Introduction
Staphylococcus (S. aureus) sığır 1 meme içi enfeksiyon (IMI) dünya çapında sorumlu en önemli patojen olarak bilinir. 12 Avrupa ülkesinde bunun ineklerde Cosandey ve ark., 3 ve Boss ve diğ. 4 tarafından Fournier ve ark. 2 İsviçre ineklerde gösterdi ve çalışmalarla çalışma S. aureus IMI genetik olarak heterojen bir grup büyükbaş izole. 16S-23S rRNA intergenik aralayıcı bölge (RS-PCR), PCR amplifikasyonu ile, 17 genotip toplam başlangıçta 101 epidemiyolojik bağımsız izolatların 2 tespit edilmiştir. Diğer 15 genotipleri (GTs) her 1 tüm izolatların% 4, yapım nadiren meydana oysa Genotip B ve genotip C (GTC), (% 80) en sık görülen idi. Avrupa 3. seviyede, GTB, GTC, GTF, GTI ve GTR tüm analiz suşları (n = 456)% 76 içeren en önemli genotipleri vardı. GTB w Orta Avrupa'da yer alıyorduhereas diğer genotip yaygın dağıtılmıştır. Suşların kalan% 24 birçoğu, ancak, sadece bir kez gözlendi 41 genotipleri dahil.
Genotipleri çok Avrupa düzeyinde olduğu Swiss'te yanı sıra, onların virülans gen modeli ile ilişkili olduğunu Fournier ve ark. 2, Cosandey vd. 3 ve Graber vd. 5 ile çalışmalar daha gösterdi. Çalışmalar daha S. arasında IMI prevalansının büyük farklılıklar ortaya aureus GTB, GTC ve diğer genotipleri 2,5: GTB dikkate alınarak, bir sürüdeki ineklerin% 87'ye kadar bu genotip ile enfekte edildi. GTC ve diğer genotiplerinin durumda, ancak, IMI sadece sürünün 1 ila 2 ineklerde tespit edildi.
IMI S. neden aureus, normal gelen meme bezlerinin iltihaplanması süt iltihaplı hücrelerin bir artış ile sonuçlanır. Bunun bir sonucu olarak, somatik hücre koSütteki unts (SCC), çoğu ülkede süt kalitesinin önemli bir göstergedir, azalan süt fiyatı ya da teslim durağına giden artar.
Fournier ve ark., 2 RS-PCR yanı sıra, diğer yazma yöntemleri S. sığır suşları alt tiplerinin için tarif edilmiştir aureus 8-11. İki ortak olanları spa yazarak 12 ve Multi Odağı Sırası Yazma (MLST) 13 içerir. Ikinci bir 7 hazırlık geninin sıralama gerektirir, oysa önceki bir protein A stafilokok Spa kodlayan genin değişken aralayıcı bölgesini DNA dizilimi dayanır. Bu, bir 12 ve yedi PCR 13, sırasıyla özel ekipman kullanılarak amplikon saflaştırma, sıralama reaksiyonunun ve analiz, ardından yapılması gerektiği anlamına gelir. RS-PCR ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, düşük seviyede örnek ve yüksek maliyetleri ile sonuçlanan laboratuarda önemli bir ek bir çaba gerektirir.verim PFGE için özellikle düşüktür. S. sığır suşları için bu yöntemlerin çözünürlüğü göz önüne alındığında aureus, RS-PCR, en azından MLST 4 veya PFGE 15 den 4 ve daha iyi yazarak spa kadar iyidir.
İkili yazma 13 dahil olmak üzere tüm bu yöntemler S. neden sığır IMI patogenezinde içine daha fazla bilgi elde etkinliğini gösterdi aureus, ancak çünkü söz konusu kısıtlamalar onlar büyük klinik araştırmalar için daha az uygundur. Buna ek olarak, RS-PCR yöntemi ile genotipleme Fournier ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi. 2 epidemiyolojik ve S patojenik potansiyeli güvenilir bir tahmin sağlar aureus, sığır IMI klinik veteriner hekimlikte iki anahtar değerleri çıkıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Staphylococcus aureus izolatları
- S. 10 ul yayıldı aureus hazır bir kültür veya bir koloni,% 5 koyun kanı (BA) içeren Kolumbiya agar plakaları üzerinde seçici bir ortam üzerinde büyütülür.
- 24 saat için 18 saat, 37 ° C 'de aerobik inkübe edin.
2. DNA Ekstraksiyon
- 10 mM Tris-HCl ve 10 mM Na2EDTA, pH 8.5 ihtiva eden TEl tamponu hazırlayın. 15 dakika boyunca 121 ° C'de alikotları ve otoklav hazırlayın.
- 100 ul TEL steril plastik döngü veya steril ahşap kürdan ve tekrar süspansiyon kullanılarak BA 1 koloni toplayın. vidalı kapakları ile 1.5 ml tüpler kullanın.
- 10 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, ıslak buz üzerinde hemen örnekleri yerleştirin.
- PCR (PCR için = şablon DNA) için uygun H 2 O 100: numuneleri 1 seyreltin. olmayan seyreltildi ve seyreltilmiş numune, 1 ay boyunca -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
3. RS-PCR
- Standart bir PCR döngü aşağıdaki döngü programı çalıştırmak: 15 dakika, 7 dakika boyunca 55 ° C 'de 2 dakika rampa ve tavlama takip 1 dakika için 94 ° C kapsayan 27 çevrim, ardından 95 ° C. Bir başka 2 dakika rampa sonra 2 dakika süreyle 72 ° C'de uzatma. 4 ° C'ye kadar soğutulduktan takiben 10 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma PCR sonlandırma.
Not: PCR ürünleri, 5 gün boyunca -20 ° C'de saklanabilir. - Her çalışma için, RS-PCR, yani pozitif kontrol, bilinen bir genotip (normalde GTP) bir örneği, ve bir negatif kontrolü (H2O).
4. Elektroforez
- Birlikte DNA (MED kiti) için bir ticari minyatür elektroforez kiti kullanınPC ve yüklü yazılım bağlı bir Bioanalyzer ile. dikkatle üreticinin gelen kılavuzları inceleyin.
- çip astar istasyonu kurmak ve üreticinin kılavuzuna göre şırınga klibi ayarlayın.
- üreticinin kılavuzuna göre jel boya karışımı hazırlayın.
- (Üreticinin kılavuzuna göre) jel boya karışımı yükleniyor.
- kullanımdan önce, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında jel boya karışımı dengelenmesi.
- Çip astar istasyonunda yeni bir DNA çip koyun. iyi işaretlenmiş G. jel boya Pipet 9 ul
- piston 1 ml konumlandırılmış olduğundan emin olun ve sonra çip hazırlama istasyonu kapatın. Basın piston o şırınga klibi tarafından tutulan kadar. 30 sn sonra şırınga klibi yayınlayacak için tam bekleyin.
- 5 saniye bekleyin. Yavaşça 1 ml konumuna pistonu geri çekin.
- Her iki kuyularda Açık çip hazırlama istasyonu ve jel boya pipet 9 ul 'G' olarak işaretlenmiş.
- M Yüklemearker
- 12 örnek kuyularda ve iyi merdivende marker Pipet 5 ul. Boş olan bu 13 kuyu herhangi bırakmayın.
- Merdiven ve Örnekleri yükleniyor.
- Pipet merdiven işareti ile iyi işaretlenmiş DNA merdiveninin 1 ul.
- Numunenin Pipet 1 ul (kullanılan kuyular) ya da deiyonize su (kullanılmayan kuyuların) 1 ul.
- 2400 rpm'de 1 dakika için adaptör ve vorteks yatay çip koyun.
- 5 dakika içinde Bioanalyzer çipi çalıştırın.
- Analizi Koşu
- Bioanalyzer ve bağlı bilgisayarınızı başlatın. yazılımını açın.
- Bioanalyzer kapağını açın ve (çip yalnızca bir şekilde oturabilir) yonga tutucu içine çip yerleştirin. dikkatlice kapağını kapatın.
- Yazılımın Enstrüman bağlamında "Elektroforez"> "dsDNA"> "DNA 7500" i seçin. Yazılımın güncel Dosya Öneki kabul edin veya değiştirin.
- yazılımda mevcut start düğmesine tıklayın. Yazılımın örnek adlarını girin. Çip çalışma bittiğinde (sonra yaklaşık 30 dakika) Run mesajın sonu Bioanalyzer yazılımında görünür.
- üreticinin talimatlarına göre Bioanalyzer elektrotları çipini çıkarın ve temizleyin.
5. Elektroforez Profilinden genotip çıkarımlar yapma
- (Yazılım yazarlardan serbestçe kullanılabilir) Mahal yazılımını yükleyin.
- > "Import Referans Veri" "Dosya": Mahal yazılımı içine alma referans verileri
- Bioanalyzer yazılımı Veri bağlamında çalışır elektroforez açın. Bir numunede bir elektroforez profili seçin.
- İlgili zirveleri için kontrol edin.
- "Araçlar"> "Mean Floresans": İlgili zirveleri kontrol etmek için Mahal yazılımını kullanın. "Floresan" kutusuna yerleştirinfloresans değerleri, Bioanalyzer yazılımından okunabilir şekilde, floresans (FU) olarak gösterilir. artan düzende en yüksek floresan 4 (3) zirveleri takın ve virgülle ayrılmış. Örnek: 126.130.132.137.
NOT: tüm bu zirveleri FU Bioanalyzer yazılımı ile gösterilir, bunlar komplo onları okuyarak tahmin edilmesi gerekmektedir.
- "Araçlar"> "Mean Floresans": İlgili zirveleri kontrol etmek için Mahal yazılımını kullanın. "Floresan" kutusuna yerleştirinfloresans değerleri, Bioanalyzer yazılımından okunabilir şekilde, floresans (FU) olarak gösterilir. artan düzende en yüksek floresan 4 (3) zirveleri takın ve virgülle ayrılmış. Örnek: 126.130.132.137.
- "Hesapla" tuşuna basınız. gözlenen floresan kutusuna "Minimal pik yüksekliği" verilen değeri aştığı takdirde bir zirve geçerlidir.
- genotip anlaması.
- Mahal metin kutusu "Giriş Peaks (bp)" artan sırayla ilgili tüm piklerin bp ölçü ve virgülle ayrılmış içine yerleştirin. Örnek: 440.462.519.579.637.
NOT: Bu en yüksek boyutlarda tüm Bioanalyzer yazılımı ile gösterilir, bunlar grafiğinden onları okuyarak tahmin edilmesi gerekmektedir.
- Mahal metin kutusu "Giriş Peaks (bp)" artan sırayla ilgili tüm piklerin bp ölçü ve virgülle ayrılmış içine yerleştirin. Örnek: 440.462.519.579.637.
- "Hesapla" tuşuna basınız.
- listesindekutu, asgari kare Mahalanobis mesafe "d2m" arayın. Bu ≥0.05 sağ karşılık gelen p değeri daha sonra olasılık sıfır hipotezi H 0 reddedilir ≥5% ise (H 0: gözlenen ve referans profili aynıdır) gözlenen profilini özdeş olduğu kabul edilmektedir, yani belirtilen genotip referans profili.
- D2m az ancak karşılık gelen P değerinin alan boş ise, bir olasılık <% 5 ile H 0 reddediyoruz.
Not: Bu d2m çok az olsa da profilleri eşit olduğu anlamına gelir. Bu tür bir sonuç, sigara ortalama elektroforez koşulları kaynaklanabilir.- Bu sapmaların düzeltmek için, değeri 395 "Tepe (bp) Gözlenen" metin kutusuna takın ve "Hesapla" tuşuna basınız. Minimal d2m ve karşılık gelen P değeri ≥0.05 için tekrar kontrol edin. Başarılı değilse, değerleri 405, 415, ve 425 deneyin.
NOT: Bazen küçük adımlar bile vardırbelirtilen. Gözlenen profil Referans veri mevcut değildir başarılı de, bu yeni genotip veya varyant olabilir.
- Bu sapmaların düzeltmek için, değeri 395 "Tepe (bp) Gözlenen" metin kutusuna takın ve "Hesapla" tuşuna basınız. Minimal d2m ve karşılık gelen P değeri ≥0.05 için tekrar kontrol edin. Başarılı değilse, değerleri 405, 415, ve 425 deneyin.
- çeşitli Profiller
- Yineleyin ayrı ayrı 5.6 her elektroforez profili için 5.9 için yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir genotip ve türevleri tanımı
belirlenen tüm genotipler birden fazla bant farklı bir elektroforetik profilini yeni genotip olarak kabul edilir. Yeni genotipleri adlandırılır ve genişletilmiş Fournier ve diğerlerine göre. 5 GTAZ genotiplerin GTAA ardından GTZ genotiplerin GTA giden ve GTBA GTBZ için ve GTCC için GTCA düzeydedir. sadece bir bant değişimin, bir genotip bir varyasyon olarak kabul edilir. Bu genotip (örneğin, GTRI, GTRII) adından sonra satırın üstünde romen rakamları ile gösterilir. Toplamda, referans veri tabanı 141 genotipleri ve varyantları halen vardır.
Fournier ve ark, RS-PCR. 5 yukarıda özetlenen koşullar altında S. suşları genotipinin son derece tekrarlanabilir aureus. Bir tanımlanmasındanteknik sorunlar hariç olabilir eğer bilinen genotip veya varyant her zaman mümkündür. Tipik bir sonucu 12, RS-PCR ürünlerinin elektroforez gösteren Şekil 1 'de sunulan ve Bioanalyzer yazılımı ile sözde jeli modunda sunulmuştur. Her şerit sonunda iki ya da daha fazla PCR bantları bir desen ve önünde bir işaretleyici bant ve işaretleyici bant ile karakterize edilir. Bir şeride çift tıklayarak ayrı bir pencerede ilgili, gerçekte ölçülen elektroforetik profili açılır. Bioanalyzer yazılım gözlenen pikler bir tepe sözde jel modunda tam bir bant karşılık sayede (Şekil 3) floresan birimleri FU olarak boyutu (Şekil 2) ya da bp okunan, diğer olasılıklar arasında, izin verir. FU Tepe okuma, Mahal yazılımında bir profilin ilgili zirveleri (Şekil 4) değerlendirilmesi genotipi çıkarım için bp okuma için gereklidir. Alakasız doruklarına küçük bezelye gibi Mahal yazılımında tanımlanırolan floresans FU KS yüksek floresan ile 4 (3) tepe noktalarının geometrik ortalamanın% 40 altındadır. RS-PCR DNA 'sının aşırı (> 30 saf DNA / tahlil ng) olduğunda Normalde gözlenir 2.
Bir örnek olarak, Şekil 1 'de örnek 211 mevcut genotipi anlaşılmaktadır. Alakasız zirveleri test etmek için aracını kullanarak Mahal yazılımı ile elektroforetik Şekil 2'de profili (Bioanalyzer yazılımı) ve analiz görsel analizi, 395 bp, 432 bp, 453 bp, 505 bp, 567 bp zirve boyutları ile 6 alakalı zirveleri ortaya ve 622 bp (Şekil 3). Bu değerler, doldurulur ve metin "Giriş zirveler (bp)" Mahal yazılım (Şekil 4) 'de virgül ile ayrılır. Run-spesifik sapmalar düzeltmek için, değeri 415 (Şekil 4) "Tepe (bp) Gözlenen" metin kutusuna yerleştirildi. "C bastıktan sonraalculate "düğmesine bir liste sorgulanan ve belirtilen genotipik profili arasındaki karesi Mahalanobis mesafe d2m ile birlikte genotip tarafından sipariş sunulmaktadır. minimal d2m arıyor listeyi kaydırın. Mevcut durumda, asgari d2m ile (Şekil 4) 4.499 eşittir sorgulanan profili belirgin GTB birinden farklı değildir, yani P ≥0.05 bir değeri.
genotip varyantları Mahal yazılım _XV için _I olarak belirtilmiştir. Genotip B durumunda, tünelin I tünelin II ve tünelin III yazılım (Şekil 4) 'de B_I, B_II ve B_III olarak belirtilen üç varyant bulunmaktadır.
MED kitinin bir yonga bir seferde 12 RS-PCR analiz ürünlerini sağlar. daha az ürün varsa, kalan kuyuları deiyonize su ile yüklenmesi gerekiyor. Sonuçlar sadece kontroller eğer yorumlanabilir iRS-PCR ncluded uygundur.
S. Şekil 12 RS-PCR ürünleri ve türetilmiş genotipleri temsil 1. Sözde jel. On iki farklı suşlar aureus Bioanalyzer ve verilen yazılım ile birlikte MED kiti kullanılarak RS-PCR ile analiz edilmiştir. Sol taraftaki şerit bp sistemin büyüklüğü kalibrasyonu için işaretleyici veya "merdiveni" gösterir. Mahal yazılımı ile elde edilmiştir grafik, örnek isimleri ve ilgili genotipleri suçlanan edilir üstünde. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sa 2. Elektroforetik profili ŞekilÖlçülmüş floresans, FU gösterilir tepe üzerine Şekil 1 'de yapıldığı Örnek 161, bu. Bioanalyzer yazılım ihtiyacı tespit edilmedi görsel olarak ayırt zirveleri (mavi) 113 FU tahmini floresan değeri ile zirve için yapılan olarak arsa onları okuyarak tahmin edilmesi. Bu büyük halini görmek için tıklayınız rakam.
Şekil 3. boyutları bp gösterilir zirveleri üzerine Şekil 1'de mevcut numunenin 211 elektroforetik profili. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil Mahal yazılımının 4. ekran görüntüsü. Metin kutusuna "Giriş Peaks (bp)" Şekil 3 den numune 211 pik boyutları doldurulur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RS-PCR (> 30 saf DNA / tahlil ng) 'de DNA' sının aşırı olduğunda bütün prosedürün en kritik adımdır 2. Bunu tüm tepe başlangıçta başlangıç ve bitiş Genel olarak, bir profilin çözünürlüğü en uygunudur. iki tepe birbirine çok yakın ise, çözünürlük eksik. kılavuzu tanımlama gerekli olduğu şekilde, bu koşullar altında, Bioanalyzer yazılımı olmayan pik tanımlanmasına yol açabilir.
bp veya FU olarak ifade edilen tüm gözle görülür ayrılmış ve ilgili zirveleri ileriki analizler için dahildir. Çok fazla şablon DNA RS-PCR geniş zirveleri ile sonuçlanır ve bu nedenle doruklarına örtüşen ve bozulmuş çözünürlüğü zirve. Buna ek olarak, geçiş genotip artık çıkarılabilir, böylece yanlış artmıştır boyutları tepe yavaş lider. Son olarak, alakasız zirvelerin sayısı daha büyüktür. 3'ten fazla tepe profiller için, maksimum floresan ile yüksek seviyeler 150 FU aşmamalıdır.
makineleri yatırım gereklidir ücretsiz Mahal yazılım gereklidir gerçeği ile sınırlıdır tarif edildiği gibi, RS-PCR ile genotipleme. Aslında, standart bir PCR makinesi ve Bioanalyzer ihtiyaç vardır. Eski ikincisi daha pahalı günümüzde ise oldukça ucuz. agaroz tabanlı elektroforez çözünürlüğü yüksek çözünürlüklü agaroz kullanılsa bile yeterli değildir. Bu koşullar altında, şartnamede, GTC ve diğer tüm genotipler arasında ayrım sadece mümkündür. MED kiti veya agaroz elektroforezi kullanılarak elektroforez masrafları, ancak, benzer. daha Bioanalyzer birlikte MED kiti yalındır ikinci yöntem kullanışlıdır bir şekilde, standart agaroz elektroforezi daha iyi performans ve elde edilen veriler ölçüde depolama ve daha fazla analiz kolaylaştırır elektronik biçimde mevcuttur. Prensip olarak tüm ticari olarak temin edilebilen bioanalyzers Bu tür bir analiz için uygun olan electrophoret koşuluylaic çözünürlüğü yeterli ve bantlar elde edilen boyut doğru ve tarafsız olduğunu.
S. sığır suşları için RS-PCR çözünürlüğü aureus yüksektir. Bu kaplıca yazarak kadar iyidir ve MLST ve PFGE 4,14 daha iyi. Buna ek olarak, genel olarak alt-tiplemesi S. için kullanılan bütün diğer yazma yöntemleri ile karşılaştırıldığında 96 numune bir RCR (normalde O / N) vadede ve elektroforez işlenebilir, DNA izolasyonu, kolay ve hızlı ve genotip çıkarım bellidir: aureus (spa yazarak, MLST, PFGE), onun örnek hacmi yüksektir. 96 numunenin komple analizi PCR için bir gece ve elektroforez ve değerlendirme için bir gün gerektirir. Fournier ve ark., 2 RS-PCR diğer avantajları her iki yönde 15 sekanslanacak olan yedi genleri gerektirir MLST kıyasla özellikle düşük maliyetleridir. Ayrıca, RS-PCR suşları tek yöntem tahmin contagiosity ve patojenite olduğunuSığır katılan S. aureus klinik veteriner hekimlikte 2,5, anahtar yordayıcılarını mastitis. Son olarak, RS-PCR tek başına sığır S. epidemiyolojisi araştırmak için yeterlidir aureus 3,4,5,14. Sadece bir kaç büyük genotipleri 2,3 gözlenir olarak verilerin yorumlanması hatta uluslararası bağlamda yalındır. İkinci yöntem yaygın çok veri mevcuttur, böylece insan suşları alttiplendirmesinde için kullanıldığı gibi, sığır ve insan suşları, RS-PCR ve spa yazarak arasındaki epidemiyolojik karşılaştırmalar için birlikte tercih edilir. MLST Ancak suşların 15 klonalite değerlendirmek için uygundur ve filogenetik için 4 analiz eder.
PCR cycler ilgili sorun giderme, MED kiti ve Bioanalyzer için, ilgili kılavuzlar danışılması gerekmektedir. Uygun pozitif ve negatif PCR kontrol inc vardır RS-PCR yöntemi durumunda, sorun ağır basitleştirilmiştirHer dönemde içermiştir. Pozitif kontrol negatif ise PCR karışımı yeterince oluşan ve / veya kontrol DNA bozulmuş oldu değildi. Negatif kontrol (H2O) bir ya da daha çok sayıda bandın üretilen PCR karışımı bir DNA ile kontamine olmuş ise. Her iki durumda da, profiller yorumlanır ve RS-PCR tekrarlanmalıdır olmamalıdır. yorumlama, çünkü bir elektroforetik sorunun imkansız ise, elektroforez, yeni bir çip kullanan tekrar edilmesi gerekir. Elektroforetik sorunları normal olarak yetersiz olan göç ve bir hizalanması veya uygun yükleme ve çip manipüle kaynaklanan her iki markör bant ile karakterize edilir. Elde edilen Elektroforez profili Mahal yazılımı tarafından yorumlanır edilemiyorsa, Bioanalyzer yazılımı tarafından oluşturulan profil dosyası daha fazla değerlendirme için yazara gönderilir. Normal olarak, çok kalıp DNA RS-PCR için kullanılmıştır ya da profil yeni bir genotip veya genotipik bir çeşidini temsil etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw = 121.14 g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5 mol/L | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
References
- Sears, P. M., McCarthy, K. K. Management and treatment of staphylococcal mastitis. Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).
- Fournier, C., et al. Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome. Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).
- Cosandey, A., et al. Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries. J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).
- Boss, R., et al. Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer. J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).
- Graber, H. U., et al. Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties. J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).
- Heiniger, D., et al. Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben. Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).
- Hamann, J. Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition. IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).
- Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea. J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).
- Sakwinska, O., et al. Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley. Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).
- Rabello, R. F., et al. Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds. J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).
- Tavakol, M., et al.
- Harmsen, D., et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).
- Zadoks, R., et al. Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates. J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).
- Cremonesi, P., et al. Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows. J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).
- Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).
