Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

As cinases de proteínas são sofisticadas enzimas críticas para a transmissão de sinais celulares em respostas apropriadas ¹ . Dado o seu papel na manutenção da homeostase e na prevenção ou promoção de estados de doença ² , os métodos bioquímicos para avaliar a actividade de quinase continuam a ser ferramentas poderosas para delinear as particularidades da sinalização eucariótica ³ . Embora as estratégias que utilizam anticorpos fosfo específicos tenham sido altamente informativas em termos de medição dos efeitos de diferentes condições de tratamento no estado de sinalização celular ⁴ , um ensaio de cinase permite medir os efeitos de diferentes condições de tratamento directamente em termos da actividade enzimática de uma cinase de interesse. Embora existam várias opções para ensaios semelhantes que não utilizam materiais radioactivos ⁵ , continuamos a depender deste método para uma quantificação robusta dos resultados. LáSão duas aplicações típicas deste ensaio, ambas valiosas por razões diferentes: o ensaio de quinase imunoprecipitado (IP) ( Figura 1 ) e o ensaio de proteína quinase recombinante ( Figura 2 ).

O ensaio de quinase de IP é tremendamente útil para identificar factores capazes de activar cinases de proteína específicas, bem como avaliar as condições de tratamento inibitório. Resumidamente, uma quinase marcada com epítopo de interesse é transfectada em células eucarióticas cultivadas, submetida a uma variedade de tratamentos, imunoprecipitada e ensaiada quanto à capacidade de incorporar fosfato radiomarcado num substrato modelo ( por exemplo, proteína básica de mielina (MBP)). O ensaio de quinase de IP pode também ser realizado sem recorrer à sobre-expressão, quer por imunoprecipitação de proteína endógena ou qualquer número de técnicas de edição genómica. Uma vez que os tratamentos são administrados em cultura, este método pode detectar estimulações transmitidas através de múltiplos factores a montanteOu paralelas por leitura in vitro . Uma grande vantagem deste método é que não requer conhecimento prévio de factores directos a montante ou a jusante ou sítios de fosforilação. Além disso, uma vez identificados substratos específicos para uma quinase de interesse, o mesmo protocolo de ensaio de cinase pode ser utilizado com componentes recombinantes para medir actividade específica em relação a substratos naturais e identificar locais de fosforilação específicos quando combinados com análise de espectrometria de massa. Os locais identificados desta maneira podem ser ainda validados com ensaios de quinase utilizando mutantes de substrato. Por último, este método também pode ser utilizado para detectar e medir a autofosforilação.

O protocolo proporcionado aqui pressupõe um esquema de purificação de proteínas optimizado ou método de transfecção para expressar uma cinase marcada por afinidade de interesse em células cultivadas. Para exposições mais detalhadas de transfecção, lise, imunoprecipitação e protOcols, sugerimos referir-se a Cold Spring Harbor Protocolos ⁶ . Para obter mais informações sobre o desenvolvimento e modificação do ensaio, consulte a Fosforilação de Proteínas: Métodos Selecionados na Enzimologia ⁷ .

1. Kinase Recursos de Purificação e General Immunoprecipitation Pipeline

NOTA: As quinases para utilização com este ensaio podem ser obtidas a partir de imunoprecipitados de células cultivadas ou por meios recombinantes tais como a purificação marcada por afinidade ⁶ . Abaixo está um protocolo geral para a imunoprecipitação marcada por sinalização que pode ter de ser modificada dependendo da quinase de interesse. Tudo deve ser mantido em gelo quando possível.

1. Adicionar 2 μL de 1 mg / mL de anticorpo a 200 μL de lisados ​​celulares (geralmente ~ 1 mg / mL de concentração total de proteína) e incubar a 4 ° C durante 1 h enquanto balança.
2. Lavar as esferas de proteína Sepharose 2-3 vezes com tampão de lise (ver abaixo) por centrifugação breve a 4 ° C durante 30 s a 1 min a 5.000 xg ("spin toque"), remoção do sobrenadante com uma pipeta e resuspensão de esferas em tampão .
   1. Preparar tampão de lise: HEPES 50 mM pH 7,7, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EGTA 1 mM, glicerol a 10%, ortovanadato de s�io 0,2 mM, fluoreto de s�io 100 mM, p-glicerofosfato 50 mM, Triton X 100 a 0,1% ou NP-40 a 0,1%.
3. Adicionar 30 μL de pasta de 50% de pérolas de sepharose de proteína A em tampão de lise a lisados; Incubar a 4 ° C durante 1 h enquanto balançando.
4. Toque a centrifugação a 4 ° C para sedimentar as esferas e remova o sobrenadante.
5. Lavar 3 vezes com 1 mL de tampão de lavagem de pérolas (NaCl 1 M, Tris 20 mM pH 7,4).
6. Lavar uma vez com tampão de reacção 1x quinase (HEPES 10 mM pH 8,0, MgCl ₂ 10 mM). Remova o máximo possível de tampão sem remover as contas.

2. Inicializando Reações de Quinase

NOTA: Para ensaios de cinase IP, ~ 15 μL de contas não suspensas é uma amostra inicial típica. Para ensaios de proteína quinase recombinante, as quantidades de partida típicas variam de 0,1-1,0 μg em 1-10 para 25-50 μL de volumes de reacção final. Ajustar os volumes da amostra de proteína recombinanteS para serem iguais com o tampão que são armazenados antes da inicialização do ensaio. Quando se utilizam quantidades elevadas de quinase, incluir uma proteína transportadora tal como BSA para auxiliar na manutenção da estabilidade da proteína durante a duração do ensaio.

1. Preparar o tampão de reacção quinase 5x indicado abaixo:
   HEPES 50 mM pH 8,0
   MgCl2 50 mM
   50 mM de Benzamidina (inibidor de protease)
   DTT 50 mM (agente de redução)
   250 μM de ATP (não marcado, ou "frio")
2. Manter amostras de cinase em gelo em tubos de 1,5 mL. Preparar a seguinte mistura reaccional em tubos separados de 1,5 mL arrefecidos:
   21 μL de H2O
   6 μL de tampão de reacção quinase 5x
   1 μL de ATP marcado radioactivamente ("quente")
   2 μL de substrato (~ 5 mg / mL)
   NOTA: Para ensaios de cinase recombinante, o volume pode ser ajustado para acomodar a proteína purificada. Calcular tal que o volume final da reacção seja de 30 μL. Use esta receita para preparar um mestremisturar. Após a recepção do ATP marcado, diluir o stock em H2O para uma actividade específica de 0,01 mCi / mL antes da adição à mistura reaccional.
3. Para inicializar o ensaio, adicionar toda a mistura de reacção à amostra de quinase e incubar a reacção a 30 ° C durante 5 min a 1 h dependendo da actividade da quinase a ser ensaiada.
   NOTA: Quando se trabalha com uma quinase cuja actividade não foi previamente ensaiada, execute um curso de tempo de actividade de quinase com intervalos de 5 minutos entre os pontos de tempo.

3. Terminação da Reação e SDS-PAGE

1. Parar a reacção colocando em gelo e adicionando 7,5 μL de tampão de amostra Laemmli 5x ⁶ .
2. Aquecer a 100 ° C durante 30 s a 2 min em bloco de calor.
3. Toque em rotação e carregue 20 μL por poço em gel SDS-PAGE a 10-15%. Executar o gel o tempo suficiente para separar a cinase eo substrato (tipicamente 1 h a potência constante de 5 W) Certifique-se de manter o aparelho de gel blindado para limitar a exposição a ³²
4. Aqui, use aparelhos de gel caseiros, mas mini-géis padrão comercialmente disponíveis são perfeitamente adequados. Use as dimensões da seguinte forma:
   Géis: 8 cm de largura, 5,5 cm de comprimento (resolução), 1,5 mm de espessura.
   Combs: 15 poços, espessura de 1,5 mm, 2,9 mm de largura, 16 mm de profundidade

4. Gel de coloração e secagem

Cuidado: Para todas as etapas, certifique-se de reduzir a exposição pessoal a ³² P usando blindagem radioativa e usando equipamento de proteção pessoal. Para obter mais informações sobre etapas específicas, algumas referências úteis são incluídas.

1. Remover o gel das placas de vidro / alumina e colocar em 50 mL de mancha de Coomassie (10% de ácido acético glacial, 50% de metanol, 0,25% de corante R-250) durante 1 h num agitador orbital ajustado para 50 rpm. Para este passo use um recipiente que é ligeiramente maior do que o próprio gel. ⁸
2. Mova o gel da mancha para a solução fixadora (10% de ácido acético glacialD, 20% de metanol) a fim de desidratação. Rocha do gel em 600-700 mL de solução de fixação durante a noite em um agitador orbital a 50 rpm. Coloque pedaços de espuma ou toalhetes de laboratório atados no recipiente com o gel para absorver o corante Coomassie ^{8 , 9} .
3. Remover o gel da solução de fixação e mergulhar em 200 ml de metanol durante 1-2 minutos com agitação suave até que o gel se torne branco leitoso. Isto ajudará a evitar a fissuração durante o passo de secagem.
4. Molhar um pedaço de 14 cm x 14 cm de papel de filtro qualitativo com metanol e colocar em secador de vácuo de gel de laje. Coloque o gel para baixo na face frontal do papel de filtro voltada para cima.
5. Cubra o gel com filme plástico cuidadosamente para evitar rugas e bolhas de ar. Executar o secador durante 1,5 h a 80 ° C. Depois que o vácuo foi alcançado abra a tampa e role para fora todas as bolhas de ar se necessário com um brayer macio da borracha.

5. Autoradiograma e contagens de cintilação

1. RemovaEd gel e anexar um marcador autorad, régua fosforescente ou pontos para o papel de filtro no lado do gel. Se estiver usando pontos, certifique-se de que eles estejam em um padrão assimétrico. Isto irá alinhar o gel com o filme após exposição e desenvolvimento.
2. Use um contador Geiger para verificar a intensidade do sinal. Para sinais mais fracos, a exposição a -70 ° C a -80 ° C com um ecrã de intensificação aumentará a densidade da banda do filme.
3. Em uma sala escura, coloque o gel seco em uma cassete de filme com filme e uma tela intensificadora na seguinte ordem de cima para baixo: gel, filme, tela intensificadora.
4. Conecte a tela de intensificação à tampa da cassete e fita o gel no lugar para fazer este passo mais fácil. A tela de intensificação emite luz quando irradiada pelas partículas beta das ³² P. Estas emissões de luz penetram a película mais eficientemente do que as partículas beta.
   1. Certifique-se de que o comprimento de onda emitido peloLagoas para um comprimento de onda o filme é mais sensível a.
   2. Use um contador Geiger para determinar quanto tempo para deixar a exposição para: se contagem cpm é ~ 100 ou abaixo, tente durante a noite a -70 ° C. Se a contagem for ~ 10.000, comece com uma exposição de 1 h e otimize a partir daí.
5. No final da exposição remova a película e desenvolva-se em um processador de filme médico / de raios-X. Se a exposição foi realizada a -70 a -80 ° C, deixe a cassete aquecer até à temperatura ambiente para minimizar a condensação na película ou remover a película imediatamente antes da formação da condensação ¹⁰ .
6. Colocar o filme sobre o gel / papel de filtro seco e alinhar a imagem do marcador / pontos com os marcadores / pontos no gel seco. Marcar no filme as bandas correspondentes aos padrões de proteína. Rotular os padrões de proteína e quais pistas as reações são para referência futura.
7. Excise as faixas do gel que correspondem às bandas de interesse no filme e colocá-losEm 7 mL de frascos de cintilação. Adicionar 4 mL de fluido de cintilação e contar com contador de cintilação líquida. Confirme se o contador está configurado para monitorar a janela correta do espectro de energia para ³² P.
   NOTA: Certifique-se também de excluir a banda correspondente ao substrato da pista de controle de não quinase. Isto será utilizado para calcular a radiação de fundo que será subtraída de todas as contagens de cintilação da amostra.

6. Análise dos Resultados

NOTA: O autorradiograma fornece uma visualização qualitativa dos resultados. Para uma quantificação precisa, a incorporação de ³² P pode ser medida com um contador de cintilação. Os dados são usualmente expressos em termos de actividade relativa, como mostrado na Figura 1B . Enquanto as condições uniformes forem mantidas para todas as amostras, medições relativas de actividade específica são suficientes para comparar tratamentos.

1. Ao calcular valores absolutos de atividade específica, execute um rigorOtimização de todas as condições de reação, incluindo cinase, substrato e concentrações de ATP fria, a fim de assegurar um intervalo linear de atividade ao longo do tempo ( ex. 2 x [quinase] = 2 x atividade específica). Para quinases com elevada actividade específica, efectuar ensaios com aumento da concentração de substrato, caso a actividade de quinase seja limitada pela quantidade de substrato.
2. Calcular a actividade específica da quinase de interesse em unidades de nanomoles de fosfato transferidos por minuto por mg de cinase.
   1. Subtraia os espaços em branco das cpm nas faixas contadas.
   2. Calcula a decaimento do ATP quente: [(1/2) ^ (t / t _1/2 )] x 0,95 onde t é o número de dias desde a data de referência (deve ser fornecido pelo fornecedor), t _1/2 é o Meia-vida de ³² P, que é de 14,3 dias, e 0,95 reflecte a eficiência do contador de cintilação. Exemplo: se estiver usando ATP quente com 28 dias de idade, o valor de decaimento deve ser 0,245.
   3. Calc(Pmol) de ATP total no ensaio (usualmente isto é igual à quantidade de ATP frio na reacção): volume de ensaio (μL) x [ATP fria] (μM) = ATP total (pmols). Exemplo: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol
   4. Calcular cpm / pmol ATP: [μL de ATP quente x (2,2 x 10 ⁷ ) x factor de decaimento] / pmol de ATP frio.
      NOTA: O valor de 2,2 x 10 ⁷ converte 0,01 mCi / μL de ATP em cpm.
   5. Calcular a quantidade de cinase no ensaio em mg. Para quinases recombinantes e quinases imunoprecipitadas, os métodos padrão tais como os ensaios BCA são adequados para determinar as concentrações iniciais. Exemplo: wtERK2 0,0002 μg / μL numa reacção de cinase de 50 μL é 0,01 μg, ou 1 x 10 ^-5 mg.
   6. Calcular o cpm total no ensaio. Reúna 30 μL de reações e administre 20 μL de cada reação em um gel. Multiplicar as cpm contadas (após subtracção em branco) por um factor de volume total de ensaio / volume carregado. Continuando oExemplo, multiplique todas as contagens por 1,5 ou 30/20.
   7. Calcular a actividade específica da cinase ensaiada:
      Cpm total no ensaio) / (cpm / pmol ATP) / (tempo de ensaio em minutos) / (quantidade de quinase em mg)
      NOTA: A divisão do valor acima em 1000 produz a actividade específica em nanomoles / minuto / mg
3. Calcular quantos mols de fosfato são incorporados num substrato (desde que o seu peso molecular seja conhecido). Isto é usado para determinar o número de fosfositos numa proteína particular depois de a reacção ter terminado.
   Cpm total no ensaio) / (cpm / pmol ATP)] / (quantidade de substrato em pmoles)

Ensaios de quinase WNK1 IP

O WNK1 marcado com Myc foi transfectado em células HEK293 e imunoprecipitado com um anticorpo anti-Myc 11 . O imunoprecipitado exibiu actividade quinase em direcção ao substrato modelo MBP assim como para si próprio ( Figura 1A ). Os mutantes WNK1 foram então testados quanto à actividade de quinase em relação a MBP pelo mesmo método, desta vez empregando construções marcadas com GST ( Figura 1B ). A análise do comportamento da quinase mutante relativamente ao tipo selvagem revelou resíduos críticos para a actividade óptima de WNK1.

As células HEK293 foram expostas a um painel de tratamentos farmacológicos e bioquímicos. Utilizando um anticorpo criado contra um péptido WNK1 N-terminal, a actividade de quinase WNK1 endógena imunoprecipitada foi ensaiada utilizando MBP como substrato. O factor de crescimento epidérmico (EGF), umOu da sinalização ERK1 / 2, o nocodazol, um fármaco que tem como alvo a dinâmica dos microtúbulos, a anisomicina, um inibidor da tradução eucariótica eo ácido lisofosfatídico (LPA), um potente mitogénio, foram todos incapazes de provocar um aumento robusto na PAM fosforilada. Em contraste, o NaCl foi demonstrado ser um regulador da actividade da quinase WNK1.

Ensaios de proteína quinase de ERK2 recombinante

O ERK2 de rato portador de um marcador 6His N-terminal foi expresso em células bacterianas e purificado por afinidade com resina de níquel 12 . A proteína foi ainda purificada por cromatografia de permuta iónica numa coluna MonoQ, em que várias fracções de eluição foram testadas quanto à actividade de quinase ( Figura 2A ). Uma vez que ERK2 requer fosforilação dupla por MEK para atingir a actividade de quinase máxima, o ERK2 purificado de bactérias na ausência de MEK é largamente inactivo. Portanto, para testar frações de recomBinant ERK2 para actividade em relação a MBP, uma forma constitutivamente activa de MEK1 denominada MEK1R4F foi incluída nas reacções de quinase. Nomeadamente, o MEKR4F não possui actividade de quinase elevada na MBP ( Figura 2 ).

Utilizando um ensaio semelhante ao ilustrado na Figura 2A , utilizou-se uma actividade de quinase MBP para medir a actividade de mutantes de ERK2 recombinantes purificados a partir de culturas bacterianas relativamente à proteína de tipo selvagem ( Figura 2B ). Embora o ERK2 seja capaz de fosforilar MBP quando estimulado por MEKR4F, a mutação tanto da lisina catalítica (K52R) como de uma treonina proximal aos sítios canónicos de fosforilação dupla (T188D e T188E) drasticamente abroga a actividade da quinase ERK2. ERK2-T188D e ERK2-T188E exibem actividade de quinase marginal em direcção a um péptido pequeno e flexível ( Figura 2C ), no entanto, são incapazes de fosforilar fortemente os substratos ERK2 conhecidos Nup153 e PDX1 ( Figura 2 D).

Figura 1: Ensaios de quinase de imunoprecipitação de WNK1. ( A ) as c�ulas HEK293 foram transfectadas quer com pCMV5-Myc sem uma inser�o ou com pCMV5-Myc-WNK1, as prote�as marcadas foram imunoprecipitadas com o anticorpo anti-Myc seguido de ensaios de quinase utilizando MBP como substrato. A autorradiografia é mostrada à esquerda e uma imunotransferência dos imunoprecipitados à direita. ( B ) Foram utilizadas várias proteínas mutantes GST-WNK1 em ensaios de cinase com MBP como substrato; A fosforilação de MBP é expressa como actividade relativamente ao WNK1 de tipo selvagem. ( C ) WNK1 endógeno foi imunoprecipitado a partir de células HEK293 tratadas com vários estímulos e ensaiado quanto à autofosforilação. Esta figura foi modificada a partir de Xu et al. , 2000 11 .5504fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Ensaios de proteína quinase recombinante de ERK2. ( A ) Utilizaram-se fracções purificadas de ERK2 de uma coluna de permuta aniónica MonoQ num ensaio de quinase com MBP na presença ou ausência de MEK1R4F, um estimulador constitutivamente activo da actividade de quinase ERK2. ( B ) Os mutantes de ERK2 foram testados quanto à actividade de quinase em MBP. ( C ) Os mutantes de laçada de activação ERK2-T188D e ERK2-T188E exibem actividade de quinase marginal em direcção a um substrato de péptido tipificado pequeno. ( D ) Comparação das actividades de cinase ERK2 ou T188D após activação por MEK1R4F com substratos ERK2 conhecidos nucleoporina-153 (Nup153) e homeobox 1 pancreática e duodenal (PDX1). Os substratos fosforilados são denotados por cunhas e fosforilaERK2 e T188 por asteriscos. Reimpresso (e modificado) com permissão de McReynolds et al. , 2016 12 (Copyright 2016 American Chemical Society). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.