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Biology

एकल न्यूक्लियस स्तर पर लाइन -1 Retrotransposition का विश्लेषण

Published: April 23, 2016 doi: 10.3791/53753
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care and Sleep Medicine, University of Arizona College of Medicine, 2Center for Applied Genetics and Genomic Medicine, University of Arizona College of Medicine

Summary

यहाँ हम HepG2 सेल लाइनों स्थिरतापूर्वक सिंथेटिक लाइन -1 व्यक्त करने का गुणसूत्र फैलता में एकल नाभिक स्तर पर लाइन -1 retrotransposition ट्रैक करने के लिए मछली कार्यप्रणाली को रोजगार।

Introduction

मानव लांग बीच-बीच परमाणु तत्व-1 (लाइन -1 या एल 1) एक स्वायत्त मोबाइल तत्व है कि एक के माध्यम से जीनोम के भीतर प्रसारित "कॉपी और पेस्ट" retrotransposition तंत्र है। एक ठेठ मानव एल 1 ~ 6 KB लंबा है और एक 5'UTR (untranslated क्षेत्र) है कि एक प्रवर्तक के रूप में कार्य करता है के होते हैं, दो खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs): एल 1 और एल 1 -ORF1 -ORF2, और एक Pólya के साथ एक 3'UTR । एक तार-तार डोमेन, आरएनए मान्यता आकृति और सी टर्मिनल डोमेन, जबकि एल 1 -ORF2 प्रोटीन endonuclease है, ट्रांसक्रिप्टेज और सिस्टीन अमीर डोमेन 1,2,3,4,5 रिवर्स: एल 1 पूंछ -ORF1 प्रोटीन तीन अलग डोमेन है। एल 1 -ORF1 न्यूक्लिक एसिड निगरानी गतिविधियों को दर्शाती है, जबकि एल 1 -ORF2, enzymatic गतिविधियों प्रदान करता है retrotransposition 1,2,6 के लिए आवश्यक दोनों प्रोटीन के साथ।

एल 1 retrotransposition का एक चक्र एल 1 के 5'UTR से प्रतिलेखन के साथ शुरू होता है एल 1 -ORF1 दर्शाती है या तो सीआईएस -binding जहां यह अपने आप ही आरएनए संकुल या ट्रांस -binding जहां यह अन्य RNAs पैकेज (यानी, साइन / SVAs / pseudogenes) एल 1 -ORF2p 7 के साथ एक ribonucleoprotein कण (RNP) के रूप में, 8। RNPs नाभिक जहां एल 1 -ORF2p Nicks जीनोमिक डीएनए (gDNA) के endonuclease गतिविधि एक ओह को बेनकाब करने में सरकाना - समूह 9, कि प्रधानमंत्री को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा इस्तेमाल के बदले में है और 3 'के अंत से डीएनए को synthesize आरएनए रिवर्स। रिवर्स संश्लेषण के दौरान, डीएनए का दूसरा किनारा कंपित टूट जाता है जो हस्ताक्षर एल 1 प्रविष्टि दृश्यों (जैसे, TTTTAA) नामक लक्ष्य साइट दोहराव (टीएसडी) 9,10 के लिए फार्म भर रहे हैं बनाने के लिए मूल निक साइट से 7-20 बीपी nicked है। इस प्रक्रिया के रूप में लक्ष्य प्रधानमंत्री रिवर्स प्रतिलेखन (TPRT) में जाना जाता है और inserti की ओर जाता हैTPRT-तरह गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के कुछ कोशिकाओं प्रकार 11 में डाला अनुक्रम के दोनों सिरों पर TSDs साथ एल 1 / अन्य DNAs का पूरा या छोटा प्रतियों की पर। एल 1 retrotransposition भी माध्यम से मध्यस्थता होना दिखाया गया है।

एल 1 retrotransposition हमारे अध्ययन में कार्यरत वेक्टर गैर episomal है और टैग एल 1 -ORF1 और 2p संयुक्त सीएमवी L1-5'UTR प्रमोटरों द्वारा संचालित (चित्रा 1) 12 के होते हैं। इस निर्माण के पहले के संस्करणों खमीर और मानव सेल संस्कृतियों 13,14,15 का उपयोग अध्ययन में वर्णित किया गया है। दो अलग सीएमवी 5 'और 3' में स्थित प्रमोटरों, वेक्टर के समाप्त हो जाती है 3 'के अंत के साथ रिवर्स उन्मुखीकरण में रखा splicing और एकीकरण के बाद neomycin की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए। 3 'अंत में retrotransposition सूचक कैसेट एल 1 -ORFs करने के लिए एक neomycin जीन डाला antisense के होते हैं और एक ग्लोब द्वारा दो हिस्सों में जुदाई से निष्क्रिय प्रदान की गई हैspliced ​​दाता (एसडी) और spliced ​​स्वीकर्ता (एसए) साइटों (चित्रा 1) के साथ intron में। एक गुणसूत्र में एकीकरण पर, एल 1 आम प्रमोटर से लिखित है एक mRNA कि एक bicistronic mRNA और निष्क्रिय neomycin mRNA के होते हैं उपज है। आरएनए प्रसंस्करण के दौरान, ग्लोबिन Intron neomycin जीन से बाहर spliced ​​है एक पूरी तरह कार्यात्मक neomycin जीन बहाल करने के लिए। संकर mRNA सीआईएस में एक RNP में पैक और नाभिक जहां यह TPRT का उपयोग कर सकते हैं या तो पूरी लंबाई या छोटा सम्मिलन के रूप में जीनोम में एकीकृत है में translocated है।

यहाँ हम एक पद्धति स्वस्थानी संकरण (मछली) जांच विशेष रूप से spliced ​​neomycin जीन (SNeo) के निर्देश पर साथ में प्रतिदीप्ति का उपयोग करता है कि एक नाभिक स्तर पर एल 1 -retrotransposiition पैटर्न और सम्मिलन दरों को ट्रैक करने का वर्णन है। दक्षता और पता लगाने की विशिष्टता det को retrotransposition सक्षम और अक्षम निर्माणों और जांच का उपयोग कर पुष्टि की गईect SNeo या neomycin और Intron जंक्शन 16 ग्लोबिन। इस पद्धति में इस तरह के कई सम्मिलन, कॉलोनी प्रतिरोध और अनुकूल क्लोन विस्तार के रूप में सेल संस्कृति आधारित retrotransposition assays, की कमियों का एक कारण है।

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Protocol

नोट: सभी चरणों के कमरे के तापमान पर बाहर किया जाना चाहिए जब तक अन्यथा निर्दिष्ट। कैसे व्यक्तिगत अभिकर्मकों तैयार करने पर जानकारी के लिए अभिकर्मकों अनुभाग को देखें।

1. लेबल एल 1 जांच

नोट: जांच रासायनिक या पीसीआर लेबलिंग से लेबल किया जा सकता है।

  1. रासायनिक लेबलिंग
    1. एक माइक्रोवेव में Tris-एसीटेट EDTA (TAE) बफर, गर्मी में 0.7-1% agarose जेल बनाओ जब तक पिघल, जेल शांत करने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर ethidium ब्रोमाइड (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें। जेल ट्रे में डालो, कंघी जोड़ सकते हैं और जेल कमरे के तापमान पर जमना करने की अनुमति।
    2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर CY3 या FITC साथ SNeo जांच (1-2 ग्राम) लेबल।
      नोट: SNeo अर्थ एस pliced ​​नव mycin जीन retrotransposition का एक पूरा चक्र के बाद व्यक्त की है। जांच के आकार में ~ 1,000 बीपी है। SNeo पीसीआर किसी भी वेक्टर से या जीनोम से परिलक्षित किया जा सकताआईसी डीएनए। Streptavidin-CY3 / FITC लेबलिंग अभिकर्मकों के बारे में जानकारी के लिए सामग्री और अभिकर्मकों की तालिका देखें।
    3. प्रत्येक कुएं में 1x डीएनए लोडिंग बफर, लोड के साथ लेबल SNeo जांच के समाधान मिक्स और 15-20 मिनट के लिए 75-100 वोल्ट पर चलाते हैं।
    4. एक अल्ट्रा वायलेट (यूवी) प्रकाशक का उपयोग कर जांच बैंड कल्पना। ध्यान दें कि SNeo जांच के आकार समायोजित किया जा सकता है और ताला नाभिक एसिड (LNA) भी (चित्रा 2) जोड़ा जा जा सकता है।
    5. कट एक साफ ब्लेड के साथ जेल से SNeo जांच लेबल, solubilize और एक पीसीआर क्लीन अप किट निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार का उपयोग कर जेल से SNeo जांच शुद्ध।
      चेतावनी: कवर सुरक्षा कवच (यानी, प्रयोगशाला कोट और यूवी स्पष्ट चेहरे नकाब) के साथ शरीर के हर हिस्से को उजागर जब देखने और जेल काटने। पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करने के लिए जेल में जानकारी के लिए सामग्री की मेज और अभिकर्मकों देखें।
    6. पुन रन SNeo के 5 μl एक 0.7% agarose जेल पर एक संयुक्त राष्ट्र के लेबल SNeo जांच के साथ जांच लेबल (1.1.1 देखें) चुनाव के लिएफर्म आकार में वृद्धि और संकेत तीव्रता की हानि (चित्रा 2)।
    7. 260 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा लेबल SNeo जांच की राशि यों और 10 एनजी को SNeo जांच पतला / nuclease मुक्त एच 2 ओ में μl aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots।
  2. पीसीआर लेबलिंग (जांच लेबलिंग के लिए वैकल्पिक विधि)
    1. SNeo विशिष्ट प्राइमरों गठबंधन (5'-ggatagcattgggagatatacct -3 'और 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') एक एकल ट्यूब में पीसीआर अभिकर्मकों के साथ: 13.6 μl nuclease मुक्त एच 2 ओ; 0.1 μl dATP, dCTP, dGTP (10 एनएम); 0.05 μl dTTP (10 एनएम); 0.05 μl dUTP बायोटिन / dUTP-FITC / CY3 (10 एनएम); 4 μl बफर 5x टैग जाओ; 0.4 μl जाएं टैग पोलीमरेज़; 1 μl SNeo टेम्पलेट (10 एनजी)। पीसीआर अभिकर्मकों के बारे में जानकारी के लिए सामग्री और अभिकर्मकों की तालिका देखें।
    2. नमूनों की कुल संख्या से गुणा करके प्रत्येक अभिकर्मक की राशि को समायोजित करें।
    3. निम्नलिखित पीसीआर साइकिल पैरामीटर का प्रयोग करेंबढ़ाना और लेबल SNeo जांच करने के लिए है: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 30 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 62 डिग्री सेल्सियस, 60 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र; 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
      नोट: annealing तापमान समायोजित किया जा सकता है या ढाल पीसीआर अन्य जांच के लिए इष्टतम तापमान annealing निर्धारित करने के लिए पूरा किया जा सकता।
    4. खंड 1.1.1, लोड के रूप में 0.7-1% जेल बनाने के लिए और धारा 1.1.4 के रूप में जांच बैंड कल्पना।
    5. कट और धारा 1.1.5 के रूप में चिह्नित कर SNeo जांच शुद्ध।
    6. पुन रन SNeo के 5 μl संयुक्त राष्ट्र के लेबल SNeo जांच आकार में वृद्धि और संकेत तीव्रता के नुकसान की पुष्टि करने के साथ जांच के लेबल (चित्रा 2 देखें)।
    7. 260 एनएम मापने absorbance के द्वारा लेबल SNeo जांच की राशि यों और 10 एनजी को SNeo जांच पतला / nuclease मुक्त एच 2 ओ में μl aliquots

2. तैयारी क्रोमोजोम फैलता

  1. वेक्टर रीढ़ की हड्डी व्यक्त स्थिर क्लोन उत्पन्न (विवादएल) या retrotransposition सक्षम एल 1 मानक चयन के तरीके का उपयोग कर। 12,16 गैर episomal संवाददाताओं प्रतिलेखन की पढ़ाई के साथ निष्कर्षों सहसंबंधी करने के लिए इस्तेमाल कर रहे थे, episomal वैक्टर भी इस्तेमाल किया जा सकता है। स्थिरतापूर्वक नियंत्रण या एल 1 वेक्टर (प्रति 10 सेमी प्लेट 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं की जरूरत है, के रूप में बनाया प्लेट आकार में समायोजन के साथ) पूर्ण विकास मीडिया में व्यक्त कोशिकाओं को विकसित। HepG2 कोशिकाओं के लिए, का उपयोग RPMI-1600, 10% FBS और hygromycin के 200 माइक्रोग्राम / एमएल। 37 डिग्री सेल्सियस पर 70% संगम संस्कृतियों आगे बढ़ें और 5% सीओ 2।
    नोट: मध्यम विकास के चुनाव सेल प्रकार पर निर्भर है। यह देखते हुए कि यहां इस्तेमाल किया plasmids दोनों hygromycin और neomycin के लिए चयन कैसेट ले, क्लोन के स्थिर चयन भी hygromycin पर चयन के बाद neomycin के साथ किया जा सकता है, लेकिन neomycin की राशि प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए सहनशीलता का स्तर स्थापित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  2. colcemid (0.4 माइक्रोग्राम / एमएल) संस्कृति के माध्यम से जोड़ें और 90 मिनट metaph पर कोशिकाओं को गिरफ्तार करने के लिए सेतेएएसई। तो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग कर, इष्टतम metaphase गिरफ्तारी के अनुभव से लिए colcemid और जोखिम के समय (60, 90, और 120 मिनट) का इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण।
  3. धो कोशिकाओं कोशिकाओं को 3-5 0.25% की मिलीलीटर trypsin समाधान जोड़ने और 5 मिनट के लिए सेते कोशिकाओं को अलग से 1x Dulbecco के पीबीएस (DPBS), Trypsinize के 10 मिलीलीटर के साथ 2x। 10% FBS युक्त मीडिया के एक बराबर राशि के साथ trypsin निष्क्रिय।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, सेल गोली से मध्यम aspirate और DPBS के साथ कोशिकाओं को धो लें। महाप्राण सभी DPBS, DPBS के 200 μl छोड़ने कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए। सुनिश्चित करें कोशिकाओं में अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं और सभी झुरमुटों बिखरे हैं कि। मिश्रण और गुच्छों को फैलाने और vortexing से बचने के लिए चंचल या कोमल pipetting का प्रयोग करें।
  5. Hypotonic समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें (यानी, 75 मिमी KCl) वह यह है कि 37 डिग्री सेल्सियस बूंद-वार करने के लिए पूर्व गर्म क्षैतिज 15 मिलीलीटर ट्यूब घूर्णन करते हुए और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। सामग्री और Reagen की तालिका देखेंप्राप्त और hypotonic समाधान करने के बारे में जानकारी के लिए TS।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और दोहराने के लिए 120 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 2.4 कदम - 2.5 3x प्रत्येक धोने के बाद कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए hypotonic समाधान के लगभग 200 μl छोड़ने। सुनिश्चित करें कि 3 washes के अंत में, गोली दिख सफेद और सूजन है।
  7. Carnoy लगानेवाला समाधान के 200 μl में गोली पुनः निलंबित और 1 बनाना: Carnoy लगानेवाला समाधान में 8, 01:16 dilutions: 2: 1, 4, 1। ऊपर लगभग 1 सेमी से एक सूखी साफ स्लाइड पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 μl ड्रॉप और तुरंत 30 सेकंड के लिए उबलते पानी से गर्म भाप में फैल मुक्त पक्ष बेनकाब। कैसे Carnoy लगानेवाला समाधान बनाने के लिए पर सामग्री और जानकारी के लिए अभिकर्मकों की तालिका देखें।
  8. 0.1 माइक्रोग्राम / साथ कमरे के तापमान पर फैलता सूखी, दाग मिलीलीटर Hoechst-33342 Coplin जार में 15-20 मिनट के लिए विसर्जन के द्वारा और धोने DPBS के साथ 3x। कैसे Hoechst-33342 समाधान बनाने के लिए पर सामग्री और जानकारी के लिए अभिकर्मकों की तालिका देखें।
    9. <ली> देखें 40X बढ़ाई प्रतिदीप्ति / चरण विपरीत माइक्रोस्कोप पर फैलता है। प्रसार तैयारी के अनुकूलन के बाद, फैलता Hoechst-33342 के साथ दाग नहीं होना चाहिए। देखें 10X बढ़ाई चरण विपरीत माइक्रोस्कोप पर फैलता प्रसार गुणवत्ता और जुदाई परिणाम अनुभाग में उल्लिखित के रूप में निर्धारित करने के लिए (चित्रा 3 देखें)।
  9. का चयन करें और स्लाइड के विपरीत दिशा में एक हीरा बिंदु मार्कर के साथ अच्छे फैलता सर्किल (यानी, फैल मुक्त पक्ष)।
  10. स्टोर एक महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फैलता है। नमी के लिए जोखिम से बचें।

3. स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति (मछली)

  1. स्थिर और फैलता dehydrating
    नोट: यदि -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत संतुलित करना metaphase गुणसूत्र कमरे के तापमान को फैलाता है। प्राप्त और अभिकर्मकों बनाने के लिए कैसे पर सामग्री और जानकारी के लिए अभिकर्मकों की तालिका देखें।
    1. सेते metaphase गुणसूत्र के लिए 200 μl RNase एक साथ फैलता है37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे।
    2. धो 5 मिनट प्रत्येक 10 मिमी एचसीएल समाधान के साथ rinsing द्वारा पीछा के लिए दो बार 2x-एसएससी बफर में स्लाइड।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1% पेप्सिन के साथ फैलता है सेते हैं, विआयनीकृत एच 2 ओ से कुल्ला और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 2 एक्स-एसएससी बफर के साथ दो बार धोने।
    4. 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ फैलता है सेते हैं और 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार 2x एसएससी बफर में धो लें।
    5. 70%, 80%, और 95% इथेनॉल: इथेनॉल श्रृंखला में 2 मिनट के लिए incubating से फैल निर्जलीकरण।
    6. हवा शुष्क स्लाइड।
  2. संकरण एल 1 -labeled retrotransposition जांच के साथ फैलता है (यानी, SNeo)
    चेतावनी: प्रत्यक्ष लेबल जांच के लिये, दूर प्रकाश से हर समय रहते हैं। प्राप्त और अभिकर्मकों बनाने के लिए कैसे पर सामग्री और जानकारी के लिए अभिकर्मकों की तालिका देखें।
    1. 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर संकरण बफर करने के लिए SNeo के 30 एनजी, गर्मी जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए शांत।
    2. ई SNeo जांच के समाधान के 30 μl जोड़ेACH प्रसार, coverslip के साथ कवर और रबर सीमेंट के साथ किनारों को सील। कोई बुलबुला गठन किया जाता है।
    3. एक गर्मी ब्लॉक पर 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड गर्मी, धीरे-धीरे 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान ड्रॉप, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे humidified कक्ष में रातोंरात सेते हैं।
  3. धुलाई और देखना (या माध्यमिक एंटीबॉडी के अलावा)
    चेतावनी: प्रत्यक्ष लेबल जांच के लिये, दूर प्रकाश से हर समय रहते हैं।
    नोट: सामग्री और कैसे तैयार करने के बारे में जानकारी के लिए अभिकर्मकों की तालिका देखें। पर्याप्त मात्रा पूरे गुणसूत्र प्रसार को कवर करने के उपयोग की सिफारिश की है। याद रखें कि अधिक मात्रा जब coverslip जोड़ा जाता है खो जाएगा।
    1. 2x एसएससी बफर में विसर्जित स्लाइड coverslips हटा दें।
    2. स्लाइड 5 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर 2x-एसएससी बफर में विसर्जन से धो लें।
    3. स्लाइड 5 मिनट, 2x के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर धो बफर में विसर्जन से धो लें।
    4. स्लाइड 10 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर 0.1x एसएससी बफर में विसर्जन से धो लें।
    5. स्लाइड 10 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर 2x एसएससी बफर में विसर्जन से धो लें।
      नोट: जगह एक पानी के स्नान में सिफारिश बफर युक्त एक Coplin जार, 45 डिग्री सेल्सियस के तापमान को समायोजित।
    6. कमरे के तापमान को शांत स्लाइड और पता लगाने के बफर में स्लाइड्स संतुलित करना।
    7. प्रत्यक्ष लेबल जांच के लिये, चरण 3.4.10 को छोड़।
    8. अप्रत्यक्ष लेबल जांच के लिये, 20-30 मिनट के लिए बफर अवरुद्ध और ब्लॉक में DPBS में 3x धो लें।
    9. 1 घंटे के लिए (बफर अवरुद्ध में जैसे, 5 माइक्रोग्राम / एमएल streptavidin-FITC, या αCY3) माध्यमिक एंटीबॉडी के 50 μl के साथ सेते हैं।
    10. दो बार 5 मिनट के लिए 2x एसएससी में स्लाइड्स धो लें।
    11. 10 मिनट के लिए Hoechst-33342 समाधान (0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ Counterstain।
      नोट: इस धुंधला जांच के साथ सह स्थानीयकरण के लिए क्रोमोसोम दाग किया जाता है।
    12. DPBS 3x में धो लें, बढ़ते मध्यम की एक बूंद जोड़ने के लिए, एक coverslip जगह और नेल पॉलिश के साथ किनारों को सील।
    13. प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग एल 1 retrotransposition विश्लेषण 40X माgnification।

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Representative Results

एल 1 retrotransposition वेक्टर के एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में प्रस्तुत किया है। वेक्टर एल 1 ORFs को antisense अभिविन्यास में एक neomycin जीन है कि भावना अभिविन्यास में एक ग्लोबिन Intron से बाधित और द्वारा एसडी और एसए साइटों sandwiched है के होते हैं। स्थिरतापूर्वक एक गुणसूत्र में एकीकृत है, एल 1 mRNA संयुक्त सीएमवी और L1-5'UTR प्रमोटर (चित्रा 1) से लिखित है। आरएनए प्रसंस्करण के दौरान, ग्लोबिन Intron neomycin जीन से बाहर spliced ​​है। नव एल 1 आरएनए, पैक translocated और या तो एक पूरी लंबाई या छोटा प्रविष्टि के रूप में जीनोम में एकीकृत है। संकेत के रूप में, एल 1 retrotransposition spliced ​​neomycin (चित्रा 1) के लिए विशेष जांच का उपयोग कर मछली द्वारा लगाया जा सकता है।

चित्रा 2 labele साथ, neomycin जांच का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता हैडी की जांच की है कि उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में मतभेद के कारण आकार और प्रतिदीप्ति की कमी में बड़ा है। ध्यान दें कि CY3 और FITC ethidium ब्रोमाइड दाग डीएनए की तुलना में अलग तरंग दैर्ध्य में उत्तेजित।

2, 1: 4, 1: 8 और 01:16 dilutions और 10X बढ़ाई प्रत्येक प्रसार घनत्व, वितरण और नाभिक से फैलता की दूरी के लिए मूल्यांकन (metaphase गुणसूत्र फैलता का घनत्व 1 में मूल शेयर समाधान गिराए द्वारा निर्धारित किया गया था चित्रा 3)। परिणाम उच्च घनत्व, clumpy दिखाने के लिए और फैलता है (चित्रा 3 ए-मैं द्वितीय) बाहर फट, साथ ही समान रूप से वितरित और अच्छी तरह से स्थान फैलता है (चित्रा 3 ए-III चतुर्थ)। कम घनत्व फैलता भी वितरण के साथ बाद के विश्लेषण के लिए चुने गए हैं।

क्रोमोजोम फैलता के साथ Hoechst डाई और प्रसार गुणवत्ता के गुणसूत्रों की लंबाई, एस की गोलाई के आधार पर मूल्यांकन दाग थेpreads और अंतर-गुणसूत्र दूरी (चित्रा 3 बी)। इन सूचकांकों लंबाई समय की कोशिकाओं colcemid, hypotonic समाधान, Carnoy लगानेवाला समाधान और / या जिस तरह से कोशिकाओं के गुणसूत्रों को रिहा करने का भंडाफोड़ किया गया साथ इलाज किया गया से प्रभावित थे। कोशिकाओं hypotonic समाधान में एक छोटी अवधि के लिए incubated रहे थे, तो गुणसूत्र फैलता कसकर knotted हो गया है और अलग-अलग गुणसूत्रों (चित्रा 3 बी-आई) कल्पना करने के लिए मुश्किल थे। दूसरी ओर, hypotonic समाधान में अब ऊष्मायन नाभिक का टूटना में हुई, गुणसूत्रों के बिखरने, और / या गुणसूत्रों की हानि (चित्रा 3 बी-II)। Colcemid में अब incubations metaphase में कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई है, लेकिन गुणसूत्रों का संक्षेपण के लिए नेतृत्व (चित्रा 3 बी-iii)। जैसे, एक अच्छी गुणवत्ता के गुणसूत्र प्रसार दोनों colcemid और hypotonic KCl समाधान में इष्टतम ऊष्मायन अवधि की आवश्यकता है। हमारे हाथ में, एक 90 मिनट 37 पर hypotonic समाधान में colcemid, 20 में ऊष्मायनडिग्री सेल्सियस और कोशिकाओं फट करने के लिए एक गर्म भाप का उपयोग उच्च गुणवत्ता फैलता है (चित्रा 3 बी-iv) की पीढ़ी के लिए इष्टतम स्थितियों होना पाया गया है।

क्रोमोजोम फैलता एल 1 retrotransposition जांच जो SNeo लक्ष्य का उपयोग करने के लिए दाग रहे थे। जांच दिखाने के लिए कि दोनों ही मामलों में एल 1 retrotransposition जंगली प्रकार एल 1 व्यक्त कोशिकाओं में ही देखा जाता है दोनों FITC और CY3 के साथ चिह्नित किया गया (चित्रा 4)। कोई धुंधला अकेले वेक्टर रीढ़ की हड्डी व्यक्त कोशिकाओं में देखा गया था (चित्रा 4, प्रत्येक fluorophore के लिए ऊपर और नीचे के पैनल की तुलना)। हमारे हाथ में, जांच संकेत संकेत एकल retrotransposition घटनाओं का प्रतिनिधित्व करने का भारी बहुमत के साथ नाभिक के 80-90% में पाया गया था। हम केवल एक से अधिक प्रविष्टि के साथ नाभिक में retrotransposition रन बनाए और प्रसार गुणवत्ता हमेशा मछली से पहले जांच की गई थी।


चित्रा 1. एल 1 retrotransposition वेक्टर के योजनाबद्ध आरेख। आरेख लक्ष्य प्रधानमंत्री रिवर्स प्रतिलेखन पूर्ण या छोटा एल 1 सम्मिलन के लिए अग्रणी करने की प्रक्रिया को दर्शाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. लेबल SNeo और लेबल हटाया गया neomycin जांच। लेबल जांच कम प्रतिदीप्ति दर्शाती है और लेबल हटाया गया जांच की तुलना में आकार में बड़ा है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3. चरण विपरीत (उज्ज्वल क्षेत्र) और Hoechst दाग गुणसूत्र फैलता है। ए) दिखाता है अच्छी तरह से स्थान की तैयारी प्राप्त करने के लिए फैलता के कमजोर पड़ने। स्केल बार 50 माइक्रोन। बी) Hoechst दाग colcemid, hypotonic समाधान, Carnoy लगानेवाला समाधान और प्रसार गुणवत्ता पर फोड़ के प्रभाव दिखा गुणसूत्र है। स्केल बार 10 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा एल 1 retrotransposition 4. मछली विश्लेषण। SNeo का धुंधला नियंत्रण कक्षों में अनुपस्थित है, लेकिन एल 1 wildtype वेक्टर व्यक्त कोशिकाओं में मौजूद है। स्केल बार 10 माइक्रोन है।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस तरह पूरे जीनोम अनुक्रमण, उलटा पीसीआर और दक्षिणी सोख्ता के रूप में के तरीके में एल 1 retrotransposition अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि इन तरीकों का पता लगाने के लिए जहां एल 1 सम्मिलन जीनोम के भीतर होने में अत्यंत मूल्यवान हैं, उनमें से सभी के लिए एक चुनौती confounding में सिलिको programing के लिए जरूरत के दृश्यों पुनः है। यहाँ मछली वर्णित पद्धति, इन तरीकों में पूरक करने के लिए डिज़ाइन किया गया है विशेष रूप से संवर्धित कोशिकाओं में अस्थानिक एल 1 retrotransposition के विश्लेषण की आवश्यकता के अध्ययन के मामले में। दृष्टिकोण दोनों मात्रात्मक और गुणात्मक retrotransposition घटनाओं के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और नाभिक Interphase लिए आवेदन किया। इस पद्धति बाद में सिलिको अनुक्रम संरेखण अस्थानिक एल 1 प्रविष्टि साइटों 16 निर्धारित करने के लिए नियोजित तरीके की सटीकता समेटे हुए है। दोहराव दृश्यों के संरेखण homopolymers के गठन के कारण अस्पष्ट हो सकता है, जबकि दोहराव sequenसीईएस दोहराव दृश्यों की underrepresentation में जिसके परिणामस्वरूप टेम्पलेट का प्राइमर प्रवर्धन के दौरान खो दिया जा सकता है। मछली कार्यप्रणाली इन समस्याओं को दूर कर सकते हैं क्योंकि मछली जांच homopolymers के लिए पानी रखना और बरकरार दोहराने दृश्यों 16 के खिलाफ पक्षपाती होने की उम्मीद नहीं कर सकते हैं। इसके अलावा, सेल संस्कृति आधारित retrotransposition assays की तुलना में, मछली retrotransposition दरों एकल नाभिक स्तर पर निर्धारित कर सकते हैं। जैसे, इस दृष्टिकोण दोनों के तहत और retrotransposition दरों के रूप में कई सम्मिलन एकल नाभिक 16 में हो सकता है के आकलन के ऊपर से बचाता है। NGS से प्राप्त हाल ही के डेटा की पुष्टि की है कि सेल संस्कृति आधारित तरीके retrotransposition आवृत्तियों 25 कम।

यह स्पष्ट नहीं हुआ है जहां युवा L1s डालने के लिए पसंद करते हैं और एक को लक्षित तंत्र जीनोम के भीतर इन सम्मिलन के निर्देशन के लिए मौजूद है। ऊपर पद्धति का प्रयोग हम पता चला है कि एल -1 जीन गरीब पुन में रियायत के तौर पर सम्मिलित करता हैजीनोम 16 वर्ष की gions। दूसरों को पता चला है कि एल 1 दृश्यों की बहुतायत एक कम घनत्व जीन 17,18 साथ गुणसूत्रों में वृद्धि हुई है। साथ में, इन निष्कर्षों प्रविष्टि की एक विनियमित मोड जहां सेल के लिए खतरे जीनोम के "कम सक्रिय" क्षेत्र में एल 1 की प्रविष्टि से कम कर रहे हैं सुझाव देते हैं। कम जीवों में transposable तत्व आंदोलन की तर्ज इस व्याख्या को समर्थन दिया है। उदाहरण के लिए, विखंडन खमीर retrotransposon, TF1, जीन प्रमोटरों के ऊपर समय के 95% एकीकृत करता है और इन जीनों के बहुमत तनाव विनियमन 19,20 में शामिल रहे हैं। खमीर कोशिकाओं है कि नाइट्रोजन के लिए उपयोग की कमी में, Ty5 हेट्रोक्रोमैटिन क्षेत्रों में 21 के बजाय ORFs में एकीकृत करता है। मक्का में प्रयोगों से पता चला है डीएनए transposons की है कि एकीकरण विचित्र मकई रंग phenotypes और VvTFL1A जीन के प्रमोटर क्षेत्र में Hatvine1-RRM डीएनए transposon के एकीकरण के लिए नेतृत्व प्रभावों को दिखाया गया हैशाखाओं में बंटी पैटर्न और grapevines 22,23 का फल आकार सीई।

कदम मछली कार्यप्रणाली यहाँ विस्तृत की सफलता के लिए महत्वपूर्ण अच्छा गुणसूत्र फैलता है और उचित लेबलिंग, शुद्धि और जांच के संकरण की पीढ़ी के हैं। जांच ठीक से साफ नहीं कर रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि संकेत यह मुश्किल गुणसूत्रों के लिए बाध्य जांच को हल करने के लिए कर देगा। अधिमानतः, जांच जेल शुद्ध dNTPs से अवशिष्ट प्रतिदीप्ति समाप्त करने के लिए होना चाहिए। इसके अलावा, समय की लंबाई कि फैलता Carnoy लगानेवाला समाधान में incubated रहे हैं अच्छा गुणसूत्र फैलता तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है। बहुत लंबा है, तो समय से पहले ही कोशिका झिल्ली फट और गुणसूत्र हानि हो सकती है। बहुत छोटा है, तो यह कमी झिल्ली फटने की वजह से उपयुक्त फैलता प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है। formamide की राशि / एकाग्रता क्रोमेटिडों का फोकस निर्धारित करता है और इसलिए यह सबसे अच्छा परिणाम के लिए अनुभव से अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। सभी washes सत्ता के लिए पूरी तरह से होना चाहिएUre कि सभी अनबाउंड जांच और माध्यमिक एंटीबॉडी धुल जाते हैं।

अंत में, मछली कार्यप्रणाली यहाँ वर्णित दोनों पूरी लंबाई और छोटा कर दिया अस्थानिक एल 1 retrotransposition घटनाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक retrotransposition सूचक कैसेट के रूप में हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) का उपयोग अन्य retrotransposition वैक्टर के लिए लागू किया जा सकता है। हालांकि पूरी लंबाई एल 1 सम्मिलन इस पद्धति का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है, यह जीनोम के भीतर छोटा एल 1 रों की संख्या के कारण नए अंतर्जात छोटा सम्मिलन विचार नहीं किया जाएगा। जांच की पहुंच भी वृद्धि हेट्रोक्रोमैटिन गठन 16,24 से प्रतिबंधित किया जा सकता है। हालांकि, मछली जांच के भीतर LNA के शामिल किए जाने के मामले की जांच annealing बढ़ाने के लिए नियोजित किया जा सकता है। SNeo की जांच retrotransposition का एक पूरा चक्र पर प्रासंगिक है और जांच / विलोपन याद किया जा सकता है की तुलना में छोटे सम्मिलन।

जो में प्रयोगों के विस्तृत विवरण के लिएज इन वैक्टर का उपयोग करें और एल 1 प्रोटीन और retrotransposition की अभिव्यक्ति की विशेषता है, पर प्रकाशित कृपया देखें काम करता 12,16।

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Disclosures

लेखकों कोई संभावित प्रतिस्पर्धा के हितों की घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Labeling Probes
Go Tag DNA polymerase Promega M3178
GO Tag 10x colorless buffer Promega M3178
Individual dNTP Sigma DNTP10 Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water.
dUTP-16-Biotin (0.5 mM) Roche 11093070910
dUTP-FITC (0.5 mM) Thermo Scientific R0101
dUTP-CY3 (0.5 mM) Sigma GEPA53022
MIRUS FISH Labeling Kit MIRUS MIR3625
MIRUS FISH Labeling Kit MIRUS MIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up kit  Qiagen 1410/0030 Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR Machine Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product.
Agarose Sigma A9539
Preparing chromosome Spreads
Colcemid Life Technologies  15212-012 Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml
1 M KCl Sigma P9541 Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution
Carnoy Fixative Solution Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime.
Methanol Sigma 322415
Acetic acid Sigma 320099
Hoechst-33342 Thermo Scientific 62249 Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml.
Diamond Point Marker Thermo Scientific 750
Frosted Slides Thermo Scientific 2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies  R001100 To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media.
Cover slides VWR 48366067
Coplin Jars Thermo Scientific 107
Heat Block Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended.
Beaker (600 ml) Sigma CLS1003600 Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes.
Nikon Microscope Nikon 125690 Any microscope can be used to look at spread quality.
Reagents and Materials for FISH
Trisodium citrate Sigma S1804
Sodium Chroride Sigma S3014
Formamide Sigma F9037
Tween-20 Sigma F1379
Detran Sulfate Sigma D8906
SDS Sigma L3771
Salmon Sperm DNA Life Technologies  15632-011
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A8531
HCl (N) Sigma 38283
Ethyl Alcohol Sigma 459844
Methanol Sigma 322415
DPBS Life Technologies  14190-250
NaOH Sigma S8045
Rnase A Sigma R4642
Pepsin Sigma P6887
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
Hoechst-33342 Thermo Scientific 62249 Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml.
Rubber Cement/Cytobond Sealant  2020-00-1
Seven Coplin Jars Thermo Scientific 107
Dark Humidified chamber Sigma CLS2551
Cover slides VWR 48366067
Dry Digital Heat Block VWR 13259
Fluorescence Microscope
20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C.
1 mg/ml of Rnase A Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time.
1% Pepsin Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time.
4% Paraformaldehyde (4% PFA) Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde.
Wash Buffer Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O.
Hybridization Buffer Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount.
Detection Buffer Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer.
Blocking Buffer Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer.
Dehydrating Solution Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions.

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References

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Tags

जैव रसायन अंक 110 retrotransposon, मछली Ribonucleoprotein कणों (RNP) HepG2 neomycin गुणसूत्र फैलता
एकल न्यूक्लियस स्तर पर लाइन -1 Retrotransposition का विश्लेषण
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Bojang, P., Ramos, K. S. Analysis of … More

Bojang, P., Ramos, K. S. Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level. J. Vis. Exp. (110), e53753, doi:10.3791/53753 (2016).

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