Summary
Der Eckzahn Gehirn ist ein wertvolles Modell, bei dem die adulte Neurogenese zu studieren. Präsentiert hier sind Protokolle zur Isolierung und erweitert erwachsenen Hunde-Hippocampus-neuralen Vorläuferzellen aus primären Hirngewebe.
Protocol
Gemäß New South Wales, Australien Gesetz, post mortem Hirngewebe wurde von erwachsenen Hunden aus Gründen in keinem Zusammenhang mit der Studie euthanasiert erworben.
1. Herstellung von Kulturmedium
- Bereiten einer 0,1% igen Gelatinelösung durch Zugabe von 0,1 g Gelatinepulver zu 100 ml destilliertem Wasser und Rühren bei 37 ° C bis gelöst. Sterilisieren der Lösung durch UV-Bestrahlung für 15 min. Diese Medien können dann für bis zu 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.
- Vorbereiten eines 3: 1-Verhältnis von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und Nährstoffgemisch F12 durch Zugabe von 167 ml F-12 bis 500 ml DMEM (4,5 g / L D-glucose). Hinzufügen 6,7 ml Penicillin / Streptomycin-Lösung (für eine Endkonzentration von 1%). Dieses Medium kann für bis zu 1 Monat bei 4 ° C im Dunkeln gelagert werden.
- Bereiten 500 ml Serum Medien durch die Kombination 440 ml DMEM (4,5 g / L D-glucose), 5 ml L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid (200 mM) 5 ml Penicillin / Streptomycin und 50 ml fötales Bovine Serum (FBS). Dieses Medium kann für bis zu 1 Monat bei 4 ° C im Dunkeln gelagert werden.
- Komplettes Wachstumsmedium besteht aus Neural Stem Cell (NSC) Basal Medium und Proliferation Neural Supplement-A (NS-A), 2% FBS, 2 ug / ml Heparin, 20 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und 10 ng / ml basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF). Machen Sie diese Medien frisch, unmittelbar vor der Gehirnsezierung, und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad.
2. Gehirn Extraction
- Beginnen Extraktion innerhalb von 6 Stunden post mortem durch die dorsale Oberfläche des Kopfes des Hundes Sterilisieren mit PVP-Jod.
- Mit einem Skalpell machen einen Längsschnitt entlang der sagittalen Mittellinie über die gesamte Rückenfläche des Schädels, die zugrunde liegenden Kaumuskeln zu belichten. Die Länge dieser Schnitt wird von der Art und Alter des Hundes ab.
- An den rostralen und kaudalen Grenzen des Schädels, machen zusätzliche 5 - 10 cm senkrecht Schnitte auf beiden Seiten, übergebening hinter den Augen und Ohren sind, zu ermöglichen, die Haut vollständig reflektiert werden.
- Mit einem Skalpell, trennen Sie die Kaumuskeln aus ihrer Befestigung an der Sagittalkamm des Schädels und kratzen alle verbleibenden Bindegewebe aus dem Schädel.
- ein oszillierendes Knochen Mit sah die Kappe des Schädels in einer Umfangslinie geschnitten. Mit Hilfe einer Sonde oder einem Skalpell durchtrennen alle verbleibenden Anlagen mit der Dura, und dann vorsichtig die Schädelkappe entfernen Sie die dorsale Oberfläche des Gehirns aufzudecken.
Achtung: Die Dicke des Knochens variiert in den verschiedenen Regionen in den Schädel, so dringen Vorsicht geboten ausgeübt werden , um nicht zu tief und das darunter liegende Gehirn schädigen. - Sever das Rückenmark durch ein Skalpell zwischen der oberen Halswirbel stecken.
- Mit der einen Hand, um das Gehirn sanft heben, verwenden Sie ein Skalpell vorsichtig auf das Gehirn aus dem Schädelgrube befreien und durchtrennen die Verbindungs Nerven und Blutgefäße befindet sich an seiner Bauchseite. Heben Sie die bregen aus dem Schädel und in einen Behälter mit DPBS.
Achtung: Die großen Riechkolben des Hunde-Gehirn tief in die vordere Schädelgrube erstrecken kann. Es muss darauf geachtet werden, wenn das Gehirn zu entfernen, um diese Strukturen zu erhalten.
3. Hippocampale Dissection
- Spülen Sie das Gehirn in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) kein Blut zu entfernen und sie Rückenseite nach unten auf eine 150 mm Petrischale.
- bisect langsam das Gehirn längs durch die Mitte Sagittalebene einen nassen Gehirn Messer und eine einzelne Scheibe verwenden, die über die gesamte Länge der Klinge verwendet. Wenden Sie keine zusätzlichen Abwärtsdruck, oder eine Sägebewegung, da dies das Gewebe beschädigen können.
- Platzieren jeder Hemisphäre medial Fläche nach oben, sezieren aus dem Hippocampus eines Skalpells und einer feinen Pinzette verwenden und übertragen sie auf eine 35-mm-Gewebekulturschale.
4. Isolierung von neuralen Vorläuferzellen
- Mince die tAusgabe Proben mit einem Skalpell in ca. 1 mm 3 Stück verwenden.
- Übertragen Sie das Gewebe in einen 15-ml-Röhrchen, 2 ml 0,1% Trypsin-EDTA, und Inkubation für 7 Minuten in einem Wasserbad bei 37 ° C.
- Halt die Enzymreaktion durch Zugabe von 4 ml von Serum Medien auf das Rohr. Pellet die Suspension durch Zentrifugation bei 100 g für 7 min und entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendierte das Pellet in 300 ul DPBS und mechanisch durch vorsichtiges Pipettieren bis distanzierte und unten, eine 1000 ul Pipettenspitze, bis eine glatte Homogenat Formen.
- In 14 ml Serum Medien in das Röhrchen und übergeben Sie die Zellsuspension durch ein Sieb 40 & mgr; m-Zelle. Pellet die Suspension durch Zentrifugation bei 100 xg für 7 min, um den Überstand zu entfernen, und resuspendieren in komplettem Wachstumsmedium.
5. Neurosphäre Kultur
- Von der Zellsuspension bei Isolierung erhalten, zählen die Anzahl der lebenden Zellen Trypanblaufarbstoff Ausschluss verwenden und eine HämoZytometer.
- Verdünne die Zellsuspension in komplettem Wachstumsmedium und Samen bei 1 x 10 5 Zellen / cm2 in unbeschichteten Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen.
- Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 und> 95% Luftfeuchtigkeit für 14 - alle 7 Tage 28 Tage 50% der Wachstumsmedien ersetzt. Messen Sie den Durchmesser der regelmäßig Neurospheres. Wenn erlaubt über 100 & mgr; m im Durchmesser zu wachsen, Zelltod und spontane Differenzierung in den Neurosphären auftreten.
6. Neurosphäre Passage
- Um Passage als schwimmender Kultur, wenn die Neurosphären etwa 100 & mgr; m im Durchmesser erreichen, kombinieren alle Neurosphere haltigen Medien in einem einzigen Rohr. Pellet durch Zentrifugation bei 100 g für 7 min und entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendieren des Pellets in 1 ml 0,1% Trypsin EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 7 min in einem Wasserbad. Pipette vorsichtig nach oben und unten 100-mal, eine 200 ul Pipettenspitze, um sicherzustellen, dissociatiauf der Neurosphären.
- Halt die Enzymreaktion durch Zugabe von 5 ml Serum Medien in das Röhrchen und zentrifugiert bei 100 g für 7 min.
- Entfernen Sie den Überstand, Zellpellet in 1 ml komplettem Wachstumsmedium und zählen die Anzahl der lebenden Zellen Trypanblaufarbstoff Ausschluss Verwendung und einer Zählkammer.
- Verdünne die Zellsuspension in komplettem Wachstumsmedium und Samen bei 1 x 10 5 Zellen / cm2 in unbeschichteten Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 und> 95% Luftfeuchtigkeit für 14 bis 28 Tage 50% der Wachstumsmedien alle 7 Tage ersetzt werden .
7. adhärenten Kultur von neuralen Vorläuferzellen
- Um ein ausreichendes Volumen von 0,1% igen Gelatinelösung, die Oberfläche einer Gewebekulturschale und Heilung in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 h vor der Verarbeitung des Neurosphären für adhärente Kultur zu decken.
- Von der schwimmenden Neurosphären Kultur, verbinden alle Medien in einem einzigen Rohr. Pellet die neurospheres durch Zentrifugation bei 100 xg für 7 min und den Überstand entfernen.
- Resuspendieren des Pellets in 1 ml 0,1% Trypsin EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 7 min in einem Wasserbad. Pipette vorsichtig auf und ab 100 Mal, mit einer 200 ul Pipettenspitze.
- 5 ml Serum-Medien für 7 min, um die Enzymreaktion und Zentrifuge bei 100 xg zu stoppen. Überstand verwerfen und Zellpellet in 1 ml komplettem Wachstumsmedium und zählen die Anzahl der lebenden Zellen Trypanblaufarbstoff Ausschluss Verwendung und einer Zählkammer.
- Verdünnen Sie die Zellsuspension in komplettem Wachstumsmedium, entfernen Sie die Gelatine aus den Gewebekulturflaschen und Samen der Zellen bei 1 x 10 4 Zellen / cm 2.
- Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 und> 95% Luftfeuchtigkeit. Ersetzen Sie die Medien mit frischen, erwärmt, vollständige Wachstumsmedien alle drei Tage, bis die Kultur etwa 80% Konfluenz erreicht (nach ca. 7 Tage).
8. Neural Colony Forming Assay
- Kombinieren Neural Colony Forming Zelle (NCFC) Assay Medienkomponenten: NCFC serumfreien Medium, Proliferation NS-A und Kollagenlösung (3 mg / ml). Nachtrag: Dieses Medium mit 2 ug / ml Heparin, 20 ng / ml EGF und 10 ng / ml bFGF.
- Hippokampus-Gewebedissoziation Nach Resuspendieren der Zellen in neurale koloniebildenden Assay-Medium, vorgewärmt auf 37 ° C in einem Wasserbad. Samen der Zellen bei einer klonalen Dichte von 1,1 x 10 5 Zellen / ml in eine 35 mm Kulturschale.
- Inkubieren der Zellen in diesem halbfesten Kollagen - Matrix bei 37 ° C, 5% CO 2 und> 95% Luftfeuchtigkeit. Kultur für 28 Tage, 50% des Wachstumsmediums alle 7 Tage ersetzt werden.
9. Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen
- Um ein ausreichendes Volumen von 5 & mgr; g / cm 2 Laminin Lösung , um die Oberfläche einer Gewebekulturschale und Heilung in einem Inkubator bei 37 ° C für 24 h zu decken , bevor die Zellen für die Verarbeitung differentiation.
Hinweis: Entfernen Sie die Laminin - Lösung und spülen Sie die beschichtete Oberfläche zweimal in DPBS unmittelbar vor der Aussaat. - Wenn Passagierung Saatgut der Zellsuspension mit 1 x 10 4 Zellen / cm 2 in DMEM-F12 (3: 1) Medium (vorgewärmt auf 37 ° C) mit 20 ng / ml EGF und 40 ng / ml bFGF auf die Laminin beschichteten Kulturschale.
- Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 und> 95% Luftfeuchtigkeit und erlauben Zellen für 3 Tage zu vermehren.
- Um die anhaftende neurale Vorläuferzellen differenzieren, nach 3 Tagen das Medium mit Differenzierungsmedium, das DMEM-F12 ersetzen (3: 1) Medium vorgewärmt auf 37 ° C, supplementiert mit 10 ng / ml brain derived neurotrophic factor (BDNF).
- alle 3 Tage während der Differenzierung 50% der Medien zu ersetzen. Die Differenzierung erfolgt schrittweise über etwa 21 bis 28 Tagen haben.
Achtung: Sobald die Zellen zu differenzieren begonnen, ersetzen nur 50% der Medien an einem time als Zutritt von Luft kann eine nachteilige Wirkung auf die Gesundheit der Zellen haben.
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Representative Results
Durch die Verwendung von in vitro - Assays neuralen Vorläufer, Neurogenese und Populationen neuralen Vorläuferzelle wurden über die dorsoventral Achse des erwachsenen Hippokampus canine charakterisiert und verglichen. Neurale Vorläuferzellen aus isolierten Hippocampus-Gewebe abgeleitet gebildet Floating Neurosphären innerhalb von 14 Tagen der Isolation, die einen Durchmesser von 100 & mgr; m von 28 Tagen der Kultur zu erreichen. abgeleiteten Neurosphären aus dorsalen und ventralen Isolate zeigten keinen Unterschied in der mittleren Größe und folgende enzymatische Spaltung in einzelne Zellen, könnte als schwebende Neurosphere Kulturen agiert werden. Sekundäre Floating Neurosphären aus beiden Hippokampus-Regionen waren in der Lage innerhalb von 5 Tagen nach Durchgang zu bilden. Wenn bei 1 x 10 4 Zellen / cm 2 auf 0,1% Gelatine beschichtete Kulturflaschen ausgesät wurden neurale Vorläuferzellen können auch als adhärente Monoschichten (1A) zu proliferieren. Keine morphologischen Unterschiede wurden beobachtet between dorsalen und ventralen Hippocampus - neuralen Vorläuferzellen und beide adhärenten Kulturen waren in der Lage zu unterziehen über 10 Populationsverdopplungen ohne jede beobachtete in Passage-Zeit (Abbildung 1B) verlangsamt. Nestin und Sox2 Expression neuraler Stammzellen Gen in adhärenten Kultur war nicht signifikant verschieden gegenüber der hippocampalen dorsoventral Achse (Abbildung 2). Umfangreichere Charakterisierung von Gen- und Proteinexpression, die neuralen Vorläufer Identität dieser Zellen bestätigt, 7 in unserer veröffentlichten Daten berichtet.
Durch Verwendung einer geeigneten Neural Colony Forming Assay 4,6 wir neuralen Vorläuferzellfrequenz bewertet , um auf mögliche Unterschiede in neuralen Vorläuferzellpopulationen über den dorsalen und ventralen Subregionen des Hunde Hippocampus quantifizieren. Zellen wurden in klonaler Dichte in einem halbfesten Kollagenmatrix ausgesät, der Zellfusion und kultiviert für 28 Tage (3A schließt F = 96,8; p = 0,001; 3B ).
Unter Differenzierungsbedingungen, Haft- Eckzahn zeigte neuralen Vorläuferzellen progressive Veränderungen in der Gesamtmorphologie, die Entwicklung von mehr und aufwändigere Prozesse. Proteinexpression für neuronale (βIII-Tubulin) und gliale (Glial fibrillary acidic protein, GFAP) Marker erhöht auch die Differenzierung folgenden (Abbildung 4). Kein signifikanter Unterschied in der Anzahl der positiv markierten Zellen zwischen dorsalen und ventralen Isolaten beobachtet. Unserer früher veröffentlichten Daten bestätigt diese Proteinexpressionsänderungen, was zeigt, Hochregulierung ihrer zugehörigen Gene zusammen mit Down-Regulation neuronaler Vorläufer - Gene über die 28 Tage Differenzierung Zeitraum 7.
Abbildung 1:.. In - vitro - Expansion von adulten Canine Hippocampus neurale Vorläuferzellen Adult Eckzahn des Hippocampus isoliert neuralen Vorläuferzellen aus dem dorsalen und ventralen Hippocampus - Regionen werden als (A) schwimmend Neurosphären oder als (B) eine anhaftende Monoschicht (C) als erweiterte adhärenten einschichtigen diese neuralen Vorläuferzellen Passage über 10-mal ohne deutlichen Rückgang der Verdoppelung Geschwindigkeit durchlaufen könnte. n = 5; Maßstab = 50 & mgr; m. Geändert von den veröffentlichten Abbildung 7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Fig . 2: Gene Expression in proliferierenden Adult Canine Hippocampal neuralen Vorläuferzellen Expression neuraler Stammzellen Gene (A) , Nestin und (B) Sox2 wurde in erwachsenen canine hippocampal neuralen Vorläuferzellen unter adhärenten proliferative Kulturbedingungen bestätigt. Expression dieser Gene war äquivalent sowohl in der dorsalen und ventralen Hippocampus abgeleiteten Zellen. Erwachsene Hunde-Fibroblasten wurden als Steuerleitung verwendet, um Unterschiede in der relativen Genexpression zu vergleichen. n = 5; Fehlerbalken = SEM. Geändert von den veröffentlichten Abbildung 7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Neural Colony Forming Assay (A)Adult canine neuralen Vorläuferzellen, beimpft bei klonaler Dichte in einem halbfesten Kollagen - Matrix, die Form Neurosphären innerhalb von 28 Tagen der Kultur. (B) neuralen Vorläuferzellen aus den dorsalen Hippocampus abgeleiteten erzeugen signifikant größere Anzahl von Neurosphären pro Flächeneinheit als jene , abgeleitet von der ventralen Hippocampus. n = 5; Fehlerbalken = SEM; Maßstab = 50 & mgr; m. Geändert von den veröffentlichten Abbildung 7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Immuncytochemie von Differentiated Adult Canine Hippocampus neurale Vorläuferzellen , wenn sie in BDNF für 28 Tage, erwachsene Hunde-neurale Vorläufer sowohl von der dorsalen und ventralen Hippocampus Differenzierung zu reifen Neuronen (βIII-Tubulin - positive) und Gliazellen (GFAP-positiv) Zelltypen. n = 5; Maßstab = 50 & mgr; m. Geändert von den veröffentlichten Abbildung 7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Protokolle werden hier beschrieben, optimiert für die Maximierung der Zelllebensfähigkeit günstige Kulturbedingungen zu halten. Die Geschwindigkeit und die Sorgfalt bei der Extraktion, Isolierung und Expansion von entscheidender Bedeutung. Ein entscheidender Schritt für adhärenten einschichtigen Expansion Gründung ist die effektive Spaltung der primären Neurosphären. Nach Durchgang distanzierte unzureichend Sekundär schwebenden Neurosphären Neurosphären erzeugen kann. Während Medienwechsel können diese Neurosphären für adhärenten einschichtigen Passage entfernt, distanzierte und reseeded werden. Umgekehrt, wenn post-Dissoziation die Lebensfähigkeit der Zellen unter 80%, so kann dies während der Dissoziation indikativ exzessiver Pipettieren sein. Neurale Vorläuferzellen, insbesondere deren differenzierte Pendants, sind empfindlich gegenüber Änderungen des pH außerhalb des physiologischen Bereichs und Kontakt mit Luft. Die Beobachtung des plötzlichen weit verbreiteten Zelltod kann auf diese Faktoren zurückzuführen sein. Folglich ist ein kritischer Schritt bei der Medien changes ist für die Medien frisch jedes Mal vorgenommen werden, und nur 50% des Volumens für die ersetzt werden. Schließlich, während mitogenen Faktoren EGF und bFGF das Überleben und die Vermehrung von Hippocampus neuralen Vorläufer unter serumfreien Bedingungen in vitro 22,23 unterstützen die zelluläre Reaktion auf diese Mitogene ist stark abhängig von der Zellentwicklungsalter und mitogenen Konzentration 24,25. Daher ist in diesen Komponenten minimal experimentellen Variation sichergestellt ist entscheidend für die Erzeugung konsistente, reproduzierbare Zellkulturen.
Für eine maximale Tragfähigkeit sollten die Zellen innerhalb von 6 Stunden post mortem ausgesät für die Kultur werden. Jedoch kann das extrahierte Gehirn vorübergehend in PBS bei 4 ° C gelagert werden. Diese Modifikation kann für die Isolierung ermöglichen , indem bis zu 24 Stunden bei minimaler Reduzierung der Zellausbeute 26,27 verzögert werden. Wachstumsfaktor-Supplementierung des Kulturmedien können auch die Proliferation zu verbessern modifiziert werden oder die differe zu fördernntiation von spezifischen neuronalen Zelltypen. Insulin-like growth factor 1 (bei 100 ng / ml) wurde in vitro 28,29, während unter Differenzierungsbedingungen pro-neuronaler Faktor BDNF 30 in Verbindung verwendet werden können , solche mit Faktoren eine unterstützende Wirkung auf rodent neuralen Stammzellen haben gezeigt wie Interleukin 7 (bei 500 ng / ml) oder Retinsäure (bei 0,1 uM) , um eine Ausrichtung auf neuronal - Subtyps oder glialen Differenzierung 31,32 zu induzieren.
Die Entscheidung, ob neurale Vorläuferzellen als Floating-Neurosphären oder als Anhänger einschichtige zu erweitern, hängt weitgehend von den gewünschten Downstream-Anwendungen und Kultureigenschaften. Während die Neurosphärenkultur-System stark vereinfacht und in hohem Maße reproduzierbar ist, ist es in seiner Fähigkeit beschränkt auf homogene Populationen von Zellen zu erzeugen. Der Komplex Mikro innerhalb jeder Kugel kann die Apoptose und spontane Differenzierung zu fördern, fördern eine heterogene Population 33, während reported Fusion von Neurosphären , die 34 Quantifizierung von neuralen Vorläuferzellpopulationen durcheinander bringen kann. Darüber hinaus führen die wiederholten mechanischen Dissoziation für Neurosphere Durchgang erforderlich ist, kann auch zu schädlichen Stress, Seneszenz oder sogar den Zelltod. Die Verwendung alternativer Dissoziation Enzym, wie Papain, kann die resultierende Lebensfähigkeit der Zellen 16 beeinflussen. Im Gegensatz dazu fördert die anhaftende einschichtige Kultursystem, mit gleichmäßiger Belastung durch Umwelt Mitogene, größere Homogenität in Zelltyp und symmetrischer Teilung. Dieses System wurde eine Nische unabhängige Population von Zellen zu erzeugen , gezeigt ist , basierend auf der Expression von Schlüsselstammzellmarker 35,36. Dieses System erfordert die Verwendung von vorbeschichteten Kulturgefäße zelluläre Anhaftung zu fördern. Die Wahl der Kultursubstrat sollte sorgfältig geprüft werden, da es 25,37 erhebliche Auswirkungen auf die Differenzierungsprofil der kultivierten neuronalen Vorläufer haben können.
Here präsentieren wir effektive Protokolle für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von adulten Hunde-Hippocampus - neuralen Vorläuferzellen aus frischem post mortem Gewebe. Erwachsene Hunde neurale Vorläufer sind 18 in der Literatur unterrepräsentiert sind ; mit vollständigen Protokolle für deren Isolierung und Expansion, noch weniger 17. Unsere Protokolle können dann dazu dienen, das Bewusstsein für diese wertvollen Tiermodell zu erhöhen und eine wichtige Ergänzung zu dieser bescheidenen Anzahl von Studien darstellen. Von Bedeutung ist, werden unsere einzigartige Methode, erwachsene Hunde-Hippocampus-neuralen Vorläufer mit erfolgreich mehr als 10 Populationsverdopplungen erweitert. Eine ähnliche Studie erwachsene Hunde-Hippocampus - neuralen Vorläufer unter Verwendung berichtet , dass größere Neurosphären, bei 100 agierten - 150 & mgr; m im Durchmesser, 17 Proliferation jenseits der fünften Generation aufgehört. Wie in unserem Protokoll erwähnt, kann eine übermäßige Neurosphere Wachstum spontane Differenzierung und Apoptose, zu fördern, die über serielle Passage l aufweisened auf diese reduzierte proliferative Fähigkeit. Wir stellen auch ein Protokoll für adhärente einschichtige Erweiterung dieser Zellpopulation als eine Alternative zu den klassischen Neurosphäre Expansionssystem 17-21. Dieses alternative System bietet dem Anwender mehr Kontrolle über die zellulären Umgebung und erweitert erheblich den Bereich der nachgelagerten Anwendungen für diese Zellen, mit Potenzial für die phänotypische Homogenisierung und gerichtete neuronale Differenzierung 35,38.
Kultivierte erwachsene Hunde-Hippocampus-neuralen Vorläuferzellen haben Anwendungen in einem breiten Spektrum von zellulären und neurobiologischen Forschung. Der Eckzahn Gehirn besitzt eine engere Homologie mit dem menschlichen Gehirn als die bestehenden Nagetiermodellen. Als solche erwachsene Hunde darstellen neuralen Vorläuferzellen eine wichtige, aber under, Ressource. Diese Zellen verwendet werden können beim Menschen einen weiteren Einblick in die Mechanismen hinter der adulten Neurogenese zu gewinnen und für die Entwicklung von regenerativen Therapien, die Target diesen Prozess.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
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