Summary
Hier maken we gebruik van FISH methodologie op te sporen LINE-1 retrotransposition bij de enkele kernen niveau chromosoom spreads van HepG2-cellijnen stabiel tot expressie synthetische LINE-1.
Introduction
Human Lange afgewisseld Nuclear Element-1 (Lijn-1 of L1) is een autonome mobiele element dat zich voortplant in het genoom door middel van een "kopieer en plak" retrotransposition mechanisme. Een typische menselijke L1 ~ 6 kb lang en bestaat uit een 5 'UTR (niet getranslateerd gebied) dat als een promotor, twee open leesramen (ORFs): L1 -ORF1 en L1 -ORF2 en een 3'UTR met een polyA . staart L1 -ORF1 eiwit heeft drie verschillende domeinen: een spoel-coil domein, RNA erkenning Motif en C-terminale domein, terwijl L1 -ORF2 eiwit heeft endonuclease, reverse transcriptase en cysteïne-rijke domeinen 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 vertoont nucleïnezuur chaperon activiteiten, terwijl L1 -ORF2 biedt enzymatische activiteiten, met beide eiwitten vereist retrotransposition 1,2,6.
Een cyclus van L1 retrotransposition begint transcriptie van het 5'UTR van L1 L1 -ORF1 exposities ofwel cis bindingsplaats waar het pakketten zijn eigen RNA of trans bindingsplaats waar het pakketten andere RNA's (dat wil zeggen, SINE / SVAs / pseudogenes) om een ribonucleoprotein deeltje (RNP) te vormen met L1 -ORF2p 7, 8. RNP transloceren naar de kern, waar het endonuclease activiteit van L1 -ORF2p namen genomisch DNA (gDNA) aan een OH bloot - groep 9, dat op zijn beurt door reverse transcriptase te primen en reverse synthetiseren RNA DNA uit het 3 'uiteinde. Tijdens achterwaartse synthese wordt de tweede streng van DNA gekerfd 7-20 bp van de oorspronkelijke nick plaats gespreide pauzes die zijn gevuld met de handtekening L1 insertie sequenties (bijvoorbeeld TTTTAA) genoemd target site duplicatie (TSD) 9,10 vorming maken. Dit proces staat bekend als doelwit prime reverse transcriptie (TPRT) en leidt tot insertiop volledige of verkorte kopieën van L1 / andere DNAs met TSD aan beide einden van de ingebrachte sequentie. L1 retrotransposition is ook aangetoond worden gemedieerd door TPRT-achtige niet-homologe eind mee in sommige celtypen 11.
De L1 retrotransposition vector gebruikt in onze studies niet-episomale en bestaat uit L1 hebben -ORF1 & 2p aangedreven door combinatie CMV-promoters L1-5'UTR (figuur 1) 12. Eerdere versies van dit construct zijn beschreven in studies met gist en humane celculturen 13,14,15. Twee verschillende CMV promoters gelegen aan de 5 'en 3' uiteinden van de vector met het 3 'uiteinde in omgekeerde oriëntatie geplaatst om expressie neomycine rijden na splicing en integratie. De retrotransposition indicator cassette aan het 3 'uiteinde omvat een neomycine geïnsereerd antisense L1 -ORFs en inactief wordt door scheiding in twee helften door een klodderin intron met gesplitste donor (SD) en splicing acceptor (SA) plaatsen (Figuur 1). Na integratie in een chromosoom, is L1 getranscribeerd van een gemeenschappelijke promoter een mRNA dat uit een bicistronische mRNA en inactieve neomycine mRNA produceren. Tijdens RNA processing, is de globine intron splicing van het neomycine gen een volledig functionele neomycinegen herstellen. De hybride mRNA wordt verpakt in een RNP in cis en translocatie naar de kern waar het wordt geïntegreerd in het genoom als ofwel de volledige lengte of afgeknotte inserties gebruikt TPRT.
Hier beschrijven we een methode die gebruik maakt van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) met probes die specifiek gericht zijn op de gesplitste neomycinegen (Sneo) naar L1 -retrotransposiition patronen en invoeging tarieven volgen op de enkele kern niveau. De efficiëntie en specificiteit van de detectie werd bevestigd met behulp retrotransposition competente en incompetente constructies en sondes naar detect Sneo of neomycine en globine intron knooppunt 16. Deze methode vertegenwoordigt een aantal tekortkomingen van celkweek gebaseerde retrotransposition assays, zoals meerdere inserties, kolonie weerstand en positieve kloon expansie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven. Raadpleeg reagentia gedeelte voor meer informatie over hoe u de individuele reagentia te bereiden.
1. Labeling L1 Probes
OPMERKING: Probes kunnen worden gemerkt door chemische of PCR labeling.
- chemische labeling
- Voeg 0,7-1% agarosegel in Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer, warmte in een magnetron tot het gesmolten is, laat de gel afkoelen en voeg ethidiumbromide (0,5 ug / ml). Giet in bleekbeugel, kammen toe en laat de gel stolt bij kamertemperatuur.
- Label de Sneo probe (1-2 ug) met CY3 of FITC bij 37 ° C gedurende 1 uur volgens het protocol van de fabrikant.
LET OP: Sneo geeft de S pliced Neo mycin gen tot expressie gebracht na een volledige cyclus van retrotransposition. De sonde ~ 1000 bp groot. Sneo kan PCR worden geamplificeerd van een vector of genomic DNA. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over Streptavidine-CY3 / FITC labeling reagentia. - Meng de gelabelde Sneo probe-oplossing met 1x DNA laadbuffer, lading in elk putje en draaien op 75-100 volt gedurende 15-20 min.
- Visualiseer de sonde band met behulp van een Ultra-Violet (UV) Illuminator. Merk op dat de grootte van de Sneo probe kan worden aangepast en dat Lock nuclei acid (LNA) ook kunnen worden toegevoegd (Figuur 2).
- Cut gelabelde Sneo probe uit de gel met een schone mes, oplosbaar te maken en te zuiveren van de Sneo sonde uit de gel met behulp van een PCR Clean-up kit volgens het protocol van de fabrikant.
LET OP: Cover elk blootgestelde deel van het lichaam met beschermende schilden (dat wil zeggen, laboratorium jassen en UV duidelijke gezichtsmasker) bij het bekijken van en het snijden van de gel. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie aan gel zuiveren van PCR-producten. - Re-run 5 ui Sneo gelabelde probe met een VN-gelabelde Sneo probe op een 0,7% agarosegel (zie punt 1.1.1) te congrootte van de onderneming verhogen en verlies van de intensiteit van het signaal (figuur 2).
- Kwantificeren hoeveelheid gemerkt Sneo probe door meting van de absorptie bij 260 nm en los het Sneo sonde 10 ng / ul aliquots in nuclease vrij H2O WINKEL aliquots bij -20 ° C.
- PCR Labeling (alternatieve methode voor het probe etikettering)
- Combineer Sneo specifieke primers (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'en 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') met PCR reagentia in één buis: 13,6 ul nuclease vrij H2O; 0,1 ul dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 pi dTTP (10 nM); 0,05 ui dUTP-biotine / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ui Ga Tag 5x buffer; 0,4 ul Ga Tag Polymerase; 1 pl Sneo template (10 ng). Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over de PCR-reagentia.
- Pas de hoeveelheid van elk reagens door vermenigvuldigen met het totale aantal monsters.
- Gebruik de volgende PCR fietsen parameters VERSTERKT label Sneo probes: 95 ° C gedurende 2 min; 35 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 62 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 60 seconden; 72 ° C gedurende 2 min; Houd bij 4 ° C voor onbepaalde tijd.
OPMERKING: De hybridisatietemperatuur kan worden aangepast of gradiënt PCR kan worden voltooid optimale annealing temperaturen andere sondes bepalen. - Maak 0,7-1% gel zoals in paragraaf 1.1.1, belasting en visualiseren van de sonde band als in paragraaf 1.1.4.
- Knip en zuiveren de gemerkte Sneo probe zoals in paragraaf 1.1.5.
- Re-run 5 ui Sneo gelabelde probe met VN-gelabelde Sneo sonde naar vergroot en het verlies van intensiteit van het signaal te bevestigen (zie figuur 2).
- Kwantificeren hoeveelheid gemerkt Sneo probe door meting van absorptie bij 260 nm en verdun Sneo sonde naar 10 ng / ul aliquots in nuclease vrij H2O
2. Voorbereiden Chromosome Spreads
- Het genereren van stabiele klonen die vector backbone (control) of retrotransposition bevoegde L1 gebruikmaking van standaard methodologieën selectie. 12,16 Terwijl niet-episomale reporters gebruikt om bevindingen studies van transcriptie correleren, kan episomale vectoren ook worden gebruikt. Grow cellen die stabiel controle of L1 vector (1 x 10 6 cellen per 10 cm plaat, met aanpassingen in plaat maat gemaakt als dat nodig is) in volledige groei media uit te drukken. Voor HepG2-cellen, gebruik RPMI-1600, 10% FBS en 200 ug / ml hygromycine. Groeien kweken tot 70% confluentie bij 37 ° C en 5% CO2.
LET OP: De keuze van het groeimedium is afhankelijk van het type cel. Aangezien de hier gebruikte plasmiden dragen selectie cassettes zowel hygromycine en néomycine, kan stabiele selectie van klonen ook gebeuren met neomycine na selectie in hygromycine, maar de hoeveelheid neomycine moet worden geoptimaliseerd voor tolerantieniveaus voor elk celtype. - colcemide (0,4 ug / ml) toe aan cultuurmedium en incubeer gedurende 90 min om cellen arresteren metaphase. Bij gebruik van verschillende celtypes Bepaal de optimale concentratie van colcemide en blootstellingsduur (60, 90 en 120 min) optimaal metafase arrestatie empirisch.
- Was cellen 2x met 10 ml 1 x Dulbecco's PBS (DPBS), trypsinize door toevoeging van 3-5 ml van 0,25% trypsine oplossing voor de cellen en incubeer gedurende 5 minuten om de cellen los te maken. Trypsine inactiveren met een gelijke hoeveelheid media bevattende 10% FBS.
- Centrifugeer de cellen gedurende 2 min bij 1000 xg bij 4 ° C, zuig het medium uit de celpellet en was de cellen met DPBS. Aspireren alle DPBS, waardoor 200 gl DPBS om resuspendeer de cellen. Zorg ervoor dat cellen worden goed gemengd en dat alle klonten zijn verspreid. Gebruik flikkeren of zachte pipetteren om te mixen en te verspreiden bosjes en vortexen te vermijden.
- Voeg 5 ml hypotone oplossing (dat wil zeggen, 75 mM KCl) dat is voorverwarmd tot 37 ° C druppelsgewijs tijdens het draaien van de 15 ml buis horizontaal en incuberen bij 37 ° C gedurende 20 min. Zie tabel van Materialen en Reagents voor informatie over het verkrijgen en maken hypotone oplossing.
- Centrifugeer cellen bij 120 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en herhaal stappen 2,4-2,5 3x laat ongeveer 200 ul hypotone oplossing resuspendeer de cellen na elke wasbeurt. Waarborgen dat aan het einde van de 3 wasbeurten, de pellet zichtbaar wit en gezwollen.
- Resuspendeer de pellet in 200 ui van Carnoy Fixatief oplossing en maak 1: 2, 1: 4, 1: 8, 01:16 verdunningen in Carnoy Fixative oplossing. Drop 10 ul van elke verdunning op een droge, schone dia uit ongeveer 1 cm boven en onmiddellijk bloot de verspreiding-vrije zijde aan hete stoom van kokend water gedurende 30 sec. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over hoe u Carnoy Fixative oplossing te maken.
- Droog de spreads bij kamertemperatuur vlek met 0,1 ug / ml Hoechst-33342 door onderdompeling gedurende 15-20 min in Coplin jar 3x wassen met DPBS. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over hoe u de Hoechst-33342 oplossing te maken. <li> Bekijk de spreads op fluorescentie / fase-contrast microscoop bij 40x vergroting. Na het optimaliseren van spread voorbereiding, hoeft spreads niet worden gekleurd met Hoechst-33342. Uitzicht spreads op fasecontrast microscoop bij 10x vergroting verspreiding kwaliteit en afscheiding zoals beschreven in de Resultaten bepalen (zie figuur 3).
- Selecteer en cirkel goede spreads met een Diamond Point Marker aan de andere kant van de schuif (dat wil zeggen, verspreid-vrije zijde).
- WINKEL verspreidt bij -20 ° C gedurende een maand. Vermijd blootstelling aan vocht.
3. Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH)
- Stabilisering en dehydrateren spreads
OPMERKING: Equilibreren metafase chromosoom spreads tot kamertemperatuur indien bewaard bij -20 ° C. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over het verkrijgen en maken reagentia.- Incubeer metafase chromosoom spreads met 200 gl RNase A1 uur bij 37 ° C.
- Wassen schuift 2x SSC-buffer tweemaal gedurende 5 minuten elk, gevolgd door spoelen met 10 mM HCl-oplossing.
- Incubeer smeersels met 1% pepsine gedurende 10 minuten bij 37 ° C, spoelen met gedeïoniseerd H2O en tweemaal wassen met 2 x SSC-buffer gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer smeersels met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten en wassen in 2xSSC buffer tweemaal gedurende 5 minuten elk.
- Uitdrogen verspreid door incubatie gedurende 2 min in ethanol serie: 70%, 80% en 95% ethanol.
- Lucht drogen dia's.
- Hybridisatie Spreads met L1 gemerkte retrotransposition probes (dat wil zeggen, Sneo)
LET OP: Voor direct-gelabelde probes, weg te houden van licht te allen tijde. Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over het verkrijgen en maken reagentia.- Voeg 30 ng Sneo hybridisatie buffer, warmte bij 72 ° C gedurende 10 min en koel voor 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 30 ul van Sneo probe-oplossing van each spread, dek af met dekglaasje en sluit de randen met rubber cement. Zorg ervoor dat er geen vorming van zeepbel.
- Verwarm de glijbaan bij 72 ° C gedurende 5 min op een verwarmingsblok geleidelijk de temperatuur dalen tot 37 ° C en incubeer overnacht in een donkere vochtige kamer bij 37 ° C.
- Wassen en bekijken (of toevoeging van secundair antilichaam)
LET OP: Voor direct-gelabelde probes, weg te houden van licht te allen tijde.
OPMERKING: Zie tabel van materialen en reagentia voor informatie over hoe te bereiden. Gebruik van voldoende volume om de gehele chromosoom spread dekken wordt aanbevolen. Vergeet niet dat overtollige volume gaan verloren als dekglaasje wordt toegevoegd.- Dompel dia's in 2x SSC buffer om dekglaasjes te verwijderen.
- Was dia door onderdompeling in 2 x SSC-buffer bij 45 ° C gedurende 5 minuten.
- Was dia door onderdompeling in wasbuffer bij 45 ° C gedurende 5 min, 2x.
- Was dia door onderdompeling in 0,1 x SSC-buffer bij 45 ° C gedurende 10 minuten.
- Was dia door onderdompeling in 2 x SSC-buffer bij 45 ° C gedurende 10 minuten.
LET OP: Plaats een Coplin pot met aanbevolen buffer in een waterbad, aan te passen temperatuur tot 45 ° C. - Koel dia tot kamertemperatuur equilibreren en schuift detectiebuffer.
- Voor de directe gelabelde probes, ga dan naar stap 3.4.10.
- Voor indirect gelabelde probes, blok in blokkerende buffer gedurende 20-30 min en was 3x in DPBS.
- Incuberen met 50 pl secundair antilichaam (bijvoorbeeld, 5 ug / ml streptavidine-FITC of αCY3 in blokkeerbuffer) gedurende 1 uur.
- Was de dia's in 2x SSC gedurende 5 minuten twee keer.
- Tegenkleuring met Hoechst 33342-oplossing (0,1 ug / ml) gedurende 10 min.
LET OP: deze kleuring wordt gedaan om chromosomen voor co-lokalisatie met probe vlekken. - Was in DPBS 3x, voeg een druppel montage medium, plaats een dekglaasje en sluit de randen met nagellak.
- Analyseer L1 retrotransposition met behulp van fluorescentie microscoop bij 40X magnification.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematisch diagram van de L1 retrotransposition vector wordt getoond in Figuur 1. De vector omvat een neomycine-gen in antisense oriëntatie L1 ORF dat wordt onderbroken door een globine intron in sense oriëntatie en kern met SD- en SA sites. Wanneer stabiel geïntegreerd in een chromosoom, is L1 mRNA getranscribeerd van de gecombineerde CMV en L1-5'UTR promoter (Figuur 1). Tijdens de RNA processing, is de globine intron gesplitst uit het neomycine-gen. De Neo L1 RNA wordt verpakt, translocatie en geïntegreerd in het genoom als ofwel een volledige lengte of afgeknotte insertie. Zoals aangegeven, kan L1 retrotransposition worden bijgehouden met behulp van FISH probes specifiek voor neomycine gesplitst (figuur 1).
Figuur 2 toont een schematische representatie van de sonde neomycine, met labeled probed dat ruimer en fluorescentie deficiënte gevolg van verschillen in excitatiegolflengten. Merk op dat de CY3 en FITC wekken bij verschillende golflengten dan ethidiumbromide gekleurde DNA.
De dichtheid van metafase chromosomen smeersels werd bepaald door verdunning van de oorspronkelijke voorraadoplossing tot 1: 2, 1: 4, 1: 8 en 1:16 verdunningen en elke spread beoordeeld op dichtheid, distributie en spreads afstand van de kern bij 10X vergroting ( figuur 3A). De resultaten tonen een hoge dichtheid, klonterig en barstte spreads (Figuur 3A-i-ii) en gelijkmatig verdeeld en behoorlijk verdeelde spreads (Figuur 3A-iii-iv). Lage dichtheid smeersels gelijkmatige verdeling voor verdere analyse gekozen.
Chromosoom spreads werden gekleurd met Hoechst kleurstof en verspreiding kwaliteit geëvalueerd op basis van de lengte van chromosomen, ronding van de spreads en inter-chromosoom afstand (Figuur 3B). Deze indices werden beïnvloed door de tijd de cellen werden behandeld met colcemide, hypotonische oplossing Carnoy fixatief en / of de wijze waarop de cellen werden gepakt met chromosomen los. Als cellen werden gedurende een korte periode in hypotone oplossing werd chromosoom spreads strak geknoopt en individuele chromosomen waren moeilijk te visualiseren (figuur 3B-i). Anderzijds, langere incubatie in hypotone oplossing leidde tot breuk van de kernen, verstrooiing chromosomen en / of verlies van chromosomen (figuur 3B-ii). Langere incubaties in colcemide verhoogde het aantal cellen in metafase, maar leiden tot condensatie van chromosomen (figuur 3B-iii). Als zodanig is een goede kwaliteit chromosoom spread vereist optimale incubatieperiode in zowel colcemide en hypotone KCl oplossing. In onze handen, een 90 minuten incubatie in colcemide, 20 in hypotone oplossing bij 37° C en het gebruik van een hete stoom om de cellen barsten bleken optimale omstandigheden voor het verkrijgen van hoge kwaliteit spreads (figuur 3B-iv) zijn.
Chromosoom spreads werden gekleurd voor L1 retrotransposition gebruik van probes die Sneo richten. De probe werd gemerkt met zowel FITC en CY3 te zien dat in beide gevallen L1 retrotransposition wordt alleen gezien in cellen die wildtype L1 (Figuur 4). Geen kleuring werd waargenomen in cellen die de vector backbone alleen (Figuur 4, vergelijk bovenste en onderste panelen per fluorofoor). In onze handen werd probe gedetecteerd in 80-90% van de kernen, de overgrote meerderheid van het signaal dat één retrotransposition gebeurtenissen. We scoorde slechts retrotransposition in kernen met meer dan één inbrengen en verspreiding kwaliteit was altijd onderzocht alvorens FISH.
Figuur 1. Schematische weergave van L1 retrotransposition vector. Diagram toont het proces van het doel prime reverse transcriptie leiden tot volledige of afgeknotte L1 inserties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Gelabelde Sneo en ongelabelde neomycine sondes. De gelabelde probe vertoont minder fluorescentie en is groter in omvang ten opzichte van de niet-gemerkte probe. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Fase-contrast (Bright Field) en Hoechst vlek chromosoom spreads. A) Toont verdunning van de spreads goed gespreid bereidingen te verkrijgen. Schaal bar is 50 micrometer. B) Hoechst vlek chromosoom die de invloed van colcemide, hypotone oplossing, Carnoy Fixatief oplossing en de barsten op spread kwaliteit. Schaal bar is 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. FISH analyse van L1 retrotransposition. Kleuren van Sneo afwezig is in controle cellen, maar die aanwezig zijn in cellen die L1 wildkleur vector. Schaal bar is 10 micrometer.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Methodes zoals whole genome sequencing, inverse PCR en Southern blotting zijn gebruikt om L1 retrotransposition bestuderen. Hoewel deze methoden zijn zeer waardevol bij het lokaliseren waar de L1 inserties plaatsvinden binnen genomen, een verstorende uitdaging voor alle van hen is de noodzaak van in-silico programmeren sequenties weer in elkaar zetten. De FISH werkwijze hierin beschreven is ontworpen om deze werkwijzen te vullen, met name bij studies die analyses van ectopische L1 retrotransposition in gekweekte cellen. De benadering kan worden gebruikt voor zowel kwantitatieve als kwalitatieve evaluatie van retrotransposition gebeurtenissen en toegepast op interfase kernen. Deze methode heeft de nauwkeurigheid van de latere in-silico sequence alignment methoden gebruikt om een buitenbaarmoederlijke L1 insertieplaatsen 16 te bepalen. Aanpassing van repetitieve sequenties kan dubbelzinnig zijn door de vorming van homopolymeren, terwijl repetitieve sequences kan worden verloren tijdens primer amplificatie van template resulteert in ondervertegenwoordiging van repetitieve sequenties. FISH methodologie kan deze problemen te overwinnen, omdat FISH probes kunnen hybridiseren om homopolymeren en zijn waarschijnlijk niet bevooroordeeld tegen intact repeat sequenties 16. Bovendien, in vergelijking met celcultuur gebaseerde retrotransposition assays, FISH kan retrotransposition tarieven bij de enkele kern te bepalen. Als zodanig is deze benadering voorkomt onder en overschatting van retrotransposition tarieven als meerdere inserties kan optreden in enkele kernen 16. Recente gegevens uit NGS hebben bevestigd dat celcultuur gebaseerde methodieken onderschatten retrotransposition frequenties 25.
Het blijft onduidelijk waar jonge L1s voorkeur in te brengen en de vraag of een targeting mechanisme bestaat om deze toevoegingen te richten binnen het genoom. Met de bovengenoemde werkwijze hebben wij aangetoond dat L1 inserts voorkeur in gen armen reregio's van het genoom 16. Anderen hebben aangetoond dat de overvloed aan L1 sequenties toename chromosomen met geringe dichtheid gen 17,18. Samen vormen deze bevindingen suggereren een gereguleerde vorm insteekrichting waarin bedreigingen voor de cel door inbrengen van L1 geminimaliseerd tot "minder actief" gebieden van het genoom. Het patroon van transponeerbaar element beweging in lagere organismen heeft steun uitgeleend aan deze interpretatie. Bijvoorbeeld splijtgist retrotransposon TF1, integreert 95% van de tijd vóór genpromoters en de meerderheid van deze genen zijn betrokken bij stressregulatie 19,20. In gistcellen die toegang stikstof ontbreekt, Ty5 integreert in de ORFs in plaats van heterochromatine regio 21. Experimenten in maïs blijkt dat integratie van DNA transposons tot maïs bonte kleur fenotypen en integratie van Hatvine1 RRM-DNA transposon in het promotorgebied van VvTFL1A gen is aangetoond dat influence de vertakking patroon en de vrucht grootte van wijnstokken 22,23.
De stappen voor het welslagen van de FISH methode hier beschreven zijn de generatie van goede chromosoom spreads en juiste etikettering, zuivering en hybridisatie probes. Als probes niet goed zijn gereinigd, wordt de resulterende hoge achtergrondsignaal bemoeilijken probe lossen binding aan chromosomen. Bij voorkeur moeten probes gel gezuiverd om resterende fluorescentie van dNTPs elimineren. Ook de tijd die spreads worden geïncubeerd in Carnoy fixeeroplossing is belangrijk om goede chromosoom spreads bereiden. Als te lang is, kan de celmembraan voortijdig barsten en veroorzaken chromosoomverlies. Als te kort is, kan het moeilijk zijn om geschikte smeersels vanwege dakafdichting breuk verkrijgen. De hoeveelheid / concentratie van formamide bepaalt de focus van chromatiden en daarom is het belangrijk empirisch te optimaliseren voor het beste resultaat. Alle wasbeurten dienen grondig te ens zijnure dat alle ongebonden probes en secundaire antilichamen worden afgewassen.
Concluderend kan de FISH werkwijze beschreven worden om zowel de volledige lengte en afgeknotte ectopische L1 retrotransposition gebeurtenissen te detecteren en kunnen worden toegepast op andere retrotransposition vectoren gebruikt groene fluorescentie eiwit (GFP) als een indicator retrotransposition cassette. Hoewel volledige lengte L1 inserties kan worden bepaald met deze methode, zal het geen nieuwe endogene afgeknotte inserties onderscheiden door het aantal afgeknotte L1 s in het genoom. De toegankelijkheid van de sonde kan ook worden beperkt door toename heterochromatinevorming 16,24. Echter, de opname van LNA binnen FISH probes worden gebruikt voor hybridisatie probe verbeteren. Detectie van Sneo is afhankelijk van een volledige cyclus van retrotransposition en inserties kleiner dan de probe / verwijderen kan worden gemist.
Voor gedetailleerde beschrijvingen van experimenten in which het gebruik van deze vectoren en de expressie van L1 eiwitten en retrotransposition worden gekenmerkt, verwijzen wij u naar gepubliceerde werken 12,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen potentieel tegenstrijdige belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
- Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
- Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
- Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
- Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
- Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
- Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
- Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
- Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
- Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
- Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
- Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
- Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
- Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
- Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
- Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
- Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
- Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
- Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
- Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
- McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
- Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
- Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
- Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).
