genotypering van Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54623

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Hans U. Graber¹

¹Institute for Food Sciences IFS, Agroscope

Introduction

Staphylococcus (S. aureus) is bekend als de voornaamste pathogeen wereldwijd verantwoordelijk voor intramammair infecties (IMI) bij runderen ^1. De studie van Fournier et al. ² aangetoond in Zwitserse koeien en de studies van Cosandey et al. ³ en Boss et al. ⁴ in koeien van de 12 Europese landen die S. aureus geïsoleerd van runderen IMI is een genetisch heterogene groep. Door PCR amplificatie van het 16S-23S rRNA spacergebied intergenische (RS-PCR), werden een totaal van 17 genotypen oorspronkelijk ontdekt in 101 epidemiologisch onafhankelijke isolaten ^2. Genotype B en C genotype (GTC) waren het meest voorkomende (80%), terwijl de andere 15 genotypes (GT), kwam zelden voor, elke maken van 1 tot 4% van alle isolaten. Op Europees niveau ^3, GTB, GTC, GTF, GTI, en GTR waren de belangrijkste genotypen bestaande uit 76% van alle geanalyseerde stammen (n = 456). GTB was gelegen in Midden-Europa WOverwegende dat de andere genotypen werden op grote schaal verspreid. De resterende 24% van de -stammen 41 genotypes, velen werden echter slechts eenmaal waargenomen.

De studies van Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ³ en Graber et al. ⁵ verder aangetoond dat de genotypen sterk geassocieerd met virulentie gen patroon, evenals bij de Zwitserse als op Europees niveau. De studie wees verder uit enorme verschillen in de IMI-prevalentie onder S. aureus GTB, GTC en de andere genotypes ^2,5: overweegt GTB, tot 87% van de koeien in een kudde werden geïnfecteerd door deze genotype. Bij GTC en de andere genotypen echter IMI werd alleen gevonden in 1-2 koeien van een kudde.

IMI veroorzaakt door S. aureus, gewoonlijk leidt tot ontsteking van de overeenkomstige borstklieren en een toename van inflammatoire cellen in melk. Als gevolg daarvan, de somatische cel counts in melk (SCC), de belangrijkste indicator van de kwaliteit van de melk in de meeste landen, wordt verhoogd leidt tot een daling melkprijs of zelfs levering stop.

Naast de RS-PCR van Fournier et al. ^2, zijn andere typen werkwijzen beschreven voor subtypering runderen stammen van S. aureus ^8-11. Twee voorkomende zijn onder andere een spa typen ¹² en Multi Locus Sequence Typing (MLST) ^13. Eerstgenoemde is een basis van DNA sequentiebepaling de variabele spacergebied van Staphylococcus spa gen dat codeert voor proteïne A, terwijl de laatstgenoemde de sequentie van 7 housekeeping genen vereist. Dit betekent dat één en zeven ¹² PCR's ¹³ respectievelijk moeten worden uitgevoerd, gevolgd door amplicon zuivering sequentiereactie en analyse met gebruikmaking van specifieke apparatuur. Vergeleken met RS-PCR, deze methoden vereisen een aanzienlijke extra inspanning in het laboratorium als gevolg een lage monsterdoorvoer en hoge kosten. Dethroughput is bijzonder laag voor PFGE. Gezien de resolutie van deze methoden voor runderen stammen van S. aureus, RS-PCR minstens even goed als spa typen ⁴ en beter dan MLST ⁴ of ¹⁵ PFGE.

Al deze methoden, met inbegrip van binaire typering ¹³ demonstreerden hun effectiviteit bij het verkrijgen van meer inzicht in de pathogenese van runderen IMI veroorzaakt door S. aureus, maar vanwege de genoemde beperkingen zijn ze minder geschikt voor grote klinisch onderzoek. Bovendien, genotypering door RS-PCR zoals beschreven door Fournier et al. ² maakt betrouwbare voorspelling van de epidemiologische en potentieel pathogene S. aureus die betrokken zijn bij runderen IMI, twee belangrijke waarden in de klinische diergeneeskunde.

Protocol

1. Staphylococcus aureus isolaten

1. Verspreid 10 pl S. aureus voorraad cultuur of een kolonie gekweekt op een selectief medium op Columbia agar-platen die 5% schapen bloed (BA).
2. Incubeer aëroob bij 37 ° C gedurende 18 uur tot 24 uur.

2. DNA Extraction

1. Bereid TEL buffer die 10 mM Tris-HCl en 10 mM _Na2 EDTA, pH 8,5. Aliquots en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten.
2. Verzamel 1 kolonie van BA met een steriele plastic lus of een steriele houten tandenstoker en resuspendeer in 100 ul TEL. Gebruik 1,5 ml buizen met schroefdoppen.
3. Incubeer bij 95 ° C gedurende 10 minuten. Daarna plaatst de monsters onmiddellijk op nat ijs.
4. Verdun de monsters 1: 100 in _H2O geschikt voor PCR (= matrijs DNA voor PCR). De onverdund en verdund monsters bij -20 gedurende 1 maand bewaard ° C.

3. RS-PCR

H2O, 12,5 gl Taq Master Mix, 2 pi G1 primer 10 uM, 2 pl L1 primer 10 uM en 7 pl matrijs-DNA dat overeenkomt met ongeveer 30 ng zuivere DNA ^2.
1. Voer het volgende programma fietsen in een standaard PCR cycler: 15 min 95 ° C, gevolgd door 27 cycli bestaande uit 94 ° C gedurende 1 minuut, gevolgd door een 2 min helling en hybridisatie bij 55 ° C gedurende 7 min. Na nog eens 2 min helling verlengen bij 72 ° C gedurende 2 minuten. PCR beëindigd met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten, gevolgd door afkoeling tot 4 ° C.
   OPMERKING: De PCR producten kan gedurende 5 dagen worden bewaard bij -20 ° C.
2. Voor elke uitvoering van RS-PCR omvatten een positieve controle, dat wil zeggen een monster met een bekend genotype (normaal GTB) en een negatieve controle (H ₂ O).

4. elektroforese

1. Gebruik commerciële geminiaturiseerde elektroforese kit voor DNA (MED kit) tezamenmet een bioanalyzer aangesloten op een pc en de geïnstalleerde software. Bestudeer de bijbehorende handleiding van de fabrikant zorgvuldig.
2. Stel de chip priming station en stel de spuit clip volgens de handleiding van de fabrikant.
3. Bereid de gel-dye mix volgens de handleiding van de fabrikant.
4. Het laden van de gel-kleurstof mix (volgens de handleiding van de fabrikant).
   1. Equilibreren de gel-kleurstof mengsel tot kamertemperatuur gedurende 30 min vóór gebruik.
   2. Zet nieuwe DNA-chip op de chip priming station. Pipetteer 9 ul van gel-kleurstof in de goed gemarkeerde G.
   3. Zorg ervoor dat de zuiger wordt geplaatst op 1 ml en sluit vervolgens de chip priming station. Druk op de zuiger totdat het wordt vastgehouden door de spuit clip. Wacht precies 30 seconden daarna de spuit clip los te maken.
   4. Wacht 5 sec. Trek langzaam terug zuiger tot 1 ml positie.
   5. Open chip priming station en pipet 9 ul van gel-kleurstof in beide putten gemarkeerd als 'G'.
5. Het laden van de MArker
   1. Pipetteer 5 ul van merker in alle 12 monster putten en in de ladder ook. Geen van deze 13 putten leeg te laten.
6. Het laden van de Ladder en de monsters.
   1. Pipetteer 1 pl DNA ladder naar de goed aangegeven met de ladder teken.
   2. Pipetteer 1 pl monster (gebruikte putjes) of 1 pl gedeïoniseerd water (ongebruikte wells).
   3. Zet de chip horizontaal in de adapter en vortex gedurende 1 min bij 2400 rpm.
   4. Voer de chip in de bioanalyzer binnen 5 min.
7. Het uitvoeren van de Analyse
   1. Start de bioanalyzer en de aangesloten computer. Open de software.
   2. Open het deksel van de bioanalyzer en plaats de chip in de chip houder (de chip past maar op één manier). Sluit het deksel voorzichtig.
   3. In het Instrument context van de software te kiezen "Elektroforese"> "dsDNA"> "DNA 7500". Accepteer het huidige bestand voorvoegsel van de software of wijzigen.
   4. Klik op de startknop in de software. Voer het monster namen in de software. Als de chip run is voltooid (na ongeveer 30 min) het einde van Run bericht verschijnt in de bioanalyzer software.
   5. Verwijder de chip en reinig de elektroden van de bioanalyzer volgens de instructies van de fabrikant.

5. Afleiden het Genotype van de elektroforese Profile

1. Laad de Mahal software (software is gratis verkrijgbaar bij de auteurs).
2. -invoer van gegevens in de Mahal software: "File"> "Import Reference Data"
3. Open de elektroforese uitgevoerd in de context van de gegevens bioanalyzer software. Selecteer een elektroforese-profiel van één monster.
4. Controleer of de betreffende pieken.
   1. Gebruik de Mahal software om te controleren of de desbetreffende pieken: 'Extra'> 'Mean Fluorescentie ". Steek in het vak "Fluorescentie"de fluorescentiewaarden aangeduid als fluorescentie-eenheden (FU) als ze kunnen worden afgelezen van de bioanalyzer software. Steek de 4 (3) pieken met de hoogste fluorescentie in oplopende volgorde en gescheiden door een komma. Voorbeeld: 126.130.132.137.
      OPMERKING: Indien niet al deze pieken FU worden aangegeven door de bioanalyzer software, moeten ze worden geschat door ze te lezen uit de grafiek.
5. Druk op de knop "Berekenen". Een piek is relevant als de waargenomen fluorescentie de waarde die in het vak "Minimal piekhoogte" overschrijdt.
6. Afleiden het genotype.
   1. Invoegen in het Mahal tekstvak "Input Peaks (bp)" de maten in bp van alle relevante pieken in oplopende volgorde en gescheiden door een komma. Voorbeeld: 440.462.519.579.637.
      OPMERKING: Indien niet al deze piek maten zijn aangegeven door de bioanalyzer software, moeten ze worden geschat door ze te lezen uit de grafiek.
7. Druk op de knop "Berekenen".
8. In de lijstdoos, kijk voor de minimale kwadraat mahalanobis-afstand "D2M". Als het overeenkomstige P-waarde recht is ≥0.05 dan de kans is ≥5% dat de nulhypothese H ₀ verworpen (H _0: de waargenomen en het referentieprofiel identiek zijn), wat betekent dat de waargenomen profiel wordt geaccepteerd identiek zijn het referentieprofiel van het vermelde genotype.
9. Als D2M is minimaal, maar het gebied van de overeenkomstige P-waarde leeg verwerpen H ₀ met een kans <5%.
   Opmerking: Dit betekent dat de profielen ongelijke hoewel D2M minimaal. Een dergelijk resultaat kan het gevolg zijn van niet-gemiddelde elektroforese condities.
   1. Om te corrigeren voor deze afwijkingen, in te voegen in het tekstvak "Waargenomen Peak (bp)" de waarde 395 en druk op de "Bereken" knop. Controleer opnieuw voor een minimale D2M en een bijbehorende P-waarde ≥0.05. Als dit niet lukt, probeer dan de waarden 405, 415 en 425.
      OPMERKING: Soms kleinere stappen zijn zelfsaangeduid. Indien nog niet gelukt, de waargenomen profiel niet in de referentiegegevens, kan het een nieuwe genotype of variant.
10. diverse Profielen
    1. Herhaal stap 5,6-5,9 voor elke elektroforese profiel afzonderlijk.

Representative Results

Definitie van een genotype en zijn varianten

Een elektroforetische profiel verschilt in meer dan één band alle bekende genotypen wordt beschouwd als een nieuw genotype. Nieuwe genotypen worden omschreven en uitgebreid volgens Fournier et al. ⁵ leidt tot de genotypen GTA te GTZ, gevolgd door de genotypes GTAA te GTAZ en GTBA te GTBZ en GTCA te GTCC thans. Variatie in één band als een genotypische variant. Het wordt aangegeven met Romeinse cijfers superscript achter de naam van het genotype (bv GTRI, GTRII). In totaal zijn er op dit moment 141 genotypes en varianten in de referentie databank.

Onder de hierboven geschetste, RS-PCR door Fournier et al. ⁵ omstandigheden is zeer reproduceerbaar te stammen van S. genotype aureus. Definitieve identificatie van eenbekend genotype variant is altijd mogelijk als technische problemen kunnen worden uitgesloten. Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 1 tonen de elektroforese van 12 RS-PCR producten en gepresenteerd in de pseudo gel modus door de bioanalyzer software. Elke baan wordt gekenmerkt door een patroon van twee of meer PCR bands en een markeerband vooraan en een markeringsband eind. Dubbelklikken in een lane opent de betreffende, werkelijk gemeten elektroforetische profiel in een apart venster. De bioanalyzer software maakt onder andere mogelijkheden, de waargenomen pieken worden gelezen maat als fluorescerende eenheden FU (figuur 2) of bp (figuur 3), waarbij één piek pas met een band in de pseudo-gel modus. Piekwaarde in FU is vereist voor het evalueren van de betreffende toppen van een profiel in de Mahal software (figuur 4), inlezen van bp worden afgeleid het genotype. Irrelevant pieken worden in de software Mahal kleine erwtks waarvan de waargenomen fluorescentie FU minder dan 40% van het geometrische gemiddelde van de 4 (3) pieken met de hoogste fluorescentie. Ze worden doorgaans waargenomen wanneer er een overmaat van DNA in RS-PCR (> 30 ng zuiver DNA / assay) ^2.

Als voorbeeld wordt het genotype van het monster 211 die in figuur 1 afgeleid. Visuele analyse van het elektroforetische profiel in figuur 2 (bioanalyzer software) en analyse met de Mahal software functie te testen irrelevante pieken geopenbaard 6 relevante pieken met piek groottes van 395 bp, 432 bp, 453 bp, 505 bp, 567 bp, en 622 bp (Figuur 3). Deze waarden worden ingevuld en gescheiden door komma in het tekstvak "Input Peaks (bp)" van Mahal software (figuur 4). Om te corrigeren voor run-specifieke afwijkingen, de waarde 415 werd ingebracht in het tekstvak "Waargenomen Peak (bp)" (figuur 4). Na het indrukken van de "Calculate "knop drukt, wordt een lijst gepresenteerd in opdracht van genotype samen met het kwadraat mahalanobis-afstand D2M tussen de aangevraagde en aangegeven genotypische profiel. Loop door de lijst op zoek naar een minimale D2M. In het onderhavige geval, minimale D2M is gelijk aan 4,499 (figuur 4) met een waarde van P ≥0.05, wat betekent dat de opgevraagde profiel niet significant van die van GTB.

Varianten van genotypen worden aangeduid als _I om _XV in de Mahal software. Bij genotype B, zijn de drie varianten GBT ^I, GBT ^II en ^III aangegeven GBT B_I, B_II en B_III in de software (figuur 4).

Een chip van de MED kit maakt analyse van producten 12 RS-PCR tegelijkertijd. Indien minder producten beschikbaar zijn, moet het resterende putjes te laden met gedeïoniseerd water. De resultaten kunnen alleen worden geïnterpreteerd als de controles included RS-PCR geschikt.

Figuur 1. Pseudo-gel die 12 RS-PCR producten en hun afgeleide genotypes. Twaalf verschillende stammen van S. aureus werden geanalyseerd met RS-PCR met de MED kit alsmede een bioanalyzer en de bijgeleverde software. De rijstrook aan de linkerkant ziet u de marker of "ladder" voor de grootte kalibratie van het systeem in bp. Op de top van de graphics, het monster namen en de bijbehorende genotypen worden aangeklaagd die werden verkregen door de Mahal software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Elektroforetische profiel van sample 161 die in figuur 1. Naast de pieken de gemeten fluorescentie is aangegeven FU. Visueel te onderscheiden pieken die niet door de bioanalyzer software noodzaak werden ontdekt te worden ingeschat door ze te lezen uit de plot zoals uitgevoerd voor de piek met een geschatte fluorescentie waarde van 113 FU (in het blauw). Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.

Figuur 3. Elektroforetische profiel van het monster 211 aanwezig is in Figuur 1. Op de top van de pieken hun omvang wordt aangegeven in bp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Screenshot van de Mahal software. In het tekstvak "Input Peaks (bp)" de piek afmetingen van het monster 211 uit figuur 3 zijn ingevuld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De meest kritische fase van de gehele procedure is wanneer er een overmaat van DNA in RS-PCR (> 30 ng zuiver DNA / assay) ^2. In het algemeen is de resolutie van een profiel is optimaal als alle van de toppen beginnen en eindigen bij de baseline. Indien twee pieken te dicht bij elkaar, resolutie onvolledig. Onder deze omstandigheden kan de bioanalyzer software leiden tot ongepaste piek identificatie waardoor handmatige identificatie vereist is.

Alle zichtbaar gescheiden en relevante pieken uitgedrukt bp FU of zijn opgenomen voor verdere analyse. Te veel matrijs-DNA voor RS-PCR resulteert in brede pieken en derhalve overlappende pieken en verminderde resolutie van de pieken. Bovendien migratie langzamer leidend tot afmetingen die ten onrechte worden verhoogd, zodat het genotype niet meer kan worden afgeleid piek. Tenslotte wordt het aantal irrelevante pieken is groter. Voor profielen met meer dan 3 pieken, dient de piek met maximale fluorescentie normaliter maximaal 150 FU.

Genotypering door RS-PCR zoals beschreven wordt beperkt doordat investering in machines nodig en de vrije Mahal software vereist. In feite, een standaard PCR machine en bioanalyzer nodig. De eerste is vrij goedkoop vandaag de dag, terwijl de laatste is duurder. De resolutie van agarose-gebaseerde elektroforese is niet voldoende, zelfs als hoge resolutie agarose wordt gebruikt. Onder deze omstandigheden is het enkel mogelijk onderscheid te maken tussen GTB, GTC, en alle andere genotypen. De kosten voor elektroforese met behulp van de MED kit of agarose elektroforese zijn echter vergelijkbaar. De MED kit alsmede de verdere bioanalyzer overtreft standaard agarose elektroforese op een manier die de laatste methode is handig, ongecompliceerd en verkregen gegevens in digitale vorm aanwezig die opslag en verdere analyse aanzienlijk vereenvoudigd is. Hoofdzakelijk alle gebruikelijke bioanalyzers zijn voor dit type analyse mits electrophoretic resolutie is voldoende en de verkregen grootte van de bands is accuraat en onbevooroordeeld.

De resolutie van de RS-PCR voor runderen stammen van S. aureus is hoog. Het is zo goed als spa typen, en beter dan MLST en PFGE ^4,14. In vergelijking met alle andere typen methoden gebruikt voor subtypering S. aureus (spa typen, MLST, PFGE), het monster doorzet is hoog: DNA-extractie is gemakkelijk en snel, 96 monsters kunnen in een RCR run (normaal O / N) en elektroforese worden verwerkt en genotype distilleren is rechttoe rechtaan. De volledige analyse van de 96 monsters vereist een nacht voor PCR en één dag voor elektroforese en de evaluatie. Andere voordelen van RS-PCR door Fournier et al. ² zijn de lage kosten, met name in vergelijking met MLST dat zeven genen waarvan de sequentie in beide richtingen ¹⁵ vereist. Bovendien RS-PCR de enige methode voorspellen contagiosity en pathogeniteit van stammen vanS. aureus die betrokken zijn bij bovine mastitis ^2,5, de belangrijkste voorspellers in de klinische diergeneeskunde. Tenslotte RS-PCR alleen voldoende is om de epidemiologie van runderen S. onderzoeken aureus ^3,4,5,14. Interpretatie van de gegevens is eenvoudig, zelfs in een internationale context als slechts een paar belangrijke genotypen waargenomen ^2,3. Epidemiologische vergelijkingen tussen runder- en humane stammen, RS-PCR en spa typen samen voorkeur als de laatste methode op grote schaal wordt gebruikt voor subtypering menselijke stammen zodat veel data beschikbaar. MLST is echter geschikt voor het beoordelen van de clonaliteit van de stammen ¹⁵ en fylogenetische analyses ^4.

Voor het oplossen van problemen met betrekking tot de PCR cycler, MED kit, en de bioanalyzer, de bijbehorende handleidingen te worden geraadpleegd. Bij de RS-PCR werkwijze wordt probleemoplossing enorm vereenvoudigd als positieve en negatieve PCR-controles zijn inclusiefluded in elke run. Als de positieve controle negatief is, werd de PCR mix onvoldoende samengesteld en / of controle DNA werd afgebroken. Als de negatieve controle (H ₂ O) gegenereerde één of meer banden, de PCR-mix werd verontreinigd met enig DNA. In beide gevallen moet de profielen niet worden geïnterpreteerd en RS-PCR worden herhaald. Als interpretatie onmogelijk gemaakt door een elektroforetische probleem elektroforese moet worden herhaald met een nieuwe chip. Elektroforetische problemen worden gewoonlijk gekenmerkt door onvoldoende migratie en afstemming van een of beide markeringsbanden gevolge van onbedoeld laden en manipuleren van de chip. Indien de verkregen elektroforese profiel niet door Mahal software kan worden opgevat, is het profiel bestand gegenereerd door de bioanalyzer overgeheveld naar de auteur voor verdere evaluatie. Normaal, te veel matrijs-DNA werd gebruikt voor PCR-RS of het profiel stelt een nieuw genotype of genotypische variant.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'