Summary
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) unter Verwendung einer reifen Maus-T-Zelllinie. Dieses Protokoll ist geeignet, um die Verteilung von spezifischen Histonmarken an bestimmten Promotorstellen oder genomweiten zu untersuchen.
Abstract
Signalisierungswege regulieren Genexpressionsprogramme über die Modulation der Chromatinstruktur auf verschiedenen Ebenen, wie durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonschwänzen, den Austausch von kanonischen Histonen mit Histonvarianten und Nukleosomenvorsätze. Eine solche Regulation erfordert die Bindung von signalempfindlichen Transkriptionsfaktoren (TFs), die chromatinmodifizierende Enzyme an regulatorischen Elementen, die als Enhancer definiert sind, rekrutieren. Das Verständnis, wie Signalkaskaden die Enhancer-Aktivität regulieren, erfordert eine umfassende Analyse der Bindung von TFs, chromatinmodifizierenden Enzymen und der Belegung von spezifischen Histonmarken und Histonvarianten. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) -Assays verwenden hochspezifische Antikörper gegen Immunpräzipitation spezifischer Protein / DNA-Komplexe. Die anschließende Analyse der gereinigten DNA ermöglicht die Identifizierung der Region, die von dem vom Antikörper erkannten Protein besetzt ist. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für effizientes peRip ChIP von Histonproteinen in einer reifen Maus-T-Zelllinie. Das dargestellte Protokoll erlaubt die Durchführung von ChIP-Assays in einem angemessenen Zeitrahmen und mit hoher Reproduzierbarkeit.
Introduction
Entwicklung, Differenzierung und Homöostase hängen von spezifischen Genexpressionsprogrammen ab, die durch Signalisierungsereignisse bestimmt werden, die die Chromatinstruktur modulieren und somit bestimmen, ob ein spezifisches Gen zell- und zeitabhängig aktiviert oder unterdrückt wird. Während der T-Zell-Entwicklung müssen spezifische Genexpressionsprogramme etabliert werden, um die Reifung von T-Zell-Vorläufern vom doppelnegativen (DN) zum ein-positiven (SP) -Zustand zu bestimmen, indem sie mehrere Zwischenstufen 1 durchlaufen. Wie das Genexpressionsprogramm während der T-Zell-Entwicklung dynamisch reguliert wird, wurde in den vergangenen Jahren von mehreren Laboratorien 2 , 3 , 4 , 5 , 6 weitgehend untersucht.
Durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen, der Austausch vonKanonische Histone mit Histonvarianten, Nukleosomen-Räumung und DNA-Methylierung regulieren den ON / OFF-Schalter von Genen. Mehrere Gruppen haben die genomweite Verteilung von PTMs und Histonvarianten untersucht, um Markierungen zu bestimmen, die mit verschiedenen Chromatinzuständen an den proximalen und distalen regulatorischen Regionen 7 , 8 , 9 , 10 assoziiert sind. Signalisierungskaskaden orchestrieren die dynamische Chromatinregelung über den Austausch von positiven und negativen chromatinmodifizierenden Enzymen (auch als Chromatinmodifikatoren bekannt) an spezifischen Enhancer-Elementen. Diese Chromatin-Modifizierungsmittel regulieren die Chromatinstruktur und damit die Transkriptionsausgabe beispielsweise durch dynamische Histon-Methylierung und Acetylierung. Dies ist der Fall in dem Notch-Signalweg 11 , 12 , 13 ,14
Dynamische Histon-PTMs; Austausch mit Histonvarianten; Und die dynamische Belegung von Histonen, Transkriptionsfaktoren und Cofaktoren können durch Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) -Assays untersucht werden. Hochspezifische Antikörper werden verwendet, um spezifische DNA-Protein-Komplexe zu reinigen, und die gereinigte DNA wird durch quantitative PCR (qPCR) analysiert; Tiefsequenzierung (ChIP-Seq); Oder, seltener heutzutage, Hybridisierung mit Mikroarray (ChIP-ChIP).
ChIP-Assays sind manchmal anspruchsvoll aufgrund von Komplikationen mit der Lyse der Zellen, Scherung des Chromatins und / oder geringer Spezifität der Antikörper. Es wurden mehrere Strategien zur Verbesserung des Protokolls verabschiedet, wie es bei NEXSON 15 der Fall ist. Die Verwendung von Kühlwasser-Bad-Sonicatoren vermeidet Probenerwärmung, die die auf dem zu untersuchenden Protein vorhandenen Epitope beschädigen könnte, aber die Energie, die für das Scheren der Proben erforderlich ist, wird in das Wasser dispergiert.Eine weitere Verbesserung wurde mit der Entwicklung von fokussierten Ultraschallgeräten gemacht, die die Verteilung der Energie verhindern. Daher ermöglichen fokussierte Ultraschallgeräte Verbesserungen bei der Zelllyse und Chromatinscherung, eliminieren durch Operator-induzierte Variationen und erhöhen die Reproduzierbarkeit erheblich.
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll (schematische Übersicht in Abbildung 1 ), um das ChIP von Histonproteinen in einer reifen Maus-T-Zelllinie mit der Bezeichnung E2-10HA 16 , 17 effizient durchzuführen. T-Zellen sind in der Regel schwer zu lysieren, und die Scherung ihrer Chromatin wurde offenbart, um ineffizient zu sein. In diesem Protokoll, das einen kühlenfokussierten Ultraschallgerät nutzt, wurden die Anzahl der Zellen, der Lysepuffer und die Schereinstellung für die E2-10HA-Maus-T-Zelllinie optimiert. Dieses Protokoll erlaubt es, ChIP mit hoher Reproduzierbarkeit und in einer angemessenen Zeit durchzuführen. In der Tat, es requirEs etwa zwei Tage, um das Chromatin zu scheren und die Qualität der Scherung zu bewerten, und drei Tage, um die Immunpräzipitation durchzuführen, die Vernetzung umzukehren und die DNA zu reinigen.
Protocol
HINWEIS: Alle Puffer und das in diesem Protokoll verwendete Medium sind in Tabelle 1 aufgelistet .
Tage 1 und 2
1. Vernetzung der Zellen
- Übertragen Sie die Maus-T-Zellen aus einer 6-Well-Platte in ein 50 ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 4 ° C und ~ 271 x g. Das Zellpellet wird in 30 ml IMDM-Zellkulturmedium resuspendiert und die Zellen mit einer Neubauer-Kammer gezählt.
- Sammle Aliquots von 20 x 10 6 Zellen in neue 50 ml Röhrchen.
- Füge Formaldehyd (FMA) zu einer 1% Endkonzentration direkt zum Zellkulturmedium hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 10 min.
Achtung: FMA ist giftig, wenn eingeatmet, so unter einer Dunstabzugshaube arbeiten und geeignete Schutzausrüstung tragen. Auch bitte behandeln FMA Abfälle nach den Regeln der Gasthochschule. - Füge 1/8-Volumen 1 M Glycin, pH 7,0 hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min.
- Pellet die Zellen durch Zentrifugation für 5Min bei 4 ° C und ~ 271 xg und waschen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Das Zellpellet mit 1 ml PBS waschen und auf 1,5 ml Röhrchen überführen.
2. Zell-Lyse und Chromatin-Scherung
- Das Zellpellet wird in 1 ml SDS-Lysepuffer resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert.
- Übertragen Sie jede Probe auf ein Ultraschallrohr und führen Sie die Scherung mit einem fokussierten Ultraschallgerät gemäß den in Tabelle 2 angegebenen Einstellungen durch .
- Nach dem Scheren die Proben auf 1,5 ml Röhrchen übergeben und 10 min bei 4 ° C und ~ 18.000 x g zentrifugieren.
- Übertragen Sie den Überstand auf neue Röhren.
- Sammeln Sie 50 μl, um die Scherwirkung nach Schritt 3 zu bestimmen und das gescherte Lysat in flüssigem Stickstoff einzufrieren. Das Lysat in Einwegaliquots bei -80 ° C aufbewahren.
3. Bestimmung der Scherwirkung
- Füge 50 μl Elutionspuffer zu den 50 & #181, L von jedem geschorenen Lysat und inkubieren bei 65 ° C über Nacht, mit Schütteln.
- 100 μl TE-Puffer und 4 μl 10 mg / mL RNase A (0,2 μg / μL Endkonzentration) zugeben. Mischen und inkubieren für 2 h bei 37 ° C, unter Schütteln.
- 2 μl 20 mg / ml Proteinase K (0,2 μg / μL Endkonzentration) zu jeder Probe geben und 2 h bei 55 ° C unter Schütteln inkubieren.
- Übertragen Sie jede Probe auf ein Gel-Rohr, das für die Bildung von Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol geeignet ist; Handhaben nach den Anweisungen des Herstellers.
- 200 μl Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1) zugeben und die Röhrchen schütteln. 5 min bei 24 ° C und ~ 16.000 xg zentrifugieren und die obere Phase in neue Röhrchen überführen.
Achtung: Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol sind bei Einatmen giftig und korrosiv; Arbeit unter einer Dunstabzugshaube und trage eine persönliche Schutzausrüstung. Auch behandeln Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol Abfälle acNach den Regeln der gastgebenden Einrichtung.- Wiederhole einmal.
- Reinigen Sie die DNA unter Verwendung von Reinigungsspalten gemäß der Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationen:
- Die Membran zweimal waschen. Nach dem letzten Waschen lassen Sie das Röhrchen für 2 min bei Raumtemperatur stehen, um das restliche Ethanol zu verdampfen.
- Für die Elution werden 50 & mgr; l H 2 O zugegeben, bei Raumtemperatur für 1 min inkubiert, das Röhrchen für 1 s gedünstet, um die Membran richtig zu benetzen und bei Raumtemperatur für 1 min vor der Eluierung der DNA durch Zentrifugation für 1 min bei inkubieren 24 ° C und ~ 17.900 x g.
- Quantifizieren Sie die gereinigte DNA auf einem Fluorometer mit einem hochempfindlichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Analysieren Sie etwa 500 ng der gereinigten DNA auf einem 1,8% Agarosegel und etwa 1 ng auf einem Elektrophoresesystem unter Verwendung eines hochempfindlichen Kits.
HINWEIS: Das erwartete SizE der DNA-Fragmente zwischen 200 und 500 bp liegt.
Tage 3 und 4
4. Immunpräzipitation
- 1 Volumen geschliffenes Lysat mit 5 Volumina Verdünnungspuffer verdünnen
- Mit 30 & mgr; l / ml Protein A-Agarose-Kügelchen (hergestellt gemäß Anhang A ) für 30 min unter Rotation im kalten Raum vorschneiden.
- Bei 4 ° C für 5 min bei 750 x g zentrifugieren
- Sammle 10% des Eingangs und stelle sie bei 4 ° C auf.
- Aliquot die gewünschte Menge an Lysat in neue Röhrchen (siehe Tabelle 3 für Details). Fügen Sie die gewünschten Antikörper zu jeder Röhre hinzu (siehe Tabelle 3 für Details) und drehen Sie sich über Nacht bei 4 ° C.
- 40 & mgr; l Protein A-Kügelchen zugeben und 1 h bei 4 ° C während des Rotierens inkubieren.
- Waschen Sie die Perlen mit 1 ml salzarmer Puffer, hochsalzigem Puffer, LiCl-Puffer und TE-Puffer (für jede Wäsche, inkubieren für 5 min bei 4 ° C während Rotieren und ZentrifugierenFür 3 min bei 4 ° C und ~ 950 xg). Siehe Tabelle 3 für Details.
- Füge 110 μl Elutionspuffer hinzu und inkubiere für 15 min bei Raumtemperatur, Vortexen alle 2 min.
- 3 min bei 4 ° C und ~ 950 xg zentrifugieren und 100 μl Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.7-4.8 mit 100 μl Elutionspuffer und kombinieren Sie die Eluate. Füge den Elutionspuffer bis zu 200 μl hinzu, um die Proben zu geben.
- Inkubieren Sie alle Proben über Nacht bei 65 ° C unter Schütteln.
Tag 5
5. DNA-Reinigung
- Zugabe von 200 μl TE-Puffer zu jedem Eluat und 8 μl 10 mg / ml RNase A (0,2 μg / μL Endkonzentration). Mischen und inkubieren für 2 h bei 37 ° C, unter Schütteln.
- 4 μl 20 mg / ml Proteinase K (0,2 μg / μL Endkonzentration) zu jedem Eluat geben und 2 h bei 55 ° C unter Schütteln inkubieren.
- Übertragen Sie jede Probe in ein GelRohr geeignet für Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol Extraktion; Handhaben nach den Anweisungen des Herstellers.
- 400 μl Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1) zugeben und die Röhrchen schütteln. 5 min bei 24 ° C und ~ 16.000 x g zentrifugieren Übertragen Sie die obere Phase auf neue Röhren.
Achtung: Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol sind bei Einatmen giftig und korrosiv; Arbeit unter einer Dunstabzugshaube und trage eine persönliche Schutzausrüstung. Auch Phenol-, Chloroform- und Isoamylalkoholabfälle nach den Regeln der gastgebenden Einrichtung behandeln.- Wiederhole einmal.
- Reinigen Sie die DNA mit Reinigungsspalten gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationen:
- Die Membran zweimal waschen. Nach dem letzten Waschvorgang die Röhrchen für 2 min bei Raumtemperatur öffnen, um das restliche Ethanol zu verdampfen.
- Für die Elution 50 μl H 2 O zugeben, bei Raumtemperatur inkubierenRe für 1 min, drehen die Röhrchen für 1 s, um die Membran richtig zu benetzen und bei Raumtemperatur für 1 min vor dem Eluieren der DNA durch Zentrifugation für 1 min bei 24 ° C und ~ 17.900 x g zu inkubieren.
Representative Results
Reife murine T-Zellen wurden einer ChIP-Analyse unterzogen, um die Anreicherung der Histonmark-Monomethylierung von Lysin 4 auf Histon 3 (H3K4me1), Tri-Methylierung von Lysin 4 auf Histon 3 (H3K4me3) und Acetylierung von Lysin 27 zu untersuchen Histon 3 (H3K27ac), sowie die Nukleosomenbelegung, wie aus panH3 ChIP hervorgeht. Die Scherqualität wurde durch Analyse auf einem 1,8% Agarosegel ( Fig. 2A ) und auf einem Elektrophorese-System ( Fig. 2B ) bewertet. H3K4me1 und H3K4me3 werden im Allgemeinen verwendet, um Enhancer-Stellen und Promotoren zu identifizieren (Abbildung 3A ). Tatsächlich ist H3K4me3 prominent, aber nicht ausschließlich an den Promotoren 5 , 8 , 14 angereichert. Eine Eigenschaft von aktiven Enhancern ist für H3K4me1 und H3K27ac hoch angereichert und für H3K4me3 (<Starke Klasse = "xfig"> Abbildung 3A, oberes Panel), während inaktive Enhancer niedrige Niveaus von H3K4me3 und H3K27ac aber hohen Niveaus von H3K4me1 (Abbildung 3A , unteres Panel) darstellen. Wie in Fig. 3B gezeigt , ist das Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase ( Gapdh ) -Gen repräsentativ für die Analyse von aktiven Gen-Promotoren ( Gapdh-Promotor ). In der Tat zeigt es hohe Niveaus von H3K4me3 und H3K27ac und niedrigem Niveau von H3K4me1. In Abbildung 3B ist Deltex1 ( Dtx1 ) repräsentativ für inaktive Enhancer ( Dtx1 Enhancer ), da es für H3K4me1 hoch angereichert und für H3K4me3 und H3K27ac schlecht angereichert ist. Die Gen-Wüste ist repräsentativ für eine Region, die keine kodierenden Gene enthält und wird gewöhnlich als Negativkontrolle für aktive Chromatin-Markierungen verklagt. Die Beobachtung, dass H3K4me1, eine gut akzeptierte Enhancer Mark 4 , 5 , 7 , 14 , 18 , ist nicht bereichert an Gene Wüste deutet darauf hin, dass diese Region fehlt Enhancer.
Abbildung 1: Schematische Übersicht über das vorgestellte ChIP-Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Scherqualitätskontrolle der reifen Maus-T-Zelllinie. ( A ) Zwei verschiedene Aliquots der reifen Maus-T-Zelllinie E2-10HA wurden geschert und etwa 500 ng gereinigte DNA wurden auf einem 1,8% Agarosegel analysiert, um ihre Scherung zu bewertenQualität. ( B ) 1 ng gereinigter DNA aus Probe 2 wurde durch Elektrophorese analysiert, um ihre Scherqualität zu bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Chromatin-Marken, die Enhancer und Promotoren charakterisieren. ( A ) Aktive Verstärker (obere Tafel) zeichnen sich durch hohe H3K4me1, niedrige H3K4me3 und hohe H3K27ac aus, während inaktive Enhancer (untere Tafel) hohe H3K4me1, niedrige H3K4me3 und niedrige H3K27ac vorhanden sind. ( B ) Die in Fig. 2A dargestellten Proben wurden zusammengefaßt und für die ChIP-Analyse gegenüber den Histonmarken H3K4me1, H3K4me3 und H3K27ac und Histonbelegung verwendet, wie durch panH3-ChIP aufgedeckt wurde. Diese Analyse zeigt, dass thE-Promotor des Haushaltgens Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase ( Gapdh-Promotor ) ist für H3K4me3 und H3K27ac hoch angereichert und für H3K4me1 niedrig angereichert. Auf der anderen Seite ist der Enhancer des inaktiven Gens Deltex1 ( Dtx1 Enhancer ) für H3K4me1 hoch angereichert, aber schlecht angereichert für H3K4me3 und H3K27ac. ChIP unter Verwendung eines panH3-Antikörpers wurde verwendet, um die Nukleosomenbelegung zu untersuchen. Gene Wüste wurde als Negativkontrolle verwendet. Ein repräsentatives Experiment wird gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Name des Puffers | Reagens | Endkonzentration |
| Verdünnungspuffer | NatriumdodecYl-sulfat (SDS) | 0,01% (w / v) |
| Triton X-100 | 1,1% (v / v) | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 | 1,2 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 16,7 mM | |
| Natriumchlorid (NaCl) | 167 mM | |
| DMA-Lösung | Dimethyladipimidat (DMA) | 10 mM |
| Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) | 1x | |
| Elutionspuffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 1% (w / v) |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCl pH 8,0 | 50 mM | |
| Hochsalzpuffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (w / v) |
| Triton X-100 | 1% (v / v) | |
| EthylendiamiNetetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 20 mM | |
| Natriumchlorid (NaCl) | 500 mM | |
| IMDM-Medium | Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM) | 1x |
| Fetales Rinderserum (FBS) | 2% (v / v) | |
| Penicillin / Streptomycin | 1x | |
| Pepton-Primaton | 0,3 mg / ml | |
| Insulinlösung Mensch | 4,8 mg / ml | |
| Minimale essentielle wesentliche nicht-essentielle Aminosäuren (MEM NEAA) | 1x | |
| LiCl-Salzpuffer | Lithiumchlorid (LiCl) | 0,25 M |
| IGEPAL-CA630 | 1% (v / v) | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 | 1 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 10 mM | |
| Niedriger Salzpuffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (w / v) |
| Triton X-100 | 1% (v / v) | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 20 mM | |
| Natriumchlorid (NaCl) | 150 mM | |
| Protein A Sepharose Perlen Waschpuffer | Tris-HCl pH 8,0 | 20 mM |
| Natriumchlorid (NaCl) | 500 mM | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (w / v) | |
| IGEPAL-CA630 | 1% (v / v) | |
| SDS-Lyse-Puffer | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 1% (w / v) |
| EthylendiAmintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 50 mM | |
| TE-Puffer | Tris-HCl pH 8,0 | 10 mM |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 | 1 mM |
Tabelle 1: Liste der Puffer und des in diesem Protokoll verwendeten Mediums.
| AUF | AUS | |
| Spitzenleistung | 150,0 | 2.5 |
| Duty Faktor | 15.0 | 15.0 |
| Zyklen / Burst | 500 | 500 |
| Anzahl der Zyklen | 28 | |
Tabelle 2: Schereinstellungen, die in diesem Protokoll verwendet werden. Diese Bedingungen wurden für eine reife Maus-T-Zelllinie optimiert.
| Antikörper | Lieferant | Menge an Antikörper / Immunpräzipitation | Menge der Zellen / Immunpräzipitation | Waschbedingungen |
| H3 | Abcam (ab1791) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Einmal in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer |
| H3K4me1 | Abcam (ab8895) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Einmal in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer |
| H3K4me3 | Diagenode (pAb-003-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Einmal in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer |
| H3K27ac | Diagenode (pAb-174-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Oce in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer |
| IgG | Diagenode (C15410206) | Variable* | Variable* | Variable* |
| * Im Fall der IgG-Kontrolle müssen die Menge an Antikörper und Zellen sowie die Waschschritte die Bedingungen der anderen Immunpräzipitationen spiegeln. | ||||
Tabelle 3: In dieser Studie verwendete Antikörper und Waschbedingungen
| Gen | Vorwärtsprimer | Rückwärtsprimer | Sonde |
| Gapdh-Promoter (0 kb) | 5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 ' | 5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 ' | 68 |
| Dtx1 Enhancer (+26 kb) | 5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 ' | 5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 ' | 27 |
| Gene Wüste | 5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 ' | 5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 ' | 94 |
Tabelle 4: Primer und Sonden für qPCR in dieser Studie verwendet.
| Problem | Ursachen | Lösung |
| Chromatin ist unter Schere und Fragmente sind zu groß. | Zu viele Zellen wurden verwendet. | Reduzieren Sie die Anzahl der Zellen. |
| Die Scherung ist zu niedrig. | Erhöhung der Anzahl der Scherzyklen. | |
| Erhöhen Sie die Scherspitzenleistung, das Tastverhältnis und / oder die Zyklen / Burst. | ||
| Chromatin ist über geschert und Fragmente sind zu klein. | Es wurden nur wenige Zellen verwendet. | Erhöhe die Anzahl der Zellen. |
| Das Scheren ist zu hoch. | Reduzieren Sie die Anzahl der Scherzyklen. | |
| Reduzieren Sie die Scherspitzenleistung, das Tastverhältnis und / oder die Zyklen / Burst. | ||
| Zu wenig Erholung über IGG-Steuerung und / oder Negativkontrolle (hoher Hintergrund). | Nicht genug Chromatin für das Experiment verwendet. | Erhöhung der Chromatinmenge |
| Die Menge des Antikörpers ist zu niedrig. | Erhöhe die Menge an Antikörper. | |
| Die Menge des Antikörpers ist zu hoch. | Reduzieren Sie die Menge an Antikörper. | |
| Der Antikörper hat eine geringe Spezifität. | Ändern Sie den Antikörper. | |
| Waschbedingungen sind zu streng. | Reduzieren Sie die Anzahl der Wäsche. | |
| Reduzieren Sie die Stringenz der Waschpuffer. | ||
| Waschbedingungen sind nicht streng genug. | Erhöhen Sie die Anzahl der Wäsche. | |
| Erhöhe die Stringenz der Waschpuffer. | ||
| Zu viel DNA wurde im qPCR pipettiert. | Reduzieren Sie die Menge an DNA, die im qPCR pipettiert wurde. | |
| QPCR-Bedingungen sind nicht optimal. | Optimiere die qPCR-Bedingungen. | |
| Reduzieren Sie die Anzahl der Zyklen. | ||
| Bei der qPCR-Reaktion der Eingangsmuster ist kein Produkt oder Produkt zu niedrig. | Nicht genügend DNA wurde im qPCR pipettiert. | Erhöhe die DNA-Menge, die im qPCR pipettiert wurde. |
| QPCR-Bedingungen sind nicht optimal. | Optimiere die qPCR-Bedingungen. | |
| Erhöhung der Anzahl der Zyklen. | ||
| Nicht genug Chromatin für das Experiment verwendet. | Erhöhung der Chromatinmenge | |
| Kein Signal in der Positivkontrolle und / oder PanH3 ChIP. | Nicht genug Chromatin für das Experiment verwendet. | Erhöhung der Chromatinmenge |
| Die Menge des Antikörpers ist zu niedrig. | Erhöhe die Menge an Antikörper. | |
| Die AntiKörper hat eine geringe Spezifität. | Ändern Sie den Antikörper. | |
| Elution ist suboptimal. | Achten Sie darauf, die Proben häufig zu verwirbeln, um die Perlen in Lösung zu halten. |
Tabelle 5: Fehlersuche.
Discussion
ChIP ist eine gültige Technik, um zu untersuchen, ob Proteine oder ihre PTMs an bestimmten genomischen Regionen angereichert sind. ChIP-Assay-Ergebnisse sind oft schwierig, aus biologischen oder technischen Gründen zu interpretieren. Die biologischen Gründe sind vielfach und beinhalten eine schwache oder indirekte Bindung von Proteinen an DNA. Es gibt auch technische Einschränkungen, wie z. B. begrenzte Antikörperspezifität und ineffiziente Zelllyse oder Chromatinscherung. Ein Handbuch zur Fehlerbehebung ( Tabelle 5 ) kann dem Leser helfen, die Probleme zu lösen, die bei ChIP-Assays auftreten können.
Dieses Protokoll, das eine kühlende fokussierte Ultraschallvorrichtung verwendet, ermöglicht es, das Chromatin einer reifen Maus-T-Zelllinie effizient zu scheren. Der wichtigste kritische Schritt des Protokolls wird durch die Scherung des Chromatins dargestellt, die immer für jeden Zelltyp optimiert werden muss. Es wird empfohlen, die Anzahl der Zellen und die Anzahl der Beschallungszyklen zu variieren. Außerdem ist sie das Wird durch die Anwesenheit von SDS-Präzipitaten in den Proben, die sich bei der Lyse der Zellen auf Eis mit SDS-Lysepuffer bilden können, negativ beeinflusst. In diesem Fall ist es am besten, die Probe nach der Lyse bei Raumtemperatur für einige Minuten zu inkubieren, um das Vorhandensein von SDS-Präzipitaten zu reduzieren. Es wird empfohlen, das Protokoll zu optimieren, um gescherte Fragmente zwischen 200 und 500 bp zu erhalten und immer die Scherqualität der Proben zu bewerten, bevor sie mit der Immunpräzipitation fortfahren. Zusätzlich müssen die Fixierungszeit, die Menge an Antikörper und / oder Zellen und die Waschbedingungen für jeden Antikörper optimiert werden.
Ein weiterer kritischer Schritt bei der erfolgreichen ChIP-Prozedur ist die Wahl des Antikörpers, da Antikörper mit niedriger Spezifität die Effizienz der Immunpräzipitation deutlich reduzieren. Bisher hat ein einheitliches Qualitätsprüfverfahren die Bewertung der Spezifität mehrerer auf dem Markt verfügbarer Antikörper ermöglicht Ss = "xref"> 19 Die Screening-Pipeline basierte auf Dot-Blot, Western Blot und ChIP und lieferte eine Liste von hochwertigen Reagenzien, die für ChIP 19 geeignet sind. In jüngerer Zeit wurde die Spezifität von mehreren handelsüblichen Antikörpern mit hochdichten Histonpeptid-Mikroarray-Plattformen ausgewertet, was die Einrichtung einer Datenbank über die Antikörperspezifität 20 ermöglicht. Der Leser kann dieses nützliche Werkzeug verwenden, um die spezifischsten Antikörper zu identifizieren, die für ChIP-Experimente verwendet werden können.
Dieses Protokoll wurde nicht auf primäre T-Zellen getestet und in diesem Fall sollte sich der Leser auf andere veröffentlichte Protokolle beziehen, die ChIP auf den primären T-Zellen 3 , 4 , 21 erfolgreich durchführen. Bemerkenswert ist, dass dieses Protokoll erfolgreich verwendet wurde, um ChIP auf einer Maus-Progenitor-T-Zelllinie sowie auf einer Maus-Endothelzelllinie durchzuführen.
Ove_content "> 5 x 10 6 Zellen sollten für jede Immunpräzipitation für die Analyse von Histonmarken verwendet werden. Da dieses Protokoll auch bei einigen Optimierungen geeignet ist, ChIP auf TFs oder Cofaktoren durchzuführen, ist es am besten, die Anzahl der Zellen zu erhöhen Die für die Immunpräzipitation in diesen Fällen verwendet werden. Um die erforderliche Anzahl von Zellen für jedes Experiment zu erreichen, können mehr Aliquots von geschertem Lysat zusammengemischt werden, bevor das Chromatin in dem Verdünnungspuffer verdünnt wird.Dieses Protokoll könnte auch modifiziert werden, um ChIP auf endogenen Proteinen durchzuführen, die nicht direkt an die DNA binden. In diesem Fall kann eine Vorfixierung mit Protein-Protein-Vernetzern ( z. B. Dimethyladipimidat, DMA) erforderlich sein (siehe Anhang B für weitere Informationen). Die erfolgreiche Leistung von ChIP auf Kofaktoren wurde zuvor durch Überexpression von Proteinen, die mit einem Biotin-Tag fusioniert wurden, durchgeführt. In diesem Fall wurde das Protein mit Streptavidin-Konjuga gereinigtMagnetische Perlen und eine Vorfixierung mit DMA wurde durchgeführt 22 .
Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken P. Käse und T. Schmidt-Wöll für hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die Kooperationsforschung TRR81 und das Heisenberg-Programm (BO 1639 / 5-1) der DFG, der Max-Planck-Gesellschaft und der EXC 294 in Freiburg sowie des Exzellenzclusters für Cardio-Pulmonalsystem unterstützt (ECCPS) in Gießen nach TB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
| Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
| Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
| Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
| dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
| Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Gibco | 15140-122 | |
| Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
| Phase Lock Gel Heavy 2 mL | 5 Prime | 2302830 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |
References
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