Summary
Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna olanak tanıyan bir FACS tabanlı protokolü açıklamaktadır.
Abstract
Perisitler perivasküler multipotent hücreler olup, farklı organlarda hatta aynı dokuda heterojenlik gösterirler. İskelet kaslarında, farklı moleküler belirteçleri ifade eden ve ayırdedici özelliklere sahip en az iki perisit alt popülasyonu (tip I ve tip II olarak adlandırılır) bulunur. NG2-DsRed ve Nestin-GFP çift transgenik fareler kullanılarak, tip I (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) ve tip II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) perisitler başarıyla izole edilmiştir. Bununla birlikte, bu çift transgenik farelerin mevcudiyeti bu saflaştırma yönteminin yaygın kullanılmasını engeller. Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna izin veren alternatif bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, floresanla aktive hücre ayırma (FACS) tekniğini kullanır ve Nestin-GFP sinyaliyle birlikte NG2 yerine PDGFRβ'yı hedef alır. İzolasyondan sonra, I ve ty yazınPe II pericyitler farklı morfolojilere sahiptir. Buna ek olarak, çift transgenik farelerden izole edilenler gibi bu yeni yöntemle izole edilen tip I ve tip II perisitler sırasıyla adipojenik ve miyojeniktir. Bu sonuçlar, bu protokolün perisit alt popülasyonlarını iskelet kaslarından ve muhtemelen diğer dokulardan izole etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Introduction
Kas distrofisi şimdiye kadar etkili bir tedavisi olmayan bir kas dejeneratif bozukluğudur. Doku yenilenmesini teşvik eden terapilerin gelişimi daima büyük ilgi gördü. Hasar sonrası doku rejenerasyonu ve onarımı yerleşik kök hücrelere / progenitör hücrelere bağlıdır 1 . Uydu hücreleri, kas yenilenmesine 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 katkıda bulunan miyojenik prekürsör hücrelere adanmıştır. Bununla birlikte, bunların klinik kullanımı, sınırlı göç ve enjeksiyondan sonra düşük hayatta kalma oranlarının yanı sıra , in vitro amplifikasyon sonrasında azalmış farklılaşma yetenekleri nedeniyle engellenmektedir 8 , 9 , 10 , 11 . Satelli'ye ek olarakIskelet kasları, trombosit türevi büyüme faktörü reseptör-beta (PDGFRp) -pozitif interstisyel hücreler gibi miyojenik potansiyeli 12 , 13 , 14 , 15 , 16 olan birçok hücre popülasyonunu da içerir. Kas türevi PDGFRβ + hücrelerinin, miyojenik hücrelere farklılaşabildiklerini ve kas patolojisini geliştirdiklerini ve 14 , 17 , 18 , 19 , 20 nolu fonksiyonları yerine getirebildiklerini gösteren kanıtlar vardır. PDGFRβ çoğunlukla pluripotik 22 , 23 olan perivasküler hücreler olan perisitleri 21 işaret eder. PDGFRβ'ya ilaveten, Neuron-Glial 2 (NG2) ve CD146 da dahil olmak üzere birçok diğer belirteçler, iPerisitleri dentify 21 . Bununla birlikte, bu belirteçlerin hiçbirinin çevreye özgü olmadığına dikkat edilmelidir. Son çalışmalar, tip I ve tip II olarak adlandırılan, farklı moleküler belirteçleri ifade eden ve farklı fonksiyonlar 19 , 24 , 25 gösteren kas perisitlerinin iki alt türünü ortaya çıkarmıştır. Biyokimyasal olarak, tip I perisitler NG2 + Nestin - iken, tip II perisitler NG2 + Nestin + 19 , 24'tür. Fonksiyonel olarak, tip I perisitler adipogenik farklılaşmaya maruz kalabilirler, yağ birikimi ve / veya fibrozise katkıda bulunurlar, oysa tip II perisitler miyojenik yol boyunca ayırt ederek kas yenilenmesine katkıda bulunurlar 19 , 24 , 25 . Bu sonuçlar şunu göstermektedir: (1) tip I perisitler bYağlı dejeneratif bozuklukların / fibrozun tedavisinde hedeflenen ve (2) tip II perisitlerin, kas distrofisi için büyük terapötik potansiyele sahip olduklarını göstermiştir. Bu popülasyonların daha fazla araştırılması ve karakterizasyonu, tip I ve tip II perisitlerin yüksek saflıkta ayrılmasını sağlayan bir izolasyon protokolü gerektirir.
Şu anda, perisit alt popülasyonlarının izolasyonu NG2-DsRed ve Nestin-GFP çift transjenik fareler 19 , 24'e dayanmaktadır. NG2-DsRed farelerin mevcudiyeti ve çoğu NG2 antikorunun kalitesi, bu yöntemin yaygın kullanımını sınırlar. Tüm NG2 + perisitlerinin ayrıca 19 , 20 , 24 iskelet kaslarındaki PDGFRβ'yı eksprese ettiği göz önüne alındığında, percyit'lerin izolasyonu ve alt popülasyonları için NG2'nin PDGFRβ ile değiştirilebileceği hipotezi altındayız. Bu çalışma, FACS tabanlı bir protokolü tanımlamaktadır.PDGFRβ boyama ve Nestin-GFP sinyalini kullanır. Bu yöntem araştırmacılar için daha az talepkar, çünkü: (1) NG2-DsRed fonunu gerektirmez ve (2) iyi karakterize edilmiş ticari olarak temin edilebilir PDGFRβ antikorlarını kullanır. İlaveten, tip I ve tip II perisitlerin yüksek saflıkta eşzamanlı olarak izole edilmesini sağlar ve bu perisit alt popülasyonlarının biyolojik ve terapötik potansiyelleri hakkında daha fazla araştırma yapılmasına izin verir. Saflaştırmanın ardından, bu hücreler kültürde yetiştirilebilir ve morfolojileri görselleştirilebilir. Bu çalışma aynı zamanda, çift transgenik farelerden saflaştırılanlar gibi bu yöntemi kullanarak izole edilen tip I ve tip II perisitlerin sırasıyla adipojenik ve miyojenik olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wildtype ve Nestin-GFP transgenik fareler, Minnesota Üniversitesi'ndeki hayvan tesislerinde barındırıldı. Tüm deneysel prosedürler, Minnesota Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak hazırlandı.
1. Kas Diseksiyonu ve Tek Hücreli İzolasyon
- Tribromoetanol (250 mg / kg, ip) ile erişkin fareler (6-10 hafta, hem erkek hem de kadın) euthanize edin ve karın cildini% 70 etanol ile sterilize edin.
NOT: Anestezi / ötenazi için ketaminin yerine ketamin yerine tribromoetanol kullanıldı, çünkü ketamin NMDA reseptörleri ile etkileşime girdi ve bu da potansiyel olarak çalışma üzerinde etkili olabilir. - Fareleri sırt üstü pozisyona getirin ve karın cildi üzerinde yatay bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Arka ayak bacak kaslarını ortaya çıkarmak için cildi elle ters yönde çekerek soyun.
- CollecForseps ve makas kullanarak her iki arka bacaktaki kaslar. Buz üzerinde% 1 penisilin-streptomisin (P / S) takviyeli steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde saklayın.
- Buzla soğutulmuş PBS'de iki kez% 1'lik P / S ile takviye edilmiş arka bacak kaslarını yıkayın ve steril 10 cm'lik bir tablaya aktarın.
- Sinirleri, kan damarlarını ve 2X büyütmede bir diseksiyon mikroskopu altında makas kullanarak bağ dokusunu dikkatle inceleyin.
- Steril makas ve bıçaklar kullanarak kasları ince parçalara kesin (1-2 mm3). Gerekirse, kasların kurumamış olmasını sağlamak için az miktarda Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ekleyin.
- Mekanik olarak, 10 mL'lik bir serolojik pipetle 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak dokuyu parçalayın.
- Karışıma yeni yapılmış sindirim çözeltisi (% 0.2 Tip 2 kollajenaz ile takviye edilmiş DMEM) ilave edin. 37 ° C'de 2 saat gentl ile inkübe edinDakikada 35 devirde çalkalama.
- Karışımı homojenize etmek için 18 G'lik bir iğne kullanarak toz haline getirin. Daha sonra 500 xg'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve sonra pelleti% 0.25 tripsin / EDTA içinde tekrar süspanse edin. 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin. Santrifüj adımını iki kez daha tekrarlayın.
- Solüsyona% 20 sığır fetüsü serumu (FBS) takviye edilmiş 10 mL DMEM ekleyin ve 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve pelleti kırmızı kan hücresi liziz tamponunda (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 ve 0.1 mM EDTA) tekrar süspansiyon haline getirin.
- 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve pelet ayırma tamponunda (20 mM HEPES, pH 7.0; 1 mM EDTA; Ca / Mg 2+ ücretsiz PBS, pH 7.0'da% 1 BSA) tekrar süspansiyon haline getirin. Karışımı, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 40 mikron hücre süzgeçten geçirin.
- 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve pelet 1 mL sıralama tamponunda yeniden süspanse edin.
- SaymakHücre sayısının bir hemasitometre ile alınması ve tekli hücre süspansiyonunun sıralama tamponunda 5 x 106 / mL'ye kadar seyreltilmesi.
2. Hücre boyama ve sıralama
- Kontrolleri ve numuneyi Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Tek hücreli süspansiyonu, ilgili antikorlarla, buz üzerinde, Tablo 1'de açıklandığı üzere 30 dakika boyunca boyayın.
- 5 dakika süreyle 500 xg'de santrifüjleyin ve topakları ayırma tamponuyla iki kez yıkayın.
- Tablo 1'de belirtildiği gibi DAPI tek hücreli solüsyonlara ekleyin. PDGFRβ-PE-FMO kontrolü ve numune için DAPI tek renkli kontrol için 5 μg / mL DAPI (nihai konsantrasyon) ve 1 μg / mL DAPI kullanın. Deney boyunca tüm tüpleri buzda tutun.
- Sıralayıcıyı ve yazılımı açın. İstendiğinde 100 μm'lik bir ayırma yongasını tarayın ve takın.
- Otomatik kurulumu gerçekleştirin ( örneğin, talaş hizalaması, damlacık kalibrasyonu, yan akım kalibrasyonu ve sıralama gecikmesi kalibrasyonuOn) otomatik kurulum boncukları yükleyerek sorulduğunda.
- Otomatik kurulum tamamlandığında, "Deneme" sekmesine gidin, "Yeni" yi tıklayın ve "Genel Şablonlar" dan "Boş Şablon" u seçin.
- "Ölçüm Ayarları" altında, "FL1" için "DAPI", "FL2" için "Nestin-GFP" ve "FL3" için "PDGFRβ" girin. "FL4" - "FL6" kutularının işaretini kaldırın.
- 405, 488 ve 561 lazerleri etkinleştirmek için kutuları işaretleyin ve "Yeni Deneme Oluştur" u tıklayın.
- "Kompanzasyon Sihirbazını Başlat" seçeneğini seçin ve kompanzasyonu ayarlamak için "Kompanzasyon Sihirbazı" yazılım talimatlarını takip edin.
- Renksiz kontrolü yükleyin ve "Başlat" ı tıklayın. "Dedektör ve Eşik Ayarları" nı tıklayın ve nüfusu ölçeğe yerleştirmek için FSC ve BSC dedektörlerinin sensör kazancını ayarlayın.
- ilanSadece negatif popülasyonları histogramların sol tarafına yerleştirmek için FL1-FL3 floresans kanallarının kazanç seviyeleri. Verileri kaydetmek için "Kaydet" düğmesini tıklayın.
- İstendiğinde tek renkli kontrolleri teker teker yükleyin. Verileri kaydetmek için "Başla ve Kaydet" düğmesine tıklayın. Histogramlarda pozitif popülasyonlar için kapıları ayarlayın. "İleri" yi tıklayın.
- "Telafi" sekmesindeki "Matris Hesapla" bölümüne gidin ve telafiyi gerçekleştirmek için "Telafi Ayarlarını Hesaplayın" panelinde "Hesapla" yı tıklayın. "Telafi Sihirbazı" ndan çıkmak için "Bitir" i tıklayın.
- PDGFRβ-PE-FMO kontrolünü yükleyin ve "Başlat" ı tıklayın. "Tüm Olaylar" arsa altındaki ilgi hücreleri etrafında bir poligon kapı (A Kapısı) çizin.
- Alt çizgi oluşturmak için A Kapısının içinde çift tıklayın. Y eksenini DAPI olarak değiştirin ve canlı (DAPI düşük ) hücrelere çokgen kapıyı (Kapı B) çizin. I'yi çift tıklayınB kapı kenarında bir çocuk komplosu oluşturmak. X ekseni FSC-H'ye ve Y ekseni FSC-W'ye değiştirin ve çiftleri yok etmek için, tekli noktaların etrafına bir çokgen kapı (Kapı C) çizin.
- Alt çizgi oluşturmak için C Kapısının içinde çift tıklayın. X eksenini Nestin-GFP'ye ve Y ekseni PDGFRβ-PE'ye değiştirin. Verileri kaydetmek için "Kaydet" düğmesini tıklayın.
- Numuneyi yükleyin ve adım 2.11-2.12'yi tekrarlayın. Kaydettikten sonra, numuneyi korumak için "Duraklat" düğmesine tıklayın.
- PDGFRβ-PE-FMO kontrolü temelinde PDGFRβ + ve Nestin-GFP + hücreleri için geçiş sınırlarını tanımlayın. PDGFRβ + Nestin-GFP - ve PDGFRβ + Nestin-GFP + popülasyonları için kapıları çizin.
- "Sıralama Yöntemi" altında, "2 Yönlü Tüpler" i seçin ve "PDGFRβ + Nestin-GFP - " ve "PDGFRβ + Nestin-GFP + " hücrelerini sol ve sağ toplama tüplerine atayın.dönük olarak. Toplama aşamasında ayırma tamponuyla doldurulmuş 15 mL toplama tüplerini monte edin ve "Toplama Toplama" düğmesine tıklayın ".
- Örneği çalışmaya devam etmek için "Devam Et" düğmesini tıklayın. PDGFRβ + Nestin-GFP - (tip I perişitler) ve PDGFRβ + Nestin-GFP + (tip II perişitler) hücreleri toplamak için "Sırala Başlat" ı tıklayın.
3. Post-sıralama Analizleri
- 5 dakika boyunca 500 xg'de sıralanmış hücreleri santrifüjleyin, pelleti perisit ortamın 1 mL'sinde tekrar süspansiyon haline getirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve bir hemositometre kullanarak hücre yoğunluğunu sayın.
- ~ 1 x 104 hücre / cm2'de poli-D-lisin (PDL) ile kaplanmış lamelleri üzerinde Tohum tipi I ve tip II perisitler. Perisit ortamda 37 ° C'de% 5 CO2 ile 3 gün süreyle büyür.
- 3. günde, bir peroksit mikroskobu kullanılarak perisit morfolojisini (faz kontrastı altında) ve endojen Nestin-GFP ekspresyonunu inceleyin(Uyarma lazeri: 488 nm, uyarma filtresi: 470/40 nm ve emisyon filtresi: 515/30 nm). Görüntüleri 20X (0.45 NA) bir hedefin altında çekin.
- Daha önce tarif edildiği gibi sırasıyla adipojenik ve miyojenik farklılaşmayı başlatmak için perisit ortamını adipojenik (fare MSC bazal ortam + adipojenik stimülatör takviyesi) ve miyojenik (DMEM +% 2 at serumu) besiyeri ile değiştirin 20 . Ortamı her 2-3 günde değiştirin.
- Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehid (PFA) içinde 17. günde (adipojenik / miyojenik farklılaşmadan 14 gün sonra) hücreleri düzeltin.
NOT: Dikkat, PFA bir kanserojendir. - Daha önceki yayınlarda 19 , 20'de açıklandığı gibi, perilipin (adiposit markörü) ve S-myozine (olgun miyotür / miyofiber markeri) karşı immünositokimya uygulayın.
- Sabit hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika PBS içinde 3 kez yıkayın.
- Engelleme tamponu ekleyin (PBS% 5 eşek serumu,% 3 BSA ve% 0.3 Triton X-100 ile takviye edilmiştir) ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Hücreleri anti-perilipin (2 μg / mL) ve / veya anti-S-myosin (2 μg / mL) antikorları ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika PBS'de 3 kez yıkayın.
- Hücreleri 1 saat oda sıcaklığında Alexa 555 eşek anti-tavşan (4 ug / mL) ve / veya Alexa555 eşek anti-fare (4 ug / mL) antikorları ile inkübe edin.
- Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika PBS'de 3 kez yıkayın.
- İmmünostained hücreleri DAPI içeren montaj ortamı ile monte edin (materyal tablosuna bakın). Bir floresan mikroskop (uyarma lazeri: 543 nm; 540/45 nm uyarım ve 600/50 nm emisyon) kullanarak perilipin ve S-miyozin ekspresyonunu inceleyin ve 40X'lik bir hedef (0.60 NA) altında görüntü alın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lazer yoğunluğu ve kanal dengelemesi de dahil olmak üzere FACS parametreleri, lekesiz kontrol ve tek renkli kontrollerin sonuçlarına dayanarak düzeltilir. PDGFRβ-PE-FMO kontrolü, PDGFRβ-PE + popülasyonu için kapıyı ayarlamak için kullanılır ( Şekil 1A ). PDGFRβ-PE - hücreleri arasında, Nestin-GFP + ve Nestin-GFP'yi temsil eden iki popülasyon açıkça ayrılır ( Şekil 1A ). PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP popülasyonları için geçiş sınırları, PDGFRβ-PE + ve Nestin-GFP + için kapıyı temel alır ( Şekil 1A ). Bu sınırlar, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (tip II perisitler) ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - (tip I perisit) tanımlamak ve sıralamak için kullanılırEs) hücrelerini ( Şekil 1B ) göstermektedir . İzole PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + hücreleri tek hücreli çözeltideki toplam hücrelerin sırasıyla sırasıyla% 9.5 ve% 2.1'ini oluşturmaktadır.
FACS ile izole edilmiş tip I ve tip II perisitler, kültürde üç gün sonra morfolojik farklılıkları göstermektedir. Tip I perişitler, yuvarlak hücre cisimcikleri ve kısa süreçlerle amoeboid morfolojiyi gösterir ( Şekil 2 ). Bununla birlikte, Tip II perisitler, küçük hücreli bedenler ve uzun, ince işlemlerle karakterize edilen dallanmış morfolojiyi göstermektedir ( Şekil 2 ). Tip II perisitlerin çoğu Nestin-GFP + olarak kalırken, tip I perisitler Nestin-GFP'dir - ( Şekil 2 ).
Buna ek olarak, tip I, ancak tip II değil, pericy.Tes, adipogenik ortamda 14 gün sonra perilipin ifade eden adipositleri ayırt eder ( Şekil 3 ). Tip I değil, tip II, perisitler, myogenik ortamda 14 gün sonra S-myosin ifade eden miyotlara farklılaşmaktadır ( Şekil 4 ). Bu sonuçlar tip I perisitlerin adipogenik olduğunu, tip II perisitlerin miyojenik olduğunu kuvvetle göstermektedir.
Şekil 1 : Gating sınırları ve temsili sıralama. ( A ) PDGFRβ-PE-Nutin-GFP - ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + geçit sınırlarını gösteren, PDGFRβ-PE-FMO kontrolünün floresan arsa. ( B ) PDGFRβ-PE + Nestin-GFP dağılımını gösteren numunenin temsili floresan düzeni
Şekil 2: Sınıf I ve tip II perisitlerdeki morfoloji ve Nestin-GFP ekspresyonu. Sınıflandırılmış tip I ve tip II perisitler lamelleri üzerine ekildi ve 3 gün süreyle perisit ortamda yetiştirildi. Tip I perisitler, kısa proseslere sahip yuvarlak hücreli cisimler ve flüoresan mikroskop altında (eksitasyon Lazeri: 488 nm, uyarma ve emisyon filtreleri: sırasıyla 470/40 nm ve 515/30 nm) endojen GFP sinyali vermedi. Tip II perisitler, uzun ve ince işlemlerle birlikte küçük hücre gövdeleri gösterdi ve a'nın altında güçlü bir endojen GFP sinyali gösterdi.Floresan mikroskopu aynı ayarlar altında. Tartı çubuğu = 100 μm Bu rakamın daha büyük versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Sınıf I ve tip II perisitlerin adipojenik farklılaşması. Sınıflandırılmış tip I ve tip II perisitler, perisit ortamda 3 gün süreyle yetiştirildi. Daha sonra 14 gün boyunca adipojenik ortamda farklılaştılar. Hücreler sabitlendi ve anti-perilipin antikoru ile immüno-lekelendi, ardından Alexa555 eşek anti-tavşan antikoru uygulandı. İmmünositokimya, floresan mikroskobunda (uyarıcı lazer: 543 nm, uyarılma ve emisyon filtreleri: 540/45 nm ve 600/50 nm, saygı) adiposit işaretleyici perilipin (kırmızı) ifade eden tip I fakat tip II olmayan perisitleri gösterdi yanıtını verdiler). Ölçek çubuğu = 50 μm Bu şekli daha büyük görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Sınıf I ve tip II perisitlerin miyojenik olarak farklılaşması. Sınıflandırılmış tip I ve tip II perisitler 3 gün boyunca perisit ortamda yetiştirildi ve daha sonra 14 gün süreyle miyojenik ortam içinde farklılaştırıldı. Hücreler sabitlendi ve anti-S-miyozin antikoru ve Alexa555 eşek anti-fare antikoru ile immüno-lekelendi. İmmünositokimya, floresan mikroskop altında (eksitasyon lazeri: 543 nm, uyarılma ve emisyon filtreleri: 540/45 nm ve 600/50 nm), olgun miyotür / miyofiber markeri S-miyozini (kırmızı) ifade eden, tip II değil, tip II perisitlerin gösterdi , sırasıyla). Ölçek çubuğu = 50 μm//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Tüpler | boyanma |
| Renksiz kontrol | Vahşi tipli farelerden tek hücre süspansiyonu |
| DAPI tek renkli kontrol (ölü hücrenin dışlanması) | Vahşi tipli farelerden + DAPI (5 ug / mL) tek hücre süspansiyonu, |
| GFP tek renkli kontrol | Nestin-GFP farelerinden tek hücre süspansiyonu |
| PE tek renkli kontrol | OneComp eBeads + PDGFRβ-PE antikoru (4 ug / mL) |
| PE-FMO kontrolü | Nestin-GFP farelerinden tek hücre süspansiyonu + DAPI (1 ug / mL) |
| Numune | Nestin-GFP farelerinden + PDGFRβ-PE antikorundan (4 ug / mL) tek hücre süspansiyonu +DAPI (1 ug / mL) |
Tablo 1: Tek renk kontrolleri, PDGFRβ-PE-FMO kontrolü ve kas örneği için boyama protokolü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Perisitler kılcal damarların 21 , 26 abluminal yüzeyinde bulunan çok-enerjili perivasküler hücreler 22 , 23'tür . İskelet kaslarında, perisitler adipogenik ve / veya miyojenik yolaklarda 19 , 20 , 24 arasında ayrım yapabilir. Son çalışmalar, farklı markör ekspresyonu ve belirgin farklılaşma potansiyelleri olan perisitlerin iki alt popülasyonunu ortaya çıkardı 19,24,25. Tip I (NG2 + Nestin - ) perisitler adipogenikken, tip II (NG2 + Nestin + ) perisitler miyojeniktir. Bu alt popülasyonların in vitro çalışmalar için izolasyonu, NG2-DsRed ve Nestin-GFP çift transjenik fare hattını gerektirir. Bu saflaştırmanın bağımlılığıProtokolü, çift geçişli fareler üzerindeki uygulamasını önemli ölçüde sınırlar ve dolayısıyla pericyte alt popülasyonlarının biyolojisi üzerinde araştırma yapar.
Bu video makalesi, fare iskelet kaslarından tip I ve tip II perisit izolasyonu için alternatif bir yöntem göstermektedir. Bu yeni yöntem hala hücre ayırma için FACS tabanlı bir tekniğe dayanmaktadır. Bununla birlikte, transgenik NG2-DsRed flüoresan kullanmak yerine, endojen PDGFRβ sinyalini hedef alır. Bu, NG2-DsRed ekspresyonunun iskelet kasında 19 PDGFRβ ile birlikte lokalize olduğu gözlemine dayanmaktadır. Özgün yöntemle karşılaştırıldığında, bu protokolün birçok avantajı vardır. Birincisi, NG2-DsRed genetik altyapısını gerektirmez, ancak Nestin-GFP geçmişi hala gereklidir. İkincisi, NG2'yi hedeflemek yerine, bu protokol, doğrulanmış ve piyasada bulunan antikorlar ile iyi tanımlanmış bir markör olan PDGFRβ'ı kullanmaktadır. Üçüncüsü, bo'nun aynı anda izolasyonuna izin verirT tip I ve tip II perisitlerdir. Örneğin, bu protokol kullanılarak izole edilen PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + hücreleri, farklı diferansiasyon özellikleri sergilemektedir. Spesifik olarak, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , ancak PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + hücreleri, yağ hücrelerinde adipostatik koşullarda ayrım yaparken, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , ancak PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , Hücreler miyojenik koşullar altında miyogenik farklılaşmaya maruz kalırlar. Bu veriler, NG2-DsRed + Nestin-GFP - hücrelerinin (tip I perisitler) adipogenik olduğunu ve NG2-DsRed + Nestin-GFP + hücrelerinin (tip II perisitler) miyojenik olduğunu gösteren önceki raporlarla tutarlıdır 19 , 24 , izole PDGFRβ -PE + Nestin-GFP - ve PDGFRβ-PE + NEstin-GFP + hücreleri, sırasıyla, tip I ve tip II perisitlerdir. Birlikte, bu sonuçlar, bu yeni protokolün, perisit alt popülasyonlarının fare iskelet kaslarından ve muhtemelen diğer dokulardan nispeten kolay izolasyonu / saflaştırılmasına izin verdiğini önermektedir. Bu, çevresel biyoloji ve çeşitli hastalıklar için terapötik çevirileri üzerine çalışmaları destekleyecektir.
Bununla birlikte, bu yöntemin PDGFRβ kullanımı nedeniyle bir sınırlaması olduğunu belirtmek gerekir. Önceki bir çalışmada, PW1 + interstisyel hücrelerin (PIC'ler) PDGFRβ 20'yi de eksprese ettiği gösterilmiştir. Dolayısıyla, izole PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + popülasyonları, PIC'leri içerebilir. Bununla birlikte, perisitlerin iskelet kasında PIC'lerden daha fazla olduğu ve perisitlerin benimkinden geçmediği göz önüne alındığında, bu periferik perifitlerin perisit farklılaşmasına katkısı sınırlıdırOgenesis 19 , 25 .
Bu yöntem kullanılarak tip I ve tip II perisitler sırasıyla% 9.5 ve% 2.1 verimle elde edildi. Bu sayılar, çift transjenik farelerde 19 bildirilen verimlerle sırasıyla% 2.8 ve% 3.4 karşılaştırılabilirdi. Hafif farklılık, farklı geçiş stratejileri veya sindirim protokollerine bağlı olabilir. Bu sonuçlar yine önerilen protokolün perisit alt tiplerini iskelet kaslarından izole etmek için kullanılabileceğini göstermektedir.
Bu protokolün kritik adımları aşağıdaki noktaları içerir: (1) iskelet kaslarının tamamen kıyılmış olduğundan ve 10 mL serolojik pipetten kolayca geçebildiğinden emin olun. Büyük kas blokları enzimatik sindirime müdahale eder ve verimi önemli ölçüde düşürür. (2) Kas sindirimi için yeni yapılmış kolajenaz çözeltisini kullanın ve inkübasyon sırasında hafifçe çalkalamaya (35 devir / dakika) izin verin. (3)Boyama ve ayırma adımları boyunca buz üzerinde kontrol ve numune alma. (4) Kapı sınırlarını ayarlamak için FMO kontrollerini kullanın.
Farklılaşma yeteneğine ek olarak, tip I ve tip II perisitler de farklı morfolojiyi göstermektedir. Özellikle, tip I perişitlerin kısa süreçleri ve nispeten büyük çekirdekli yuvarlak hücre gövdeleri vardır. Öte yandan tip II perisitler, genellikle uzun ve ince süreçler ve küçük çekirdeklerle küçük hücreli cisimcikler içerir. Morfolojik farklılıklar, tip I ve tip II perisitlerin doğal olarak perisitlerin heterojen yapısı ile uyumlu olduğunu göstermektedir 21 . Tip I ve tip II perisitlerin yanı sıra altta yatan moleküler mekanizmalar arasındaki farkı neden / sürdüren şey, belirsizliğini koruyor ve daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyuyor. Bu izolasyon protokolü, bu önemli soruları cevaplamaya yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarların ifşa ettikleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, kısmen Myotonic Distrofi Vakfı (MDF-FF-2014-0013) ve Amerikan Kalp Derneği'nden (16SDG29320001) Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi'nden bir Fon A Üyesi Ödülüyle desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Needles | BD | 305196 | |
| 10 mL Serological Pipette | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
