Zodra de andere beschadigde Class III synthetisch rubber handschoen wordt verwijderd (naar binnen getrokken), vervang dan de andere buitenste O-ring en blijven werken.
- Noteer alle details over handschoen scheur / bres in de specifieke klasse III BSC logboek. Als de beschadigde geïntegreerde handschoen wordt verwijderd of een breuk in containment optreedt, de besmette geïntegreerde handschoen / poort heeft nog steeds een innerlijke luchtstroom van 0,47 m3 / sec. Dit naar binnen luchtstroom is dezelfde luchtstroom gebruikt met een klasse II BSC, waardoor de samenhang tussen klasse II en III BSC behoud.
- Inspecteer dunk tank encontroleren of de dunk tank is gevuld met een ontsmettingsmiddel om de gemarkeerde niveau binnen de dunk tank, figuur 1. Controleer de concentratie ontsmettingsmiddel in de dunk tank is een minimum van 3.500 mS met behulp van een geleidbaarheidsmeter. Deze geleidbaarheid gelijk aan 5% concentratie van het desinfectans.
- Zorg ervoor dat de klasse III BSC autoclaaf is functioneel en operationeel dus al besmet afval en apparatuur kan worden geautoclaveerd, figuur 1. Autoclaaf alleen apparatuur bekend om de ontberingen van het sterilisatieproces te ondersteunen.
- Test de functionaliteit van andere aërobiologie apparatuur (bijv AAMP onderdelen, laptop) en lucht en vacuüm lijnen betrokken bij het experiment, figuur 2.
- Plaats tekens op de Klasse III BSC de actuele stand vervuiling van het apparaat.
- Montage en Systeeminstellingen van NHP Head-only Exposure Chamber
- Monteer een 16-l NHP head-only exposure chamber door het invoegen van de roestvrijstalen levering en uitlaat lijnen, figuur 2. Stel de kamer in een push / pull, dynamische configuratie door het aansluiten van de juiste lucht, vacuüm, en de druk lijnen naar de AAMP. Sluit de AAMP een spanningsbereik van klasse III BSC en een laptop computer via een hermetisch gesloten poort bovenop de klasse III BSC (figuur 1).
- Inspecteer de geassembleerde NHP head-only exposure kamer voor eventuele lekken of scheuren, en ervoor te zorgen dat de kamer goed is gemonteerd.
- Bevestig een aërosol generator en aërodynamische deeltjesgrootte lezing instrument om de NHP head-only exposure kamer.
- Open de lucht en vacuüm bron naar de AAMP.
- Start de aerosol protocol software op de laptop computer. Voer de juiste NHP head-only exposure kamer, aërosolgenerator en biosampler stroomsnelheid, en administratieve informatie in de software menu's.
- Bereken de aerosol uitdagingtijd vanaf het verworven tijdens de plethysmografie procedure gegevens, stap 2.2.4. Bij gebruik van de kop-out plethysmografie, het berekenen van de dosis voorafgaand aan de blootstelling aan aerosol. Bij gebruik van RIP, het berekenen van de dosis gelijktijdig tijdens de belichting aerosol.
- Vul het aërosolgenerator met het pathogeen.
- Door de aerosol software, zet de aërosolgenerator "aan" en spuit de binnenkant van het NHP uitsluitend kop blootstellingskamer de uitdaging materiaal gedurende 10 min.
- Schakel de aerosol generator, de uitdaging materiaal te legen, en gooi de uitdaging materiaal in een biologisch gevaarlijk vuilniszak gelegen binnenkant van de klasse III BSC.
- NHP Head-only Exposure
- Bevestig een biosampler de NHP head-only exposure kamer, vul de biosampler met collectie media, en bevestig de juiste vacuüm lijn naar de biosampler.
- Controleer de diepte van de anesthesie van de NHP. Als de diepte van de anesthesie wordt voldoende geacht (
- Plaats het NHP in rugligging op de NHP blootstelling helling.
- Voorzichtig langs de NHP's hoofd door de rubber / beflapje bevestigd aan het hoofd portaal van de NHP head-only exposure kamer. De rubber / tandheelkundige dam zorgt voor een afdichting wordt gecreëerd rond de nek van de NHP's tijdens de belichting aerosol.
- Controleer of de NHP's vitale functies stabiel zijn visueel en met een draagbare onderwerp monitor.
- Voer de aerosol uitdaging tijd berekend uit stap 4.2.6. en de benodigde apparatuur identifiers perTinent elke aerosol lopen in de aerosol software en beginnen met het aerosol uitdaging.
- Controleer deeltjesgrootte gegevens tijdens elke aerosol lopen met de aerosol deeltjesgrootte analysator te zorgen voor de gewenste deeltjesgrootteverdeling wordt bereikt. Voer deze controle continu of met tussenpozen gedurende de belichting.
- Zodra de aerosol uitdaging is voltooid, verwijdert de NHP uit de kop-only exposure kamer en veeg het NHP's gezicht / hoofd af met de juiste ontsmettingsmiddel om mogelijke besmetting laboratorium personeel te verminderen.
- Spoel de aerosol kamer of in de lucht was de resterende en achterblijvende deeltjes gedurende 5 minuten door het passeren van de lucht en vacuüm door de kamer. Deze procedure zal "schoon te maken" en verwijder de resterende deeltjes uit de blootstelling aan aerosol kamer voor latere NHP aerosol blootstelling.
- Passeer de NHP terug door de RTP de onderzoekers zich op in de ABSL-4 aërobiologie suit laboratorium.
- Gooi alle kruizen used binnen de klasse III BSC in een aangewezen naaldencontainer dat de BSC blijft. Wanneer de naaldencontainer is ¾ vol, te plaatsen in de biohazard vuilniszak.
- Leeg de aerosol generator en een van de resterende uitdagingen materiaal in de biohazardous vuilniszak met afval, wegwerpmateriaal, en / of ¾-full naaldencontainer indien van toepassing.
- Leeg de collectie media uit de spuitbus biosampler in de juiste label collectie buizen en te plaatsen op nat ijs.
- Herhaal de stappen 4.3.1 tot 4.3.13 totdat alle geplande proefpersonen werden uitgedaagd.
- Pass alle aerosol biosampler monsters door de RTP de onderzoekers voor het kwantificeren en terug titraties van aërosol dosis.
- Plaats de prullenbak en apparatuur van de aerosol uitdaging in de doorwerking autoclaaf aan de klasse III BSC en selecteer een toepasselijke sterilisatiecyclus (figuur 3).
- Demonteer de NHP head-only cHamber en ontsmetten van de head-only kamer en de klasse III BSC met een paraformaldehyde gas cyclus gevalideerd met biologische indicatoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Klasse III bioveiligheid kast (BSC) is een hermetisch afgesloten roestvrijstalen kast met een ABSL-4 omgeving onder onderdruk in een ABSL-4 kast laboratorium (figuur 1). Materialen kunnen worden ingebracht in de BSC door functionarissen van de ABSL-4 kast laboratorium door een onder-kast gemonteerde roestvrijstalen tank (gewoonlijk aangeduid als "dunk tank" in ABSL-4 of BSL-4 instellingen) die een 5 % dual quaternaire ammonium (n-alkyl dimethyl benzyl ammoniumchloride, n-alkyl dimethyl benzyl ammoniumchloride ethyl) ontsmettingsmiddel. Omdat de BSC in de scheidingswand tussen de kast laboratorium uit een ABSL-4 pak laboratorium gebouwd, materialen, dieren en virale pathogenen kan worden verplaatst naar de BSC het ABSL-4 suit laboratorium zijde met een transportwagen en een snelle overdracht Port (RTP). De inhoud in het BSC kan worden gemanipuleerd van buitenaf door onderzoekers dragen verschillende soorten synthetische rubber handschoenen, in het bijzonder neopreen / gechloorsulfoneerd polyethyleen. Inhoud, met uitzondering van besmettelijke monsters, worden verwijderd uit de BSC na sterilisatie door middel van een dubbele deur autoclaaf of desinfectie via de dunk tank. Door te controleren / verifiëren dat de klasse III BSC en bioaerosol uitrusting (figuur 2) naar behoren functioneert, handhaven wij een veilig en correct operationele omgeving. Goed onderhoud en het gebruik van de klasse III BSC is een integraal onderdeel van persoonlijke bescherming voor de onderzoeker. Na aerosol blootstelling, trash en apparatuur uit de aerosol uitdaging te worden gesteriliseerd worden geplaatst in de doorwerking autoclaaf verbonden aan de klasse III BSC, figuur 3. Door een strikte naleving van deze procedures en praktijken, zijn no-laboratorium verworven infecties zijn opgenomen tijdens bioaerosol onderzoek aan de IRF-Frederick.
2fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematische weergave van de klasse III bioveiligheid kabinet Setup op de IRF-Frederick. Presentatie van het kabinet in statische toestand (overgenomen uit 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Aerosol Management Platform. Aangepast van 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. elkaar grijpende dubbele deur autoclaaf Gehecht aan de Class III BSC. Een onderzoeker is het selectereneen voorgeprogrammeerde autoclaafcyclus de inhoud in de autoclaaf kamer garanderen infectieuze wanneer de buitendeur uiteindelijk geopend. De deur zich het dichtst bij de onderzoeker niet geopend voordat een volledige sterilisatiecyclus is voltooid. Biologische indicatoren binnen de autoclaaf kamer zullen worden geanalyseerd aan de vertegenwoordiger van inactivatie na het sterilisatieproces (overgenomen uit 5) te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We schetsen de aërobiologie procedures die worden gebruikt bij de IRF-Frederick voor het werken met zeer gevaarlijke (Risk Group 4) ziekteverwekkers. Een doel van het visualiseren van de bio-aërosoldeeltjes procedures is de veiligheid van het personeel te benadrukken wanneer een klasse III BSC tijdens experimenten met dergelijke pathogenen laboratorium verworven infecties te voorkomen. Klasse III BSC's behouden een binnenkomende gerichte luchtstroom die uitlaten in dubbelstrengig HEPA filters zodat ziekteverwekkers opgenomen in het laboratorium (figuur 1).
Aangezien de klasse III BSC is de belangrijkste belemmering bij het voorkomen van potentiële blootstelling pathogenen in bio-aërosoldeeltjes studies, onderzoekers nodig om de integriteit van de klasse III BSC controleren en voor en na elk experiment aerosol bevestigd geïntegreerd handschoenen lekkage. Hoewel alles in het werk wordt genomen om risico's te laboratorium onderzoekers te elimineren, een schending van een klasse III BSC geïntegreerd synthetisch rubber handschoenen kan optreden. Het personeel moet worden voorzienzowel didactische mogelijkheden en hands-on training op de juiste klasse III BSC noodprocedures. Die procedures houden met evacuatie van de ABSL-4 kabinet laboratorium, het veiligstellen van een breuk in maatregelen om de klasse III BSC, en het opdoen van persoonlijke beschermingsmiddelen wanneer dat nodig is. Wij hebben andere handschoenen van verschillende dikte in het verleden die afhankelijk zijn van de fijne motoriek die nodig is voor de procedure worden gebruikt. Ongeacht de dikte, alle handschoenen gekozen zijn net zo beschermend als het uitvoeren van deze procedures. Robuuste training, strikte naleving van de veiligheid van protocollen en technische maatregelen helpen om de veiligheid van werknemers te garanderen bij het gebruik van klasse III BSC op de IRF-Frederick. De bovenstaande werkwijzen zijn onderhevig aan wijzigingen als gevolg van nieuwe methodes of veiligheid reevaluations gebaseerd op het verbeteren van de workflow.
Terwijl de aerobiological procedures hier gepresenteerde algemeen volg de BMBL aanbevelingen 7, deze procedures zijn specifiek voor de IRF-Frederick. Each ABSL-4 / BSL-4 faciliteit heeft ander gebouw specificaties van het ontwerp dat de exacte methoden van het laboratorium werking beïnvloeden. Alternatieve procedures en technieken voor het gebruik van klasse III BSC laboratoria hangt mede af van de opzet en werking van deze laboratoria. Daarnaast kunnen variërende regelgeving van de overheid in verschillende landen ook een effect hebben op de spuitbus onderzoek procedures. Niettemin is een algemeen begrip van ABSL-4 aerosol procedures en het gebouw controlesystemen die de veiligheid van het laboratorium onderzoekers te ondersteunen zal helpen de gezondheid beheerders, die overwegen het ontwerpen van soortgelijke gebouwen, en buiten de medewerkers die betrokken zijn bij studies van high-gevolg ziekteverwekkers.
Bij het ontwerpen van bioaerosol protocollen met externe medewerkers, moet voldoende tijd worden toegewezen aan zelfs elementaire bioaerosol bewerkingen uit te voeren. De verwachtingen van de termijnen voor het leveren van resultaten moeten worden aangepast door de moeilijkheden die inherent zijn aan het werk te aanvaardenin ABSL-4 klasse III BSC laboratoria. Een algemene aanname is dat bioaerosol experiment uitgevoerd op ABSL-2 (bv., 2 uur) tweemaal de hoeveelheid tijd vereist voor de uitvoering in ABSL-4 (bijvoorbeeld 4 uur).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Class III BSC | Germfree | DGB-10 | |
| Integrated BSC gloves | Piercan | 10UY2032-9 | |
| Aerosol Management Platform (AeroMP) | Biaera Technologies | NA | |
| Head-out plethysmography | Buxco/Data Sciences International | NA | |
| Respriatory inductive plethysmography | Data Sciences International | NA | |
| Centered flow tangential aerosol generator (CenTAG) | CH Technologies | NA | |
| Collison nebulizer | BGI Inc. | CN25 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Sperian positive-pressure suit | Honeywell Safety Products | BSL 4-2 | |
| Outer suit gloves (latex, Ansell Canners and Handlers) | Fisher | 19-019-601 | |
| Outer suit gloves (nitrile/rubber, MAPA) | Fisher | 2MYU1 | |
| Scrubs | Cintas | 60975/60976 | |
| Socks | Cintas | 944 | |
| Duct tape | Pack-N-Tape | 51131069695 | |
| Towels | Cintas | 2720 | |
| O-rings | O-ring warehouse | AS568-343 | |
| Overshoes | Amazon | B0034KZE22 | |
| Zip lube | Amazon | B000GKBEJA |
References
- Alibek, K., Handelman, S. The chilling true story of the largest covert biological weapons program in the world-told from inside by the man who ran it. , Random House. New York, NY. (1999).
- Roy, C. J., Pitt, L. M. Infectious disease aerobiology: aerosol challenge methods. Biodefense: research methodology and animal models. Swearingen, J. R. , Taylor & Francis. Boca Raton, FL. 61-76 (2006).
- National Institute of Allergy and Infectious Diseases. NIAID Category A, B, and C Priority Pathogens. , National Institutes of Health. Bethesda, MD, USA. Available from: http://www.niaid.nih.gov/topics/biodefenserelated/biodefense/pages/cata.aspx (2014).
- National Center for Environmental Health. Bioterrorism agents/diseases by category. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
- Lackemeyer, M. G., et al. ABSL-4 aerobiology biosafety and technology at the NIH/NIAID integrated research facility at Fort Detrick. Viruses. 6 (1), 137-150 (2014).
- Bohannon, J. K., et al. Generation and characterization of large-particle aerosols using a center flow tangential aerosol generator with a non-human-primate, head-only aerosol chamber. Inhal Toxicol. , (2015).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Chosewood, L. C., Wilson, D. E., eds, , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C.. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL4 Laboratory: 1. Biosafety level 4 suit laboratory suite entry and exit procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Mazur, S., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL4 Laboratory: 2. General Practices. J Vis Exp. , (2015).
- Mortola, J. P., Frappell, P. B. On the barometric method for measurements of ventilation, and its use in small animals. Can J Physiol Pharmacol. 76 (10-11), 937-944 (1998).
- Zhang, Z., et al. Development of a respiratory inductive plethysmography module supporting multiple sensors for wearable systems. Sensors (Basel). 12 (10), 13167-13184 (2012).
- Ingram-Ross, J. L., et al. Cardiorespiratory safety evaluation in non-human primates. J Pharmacol Toxicol Meth. 66 (2), 114-124 (2012).
- Besch, T. K., Ruble, D. L., Gibbs, P. H., Pitt, M. L. Steady-state minute volume determination by body-only plethysmography in juvenile rhesus monkeys. Lab Anim Sci. 46 (5), 539-544 (1996).
