Summary
köpek beyin yetişkin nörogenezi incelemek için değerli bir modeldir. izole ve primer beyin dokusundan yetişkin köpek hipokampal nöral prekürsör hücrelerin genişletilmesi için protokoller burada sundu.
Protocol
New South Wales, Avustralya hukuku uyarınca ölüm sonrası beyin dokusu, çalışmayla ilgisi olmayan nedenlerden dolayı ötenazi yetişkin köpekler elde edildi.
Kültür Ortamı 1. Hazırlık
- damıtılmış suyun 100 ml jelatin tozu 0.1 g ilave edilir ve çözünene değin 37 ° C'de ajite ile% 0.1 jelatin çözeltisi hazırlayın. 15 dakika boyunca UV-ışını ile çözelti sterilize edin. Bu ortam daha sonra 1 ay kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- DMEM, 500 ml (4.5 g / L D-glikoz) F-12 167 ml ilave etmek suretiyle Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ve besleyici karışımı F12: 1 oranında 3 hazırlayın. (% 1 son konsantrasyon için) Penisilin / streptomisin solüsyonu 6.7 ml ilave edilir. Bu ortam, 1 aya kadar 4 ° C'de karanlıkta saklanabilir.
- DMEM (4.5 g / L D-glikoz), 440 ml birleştirerek serum ortamında 500 ml hazırlanması 5 mi L-alanil-L-glutamin dipeptit (200 mM), penisilin / streptomisin ve 5 ml ve fetal Bovin 50 mie serumu (FBS). Bu ortam, 1 aya kadar 4 ° C'de karanlıkta saklanabilir.
- Tam büyüme ortamı Kök Hücre, nötr (NSC) Bazal Orta ve çoğalma Sinir Ek A (NS-A),% 2 FBS, 2 ug / ml heparin, 20 ng / ml, epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 10 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF). Bir su banyosu içinde 37 ° C'ye kadar, bu ortam, taze beyin diseksiyon hemen önce ve sıcak sağlayın.
2. Beyin Ekstraksiyon
- Povidon-iyot kullanarak köpeğin kafasının dorsal yüzeyini sterilize 6 saat otopsisi içinde çıkarma başlayın.
- Bir neşter kullanılarak, altta yatan masseter kasları ortaya çıkarmak için, kafatası tüm dorsal yüzeyi boyunca, sagital orta hat boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak. bu kesim uzunluğu köpek türleri ve yaşına göre değişir.
- Kafatası rostral ve kaudal sınırlarda ek 5 yapmak - her iki tarafta 10 cm dik keser, pasSırasıyla gözlerin ve kulakların arkasında ing cilt tamamen yansıtılması için izin vermek.
- Bir neşter kullanılarak, kafatasının sagital tepe onların ekten masseter kasları ayırmak ve kafatası kalan bağ dokusu kazıyın.
- bir salınım kemiği kullanarak çevresel doğrultusunda kafatası kap kesti testere. Bir prob kullanılarak ya da dura ile kalan ekleri sever neşter ve sonra dikkatlice kafatası kapağı çıkarın beyin dorsal yüzeyini ortaya çıkarmak.
Dikkat: Kemik kalınlığı kafatası farklı bölgelerde değişiklik gösterir, bu yüzden dikkatli çok derin nüfuz ve altta yatan beyin zarar vermeyecek olunmalıdır. - Üst servikal omurlar arasındaki bir neşter takarak omurilik Sever.
- yavaşça beyin kaldırmak için tek elle dikkatlice kranial fossa beyin özgür ve ventral tarafta bulunan bağlantı sinirler ve kan damarları sever için bir neşter kullanabilirsiniz. Yavaşça b asansörKafatasının üzerinden ve DPBS bir kap içine yağmur.
Dikkat: köpek beynin büyük koku ampuller ön fossa derinliklerine uzatabilir. beyin çıkartırken bu yapıları korumak amacıyla dikkatli olunmalıdır.
3. Hipokampal Diseksiyon
- 150 mm Petri kabı üzerine herhangi bir kan çıkarın ve aşağı doğru sırt tarafında yerleştirmek Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) içinde beyin durulayın.
- Yavaş yavaş ıslak beyin bıçak ve bıçak tam uzunlukta kullanan bir tek dilim kullanarak mid-sagital düzlemde uzunlamasına beyin bisect. Ek aşağı yönlü baskı uygulayabilir veya bu dokuya zarar verebileceğinden, bir testere hareketi kullanmayın.
- Her yarımkürede medial, yukarı yüzey bir neşter ve ince forseps kullanarak hipokampus teşrih ve 35 mm doku kültürü çanak aktarın yerleştirilmesi.
Sinir Öncü Hücreler 4. İzolasyon
- t kıymayaklaşık 1 mm 3 adet içine neşter bıçak kullanarak sorunu örnekleri.
- , 15 ml'lik bir tüp içine doku transferi% 0.1 tripsin EDTA 2 ml ekleyin ve 37 ° C'de bir su banyosunda 7 dakika boyunca inkübe edin.
- tüpe serum ortamında 4 ml ekleyerek enzim reaksiyonu durdurur. 7 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj ile süspansiyon pelet ve supernatant çıkarın.
- DPBS 300 ul Topak tekrar askıda bırakılmıştır ve mekanik hafifçe düz bir homojenat oluşana dek, 1000 ul pipet kullanarak aşağı ve yukarı pipetlenerek sonucu ayrılır.
- tüp, serum medya 14 ml ekleyin ve 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçmektedir. 7 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj ile süspansiyon topak süpernatantı kaldırmak ve tam büyüme ortamında tekrar süspansiyon.
5. Neurosphere Kültür
- izolasyon elde edilen hücre süspansiyonu, Tripan mavisi ve hemo kullanarak yaşayan hücrelerin sayısınısitometre.
- 6 yuvalı plaka kaplanmamış kuyulara 1 x 10 5 hücre / cm2'de tam büyüme ortamında tohum hücre süspansiyonu ile seyreltilir.
- 37 ° C'de 14,% 5 CO2 ve>% 95 nem inkübe - 28 gün, her 7 günde bir büyüme ortamı% 50'sini. Düzenli neurospheres çapını ölçün. çapı 100 mikron ötesinde büyümeye izin verseydi, hücre ölümü ve spontan farklılaşma neurospheres içinde oluşabilir.
6. Neurosphere Passage
- Neurospheres yaklaşık 100 mikron çapında ulaşmak kayan kültür olarak geçit, tek bir tüp içine tüm neurosphere içeren medyayı birleştirir. 7 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj ile pelet ve süpernatant kaldırmak.
- % 0.1 tripsin EDTA 1 ml pelet yeniden süspanse edin ve 37 ° C'de bir su banyosunda 7 dakika boyunca inkübe edin. Yavaşça yukarı pipet ve 100 kat aşağı, 200 ul pipet kullanarak, dissociati sağlamakneurospheres üzerinde.
- 7 dakika boyunca 100 x g'de tüp ve santrifüj serum ortamında 5 ml ilave enzim reaksiyonu durdurur.
- Süpernatantı 1 ml hücre pelletini tam büyüme ortamı tekrar süspansiyon ve Tripan mavi boya dışlanma ve hemasitometre kullanarak canlı hücre sayısını.
- 6 yuvalı plaka kaplanmamış kuyulara 1 x 10 5 hücre / cm2'de tam büyüme ortamında tohum hücre süspansiyonu ile seyreltilir. Her 7 gün büyüme ortamı% 50 yerine, 28 gün - 37 ° C, 14% 5 CO2 ve>% 95 nemde inkübe edin.
7. Yapışık Kültür Sinir Öncü Hücreler
- önceden yapışkan kültür Neurospheres işlem 1 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatör içinde doku kültürü çanağı ve tedavi yüzeyini kapsayacak şekilde% 0.1 jelatin solüsyonu yeterli bir hacim.
- Yüzen neurosphere kültürü, tek bir tüp içine tüm medya birleştirir. neur pelet100 x g'de santrifüj ile ospheres 7 dakika ve süpernatan.
- % 0.1 tripsin EDTA 1 ml pelet yeniden süspanse edin ve 37 ° C'de bir su banyosunda 7 dakika boyunca inkübe edin. Yavaşça yukarı pipet ve 100 kat aşağı, 200 ul pipet kullanarak.
- 7 dakika boyunca 100 x g'de Enzim reaksiyonu ve santrifüj durdurmak için serum ortamında 5 ml. Süpernatantı atın ve tam büyüme ortamı 1 ml hücre pelletini ve Tripan mavi boya dışlanma ve hemasitometre kullanarak canlı hücre sayısını.
- Tam büyüme ortamında hücre süspansiyonu seyreltilir doku kültürü şişelerinden jelatin çıkarın ve / cm2, 1 x 10 4 hücre hücreleri tohum.
- 37 ° C,% 5 CO2 ve>% 95 nemde inkübe hücreleri. Kültür yaklaşık% 80 izdiham (yaklaşık 7 gün sonra) ulaşıncaya kadar her üç günde bir, taze, ısındı, tam büyüme ortamı ile değiştirin.
8. Neural Koloni Oluşturan Deneyi
- Sinir Koloni oluşturan hücre (NCFC) Analiz ortamı bileşenleri Birleştir: NCFC serum barındırmayan ortam, çoğalma NS-A, ve kolajen çözeltisi (3 mg / ml). / Ml heparin 2 ug, 20 ng / ml EGF ve 10 ng / ml bFGF, bu ortam ilavesi.
- Deney ortamı oluşturan nöral koloni hücreler hipokamp dokusunda ayrışma tekrar süspansiyon haline sonra, bir su banyosu içinde 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış. 35 mm kültür tabağı içine 1.1 x 10 5 hücre / ml 'lik bir klonal yoğunlukta hücreler tohumu.
- 37 ° C,% 5 CO2 ve>% 95 nem oranında, bu yan-katı kollajen matris hücreleri inkübe edin. 28 gün süre ile kültür, her 7 günde bir büyüme ortamı% 50 değiştirilmesi.
Sinir Öncü Hücreler 9. Farklılaşma
- Differentia hücreleri işlemeden önce 24 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatör içinde doku kültürü çanağı ve tedavi yüzeyini kapsayacak şekilde 5 ug / cm 2 laminin solüsyonu yeterli bir hacmi eklemeyon.
Not: laminin çözüm çıkarın ve tohumlama hemen önce DPBS iki kez kaplanmış yüzey durulama. - Pasaj olduğunda, DMEM-F12, 1 x 10 4 hücre / cm2'de hücre süspansiyonu tohum (3: 1) üzerinde 20 ng / ml EGF ve 40 ng / ml bFGF ile takviye edilmiş ortam (önceden ısıtılmış 37 ° C) laminin kültür çanak kaplı.
- 37 ° C'de,% 5 CO2 ve>% 95 nem hücreleri inkübe ve hücreler 3 gün süreyle çoğalmaya izin verir.
- (3: 1) Medya 37 ° C önceden ısıtılmış, 10 ng nörotrofik faktör (BDNF) türetilmiş / ml beyin ile desteklenmiş 3 gün DMEM-F12 içeren farklılaşma medya ile medya yerine sonra, yapışık nöral prekürsör hücreleri ayırt etmek.
- farklılaşma sırasında her 3 günde bir ortamın% 50'sini. 28 gün - Farklılaşma yaklaşık 21 boyunca yavaş yavaş ortaya çıkar.
Dikkat: hücrelerin ayırt başladığı zaman, sadece bir ti ortam% 50'sinihavaya maruz kalma gibi me hücrelerinin sağlığı üzerinde zararlı bir etkiye sahip olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro sinir habercisi deneyleri, nöron ve sinir öncü hücre popülasyonlarının kullanımı sayesinde karakterize ve yetişkin köpek hipokampusun dorsoventral ekseni üzerinde karşılaştırıldı. İzole hipokampal doku türetilen sinir ön-madde hücreleri, kültür, 100 um 28 ile günlük bir çapa ulaşmaktadır izolasyon 14 gün içinde Neurospheres kayan Oluşan. dorsal ve ventral izolatlardan türetilmiş Neurospheres ortalama boyutta bir fark gösterdi ve tek tek hücreler içine enzimatik ayrılma sonrasında neurosphere kültürleri değişken olarak geçişli olabilir. Her iki hipokampal bölgelerden ikincil yüzen Neurospheres geçit itibaren 5 gün içinde oluşturmak başardık. % 0.1 jelatin kaplı kültür şişeleri üzerine 1 x 10 4 hücre / cm 2 numaralı seribaşı zaman nöral öncü hücreler olarak da yapışık mono tabakaları (Şekil 1A) çoğalırlar başardık. Resim morfolojik farklılıklar betwee gözlenmiştirn dorsal ve ventral hipokampal nöral prekürsör hücreleri ve her ikisi de yapışık kültürler herhangi geçit-time (Şekil 1B) yavaşlama gözlenen olmadan 10 yaş üstü nüfus çiftlenmeler geçmesi başardık. Yapışık kültüründe Nestin ve Sox2 nöral kök hücre gen ifadesi (Şekil 2) hipokampal dorsoventral eksen boyunca önemli ölçüde farklı değildi. Bu hücrelerin sinir habercisi kimliğini doğrulayan gen ve protein ifade Daha kapsamlı karakterizasyonu, bizim yayınladığı verilere 7 bildirilmiştir.
Uyarlanmış Sinir Koloni Oluşturan tahlil 4,6 kullanarak biz dorsal karşısında sinir öncü hücre popülasyonlarının ve köpek hipokampus ventral alt bölgelerinde potansiyel farklılıkları ölçmek amacıyla nöral prekürsör hücre frekansı değerlendirildi. Hücreler, Şekil 3A (hücre füzyonu önleyen bir yan-katı kollajen matris içinde klonal yoğunlukta ekildi ve 28 gün boyunca kültüre edilmiştir F = 96.8; p = 0.001; Şekil 3B ).
farklılaşma koşullar altında, yapışık köpek nöral öncü hücreler daha uzun ve daha ayrıntılı işlemler geliştirilmesi, brüt morfolojisi ilerleyici değişiklikler gösterdi. Nöronal (βIII-tübülin) ve glial (Glial fibriler asidik protein; GFAP) için protein ifade belirteçleri de farklılaşma (Şekil 4) Aşağıdaki arttı. Anlamlı fark dorsal ve ventral izolatlar arasında pozitif etiketli hücrelerin sayısı görülmektedir. Bizim daha önce yayınlanmış veriler up-regülasyonu ilişkili genlerin nöral aşağı-regülasyonu ile birlikte gösteren, bu protein ifade değişiklikleri doğrular 28 gün farklılaşma dönemi 7 üzerinde habercisi genler.
Şekil 1:. Dorsal ve ventral hipokampal bölgelerinden izole yetişkin köpek Hipokampal Sinir Öncü Hücreler in vitro artışı hem yetişkin köpek hipokampal nöral ön-madde hücreleri, (A) değişken neurospheres veya yapışkan bir tek tabaka (B) olarak genişletilir (C) gibi. yapışık tek tabaka bu nöral öncü hücreler hızını iki katına önemli bir düşüş olmadan 10 defadan fazla geçişini geçirebileceği. n = 5; ölçek = 50 mikron. Yayınlanmış şekil 7 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/ftp_upload/54953/54953fig2.jpg "/>
Şekil 2:. Üreyen yetişkin köpek Hipokampal Sinir Öncü hücrelerinde gen ekspresyonu sinir kök hücre genlerin ifadesi (A) Nestin (B) Sox2 yapışık proliferatif kültür koşulları altında yetişkin köpek hipokampal nöral öncü hücrelerin doğrulanmıştır. Bu genlerin sentezlenmesi dorsal ve ventral hipokampüs türetilmiş hücreler, hem de eşit düzeydedir. Yetişkin köpek fibroblastlar göreceli gen ifadesi farklılıkları karşılaştırmak için bir kontrol çizgisi olarak kullanılmıştır. n = 5; Hata çubukları, = SEM. Yayınlanmış şekil 7 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Sinir Koloni Oluşturan Deneyi (A)Bir yan-katı kollajen matrisi içine klonal yoğunlukta ekildi yetişkin köpek nöral ön-madde hücreleri, kültür 28 gün içinde bir şekilde Neurospheres. (B), dorsal hipokamp türetilen sinir ön-madde hücreleri, türetilenler göre birim alan başına neurospheres önemli ölçüde daha büyük sayılar üretmek ventral hippocampus. n = 5; Hata çubukları = SEM; ölçek = 50 mikron. Yayınlanmış şekil 7 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Farklılaştırılmış Yetişkin Köpek Hipokampal Sinir Öncü Hücreler İmmünositokimya 28 gün BDNF kültüre, dorsal ve ventral hipokampus hem yetişkin köpek nöral öncüleri olgun nöronal (βIII-tübülin po içine ayırtsas) ve glial (GFAP pozitif) hücre türleri. n = 5; ölçek = 50 mikron. Yayınlanmış şekil 7 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan protokoller hücre canlılığını maksimize etmek için elverişli kültür koşullarını korumak için optimize edilmiştir. ekstraksiyon, izolasyonu ve genişleme sırasında alınan hız ve bakım kritik önem taşımaktadır. yapışık tek tabaka genişleme kurulması için kritik bir adım birincil neurospheres etkin ayrışma olduğunu. geçit ardından, yeterince Neurospheres ikincil yüzen neurospheres oluşturabilir ayrışmış. Medya değişikliği sırasında bu Neurospheres kaldırılır ayrışmış ve yapışık tek tabaka geçişi için reseeded olabilir. sonrası ayrılma hücre yaşayabilirliği% 80 in altında ise, tersine, bu ayrılma sırasında aşırı pipetleme göstergesi olabilir. Sinir ön-madde hücreleri, ve özellikle farklılaşmış meslektaşları, fizyolojik aralık dışındaki pH değişiklikleri ve havaya maruz duyarlıdır. Ani yaygın hücre ölümü gözlem bu faktörlere bağlı olabilir. Medya chan sırasında Sonuç olarak, kritik bir adımdırges medya taze her zaman yapılacak ve hacminin sadece% 50'sini değiştirilecek içindir. Mitojenik faktör EGF ve bFGF in vitro 22,23 serum içermeyen koşullar altında yaşamda kalma ve hipokampal nöral öncülerinin proliferasyonunu desteklemesidir Son olarak, bu mitojenlere hücresel yanıt, hücre gelişim yaş ve mitojenik konsantrasyonu 24,25 son derece bağlıdır. Bu nedenle, bu bileşenler çok az deney varyasyon temin tutarlı ve tekrarlanabilir hücre kültürlerinin üretilmesi için çok önemlidir.
Maksimum canlılık, hücreler 6 saat sonra ölüm içinde kültüre ekildi edilmelidir. Bununla birlikte, ekstre beyin geçici 4 ° C'de PBS içinde depolanabilir. Bu değişiklik, hücre verimi 26,27 minimal azalma ile 24 saate kadar gecikmeli olarak yalıtım izin verebilir. Kültür ortamı büyüme faktörü takviyesi de proliferasyonu arttırmak veya Ayırıcı teşvik etmek için modifiye edilebilirBelirli bir nöral hücre tiplerinin ntiation. Farklılaşma şartlar altında ön-nöronal faktör BDNF 30 faktörler ile bağlantılı olarak kullanılabilir iken insülin-benzeri büyüme faktörü 1 (100 ng / ml) in vitro 28,29 kemirgen nöral kök hücreleri üzerinde destekleyici bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir İnterlökin 7 ya da retinoik asit (500 ng / ml'de) (0.1 uM), nöronal alt ya da glial farklılaşma 31,32 doğru bir önyargı uyarılması için.
yüzen neurospheres olarak veya bir yapışık tek tabaka olarak nöral prekürsör hücreleri genişletmek için konusunda karar büyük ölçüde istenilen çıkış uygulamalar ve kültür özelliklerine bağlıdır. neurosphere kültür sistemi basit ve yüksek oranda çoğaltılabilir olmakla birlikte, bu hücrelerin homojen popülasyonları üretmek için yeteneği sınırlıdır. Her alanı içinde karmaşık mikroçevresinin, temsilcisi ise apoptoz ve spontan farklılaşma, heterojen bir nüfusa 33 teşvik teşvik edebilirNöral prekürsör hücre popülasyonlarının 34 kantifikasyonunu bulandırabilir neurospheres orted füzyon. Ayrıca, neurosphere geçişi için gerekli tekrarlanan mekanik ayrıştırma da zararlı stres, yaşlanma ya da hücre ölümüne yol açabilir. Alternatif ayrışma enzim kullanımı, örneğin papain gibi, elde edilen hücre canlılığı 16 etkileyebilir. Bunun aksine, yapışkan tek tabakalı kültürü sistemi, çevre mitojenlere daha muntazam maruz hücre tipi ve daha simetrik bölümü daha büyük bir homojenlik teşvik eder. Bu sistem, temel kök hücre belirteçleri 35,36 sentezlenmesi göre bir hücre niş bağımsız bir popülasyonu üretmek için gösterilmiştir. Bu sistem, hücre yapışmasını geliştirmek için önceden kaplanmış kültür teknelerinin kullanılmasını gerektirir. Bu kültüre nöral öncüleri 25,37 farklılaşması profilinde önemli etkilere sahip olabilir Kültür alt-tabaka seçimi, dikkatli bir şekilde dikkate alınmalıdır.
Here biz taze post mortem doku yetişkin köpek hipokampal nöral öncü hücrelerin izolasyonu, genişlemesi ve farklılaşması için etkili protokolleri sunuyoruz. Yetişkin köpek nöral öncüleri literatürde 18 altında temsil edilmektedir; izolasyon ve genişleme için tam protokoller, daha az yani 17 ile. Bizim protokoller daha sonra bu değerli hayvan modelinde bilincini artırmak ve çalışmaların bu mütevazı sayıda önemli ek temsil etmek hizmet edebilir. önemi, eşsiz yöntemi kullanarak, yetişkin köpek hipokampal nöral öncüleri başarıyla 10'dan fazla nüfus çiftlenmeler genişletilebilir. Çapı 150 mikron, beşinci nesil 17 ötesinde çoğalmasını durdurdu - yetişkin köpek hipokampal nöral öncüsü kullanılarak benzer bir çalışma 100'de pasajlandı büyük Neurospheres, bildirdi. Bizim protokolde belirtildiği gibi, aşırı neurosphere büyüme l olabilir seri geçit üzerinde olan spontan farklılaşma ve apoptoz teşvik edebilirBuna Ed çoğalma yeteneklerini azalttığını göstermektedir. Ayrıca, klasik neurosphere şişirme sisteminin 17-21 alternatif olarak, bu hücre popülasyonu yapışık tek tabaka genişletme için bir protokol sağlar. Bu alternatif sistem, hücresel çevre üzerinde kullanıcı daha fazla kontrol tanıyor ve anlamlı fenotipik homojenizasyon ve yönetmenliğini nöronal farklılaşma 35,38 potansiyeline sahip, bu hücreler için aşağı uygulama yelpazesini genişletmektedir.
Kültürlü yetişkin köpek hipokampal nöral prekürsör hücreleri hücresel ve nörobiyolojik araştırma alanları geniş bir yelpazesinde uygulamalar var. köpek beyin mevcut kemirgen modellerinde daha insan beynine yakın bir homoloji sahiptir. Bu nedenle, yetişkin köpek nöral öncü hücreleri önemli bir, henüz understudied, kaynak temsil etmektedir. Bu hücreler insanlarda yetişkin nöron arkasında mekanizmalarına daha fazla fikir edinmek için kullanılabilir ve rejeneratif tedavilerin geliştirilmesi için olabileceğini targarkadaşları bu süreç.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
- Kheirbek, M. A., Hen, R. Dorsal vs ventral hippocampal neurogenesis: implications for cognition and mood. Neuropharmacol. 36 (1), 373 (2011).
- Tanti, A., Rainer, Q., Minier, F., Surget, A., Belzung, C. Differential environmental regulation of neurogenesis along the septo-temporal axis of the hippocampus. Neuropharmacol. 63 (3), 374-384 (2012).
- Eriksson, P. S., et al.
- Bull, N. D., Bartlett, P. F. The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell. J Neurosci. 25 (47), 10815-10821 (2005).
- Kempermann, G., et al. Why and how physical activity promotes experience-induced brain plasticity. Front Neurosci. 4 (189), 1-9 (2010).
- Golmohammadi, M. G., et al. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26 (4), 979-987 (2008).
- Lowe, A., et al. Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus. Neurosc. Lett. 593, 107-113 (2015).
- Sasaki, M., et al. MRI identification of dorsal hippocampus homologue in human brain. Neuroreport. 15 (14), 2173-2176 (2004).
- Powell, E. W., Hines, G. The Hippocampus. , Springer. 41-59 (1975).
- Jung, M. -A., et al. Canine hippocampal formation composited into three-dimensional structure using MPRAGE. J Vet Med Sci. 72 (7), 853-860 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
- Oliver-Dela Cruz, J., Ayuso-Sacido, A. Neural stem cells from mammalian brain: isolation protocols and maintenance conditions. INTECH Open Access Publisher. , (2012).
- Pacey, L., Stead, S., Gleave, J., Tomczyk, K., Doering, L. Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation. Nat Protoc. , (2006).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
- Lim, J. -H., Koh, S., Olby, N. J., Piedrahita, J., Mariani, C. L. Isolation and characterization of neural progenitor cells from adult canine brains. Am J Vet Res. 73 (12), 1963-1968 (2012).
- Herranz, C., et al. Spontaneously Arising Canine Glioma as a Potential Model for Human Glioma. J Comp Pathol. 154 (2), 169-179 (2016).
- Walton, R. M., Parmentier, T., Wolfe, J. H. Postnatal neural precursor cell regions in the rostral subventricular zone, hippocampal subgranular zone and cerebellum of the dog (Canis lupus familiaris). Histochem Cell Biol. 139 (3), 415-429 (2013).
- Walton, R. M., Wolfe, J. H. Abnormalities in neural progenitor cells in a dog model of lysosomal storage disease. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (8), 760-769 (2007).
- Milward, E. A., et al. Isolation and transplantation of multipotential populations of epidermal growth factor-responsive, neural progenitor cells from the canine brain. J Neurosci Res. 50 (5), 862-871 (1997).
- Ray, J., Peterson, D. A., Schinstine, M., Gage, F. H. Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (8), 3602-3606 (1993).
- Palmer, T., Ray, J., Gage, F. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 6 (5), 474-486 (1995).
- Zhu, G., Mehler, M., Mabie, P., Kessler, J. Developmental changes in progenitor cell responsiveness to cytokines. J. Neurosci. Res. 56 (2), 131-145 (1999).
- Whittemore, S. R., Morassutti, D. J., Walters, W. M., Liu, R. -H., Magnuson, D. S. Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations. Exp. Cell. Res. 252 (1), 75-95 (1999).
- Kennedy, P. Postmortem survival characteristics of rat glial cells in culture. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 50 (6), 798-800 (1987).
- Viel, J. J., McManus, D. Q., Cady, C., Evans, M. S., Brewer, G. J. Temperature and time interval for culture of postmortem neurons from adult rat cortex. J. Neurosci. Res. 64 (4), 311-321 (2001).
- Huat, T. J., et al. IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesenchymal stem cells to neural progenitor-like cells. BMC Neurosci. 15 (91), 1-13 (2014).
- Supeno, N. E., et al. IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells. Int. J. Med. Sci. 10 (5), 522-531 (2013).
- Ahmed, S., Reynolds, B. A., Weiss, S. BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors. J Neurosci. 15 (8), 5765-5778 (1995).
- Wohl, C. A., Weiss, S. Retinoic acid enhances neuronal proliferation and astroglial differentiation in cultures of CNS stem cell-derived precursors. J Neurobiol. 37 (2), 281-290 (1998).
- Araujo, D. M., Cotman, C. W. Trophic effects of interleukin-4,-7 and-8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res. 600 (1), 49-55 (1993).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), 283 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1 112-120 (2006).
- Ma, W., et al. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 8 (90), 1-13 (2008).
- Goffredo, D., et al. Setting the conditions for efficient, robust and reproducible generation of functionally active neurons from adult subventricular zone-derived neural stem cells. Cell Death Differ. 15 (12), 1847-1856 (2008).
