Summary
В этой работе описывается протокол иммунопреципитации хроматина (ChIP) с использованием зрелой мышиной линии Т-клеток. Этот протокол подходит для исследования распределения конкретных меток гистонов на конкретных сайтах-промоторах или в геноме.
Abstract
Сигнальные пути регулируют программы экспрессии генов посредством модуляции структуры хроматина на разных уровнях, таких как посттрансляционные модификации (ПТМ) хвостов гистонов, обмен каноническими гистонами с вариантами гистонов и выселение нуклеосом. Такое регулирование требует связывания чувствительных к сигналу факторов транскрипции (ТФ), которые набирают хроматин-модифицирующие ферменты в регулятивных элементах, определяемых как усилители. Понимание того, как сигнальные каскады регулируют активность энхансера, требует всестороннего анализа связывания TF, ферментов, модифицирующих хроматин, и заполнения специфических гистоновых меток и вариантов гистонов. Анализы иммунопреципитации хроматина (ChIP) используют высокоспецифичные антитела к иммунопреципитации специфических комплексов белка / ДНК. Последующий анализ очищенной ДНК позволяет идентифицировать область, занятую белком, распознаваемым антителом. Эта работа описывает протокол для эффективного управленияRform ChIP белков гистонов в зрелой линии Т-клеток мыши. Представленный протокол позволяет проводить анализы ChIP в разумные сроки и с высокой воспроизводимостью.
Introduction
Развитие, дифференцировка и гомеостаз зависят от конкретных программ экспрессии генов, которые устанавливаются сигнальными событиями, которые модулируют структуру хроматина и, следовательно, определяют, активирован или репрессирован конкретный ген, специфичным для клеток и времени. Во время развития Т-клеток необходимо установить специфические программы экспрессии генов, чтобы правильно определить созревание предшественников Т-клеток из двойного отрицательного (DN) в однополюсное состояние (SP), проходя через несколько промежуточных этапов 1 . Как динамическая регуляция программы экспрессии генов в процессе развития Т-клеток широко исследовалась в предыдущие годы несколькими лабораториями 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
В результате посттрансляционных модификаций (ПТМ) гистонов обменКанонические гистоны с вариантами гистонов, выселение нуклеосом и метилирование ДНК регулируют переключатель ON / OFF генов. Несколько групп исследовали распространение генома РММ и вариантов гистонов в геноме для определения меток, связанных с различными состояниями хроматина как в проксимальной, так и в дистальной областях регуляции 7 , 8 , 9 , 10 . Сигнализационные каскады организуют динамическую регуляцию хроматина посредством обмена положительными и отрицательными хроматин-модифицирующими ферментами (также известными как модификаторы хроматина) у конкретных энхансерных элементов. Эти модификаторы хроматина регулируют структуру хроматина и, следовательно, выход транскрипции, например, путем динамического метилирования гистонов и ацетилирования. Это имеет место в канале 11 , 12 , 13 сигнализации Notch ,14.
Динамические гистоновые ПТМ; Обмены с вариантами гистонов; И динамическое заполнение гистонов, факторов транскрипции и кофакторов может быть исследовано с помощью анализов хроматина иммунопреципитации (ChIP). Для очистки специфических ДНК-белковых комплексов используют высокоспецифичные антитела, а очищенную ДНК анализируют с помощью количественной ПЦР (qPCR); Глубокое упорядочение (ChIP-Seq); Или, реже, в настоящее время, гибридизацию с микрочипом (ChIP-ChIP).
Анализы ChIP иногда сложны из-за осложнений с лизису клеток, срезанием хроматина и / или низкой специфичностью антител. Было принято несколько стратегий для улучшения протокола, как это имеет место для NEXSON 15 . Использование охлаждающих водяных ванн позволяет избежать нагревания образцов, которые могут повредить эпитопы, присутствующие на исследуемом белке, но энергия, необходимая для сдвига образцов, рассеивается в воде.Еще одно улучшение было достигнуто при разработке сфокусированных устройств ультразвуковой диагностики, которые препятствуют диспергированию энергии. Поэтому сфокусированные ультразвуковые устройства позволяют улучшить лизис клеток и сдвиг хроматина, устраняя вызванные оператором вариации и значительно увеличивая воспроизводимость.
Эта работа описывает протокол (схематический обзор на рисунке 1 ) для эффективного выполнения ChIP белков гистонов в зрелой мышиной T-клеточной линии E2-10HA 16 , 17 . Т-клетки обычно трудно лизировать, и было обнаружено, что сдвиг их хроматина неэффективен. В этом протоколе, который использует охлаждающий сфокусированный ультразвуковой преобразователь, количество ячеек, буфер лизиса и настройка сдвига были оптимизированы для линии Т-клеток мыши E2-10HA. Этот протокол позволяет выполнять ЧИП с высокой воспроизводимостью и в разумные сроки. Фактически, это требованиеПримерно через два дня, чтобы срезать хроматин и оценить качество срезания, и три дня для проведения иммунопреципитации, переверните сшивку и очистите ДНК.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ. Все буферы и среда, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице 1 .
Дни 1 и 2
1. Сшивание клеток
- Перенесите мышиные Т-клетки из 6-луночного планшета в трубку объемом 50 мл и центрифугируйте в течение 5 мин при 4 ° С и ~ 271 х г. Ресуспендируют клеточный осадок в 30 мл культуральной среды клеток IMDM и подсчитывают клетки с использованием камеры Нойбауэра.
- Собирайте аликвоты 20 × 10 6 клеток в новые 50 мл пробирки.
- Добавить формальдегид (FMA) до конечной концентрации 1% непосредственно в среду для культивирования клеток и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
Осторожно: FMA токсичен при вдыхании, поэтому работайте под вытяжным колпаком и надевайте надлежащее защитное оборудование. Кроме того, обращайтесь с отходами FMA в соответствии с правилами принимающего учреждения. - Добавьте 1/8-объем 1 М глицина, pH 7,0 и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Гранулируют клетки центрифугированием в течение 5Мин при 4 ° С и ~ 271 хг и промыть 10 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS).
- Промывают клеточный осадок 1 мл PBS и переносят в 1,5 мл пробирки.
2. Лизис клеток и резка хроматина
- Ресуспендируют клеточный осадок в 1 мл буфера для лизиса SDS и инкубируют на льду в течение 10 мин.
- Перенесите каждый образец в трубку для ультразвуковой обработки и выполните сдвиг с помощью сфокусированного ультразвукового устройства в соответствии с настройками, указанными в таблице 2.
- После сдвига перенесите образцы в 1,5 мл пробирки и центрифугируйте в течение 10 минут при 4 ° C и ~ 18000 x g.
- Перенесите супернатант в новые трубки.
- Соберите 50 мкл для определения эффективности сдвига в соответствии со стадией 3 и защелкните замороженный лизат в жидком азоте. Храните лизат в одноразовых аликвотах при -80 ° C.
3. Определение эффективности среза
- Добавить 50 мкл буфера для элюирования в 50 &181; L каждого срезанного лизата и инкубировать при 65 ° С в течение ночи, со встряхиванием.
- Добавьте 100 мкл ТЕ-буфера и 4 мкл 10 мг / мл РНКазы А (конечная концентрация 0,2 мкг / мкл). Смешать и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С, сотрясая.
- Добавьте 2 мкл 20 мг / мл протеиназы К (0,2 мкг / мкл конечной концентрации) к каждому образцу и инкубируйте в течение 2 ч при 55 ° С при встряхивании.
- Перенесите каждый образец в гель-трубку, подходящую для экстракции фенол / хлороформ / изоамиловый спирт; В соответствии с инструкциями производителя.
- Добавить 200 мкл фенола / хлороформа / изоамилового спирта (25: 24: 1) и встряхнуть трубки. Центрифуга в течение 5 минут при 24 ° C и ~ 16 000 xg и перенос верхней фазы на новые трубки.
Осторожно: фенол, хлороформ и изоамиловый спирт являются токсичными при вдыхании и коррозии; Работайте под вытяжным шкафом и надевайте надлежащее личное защитное оборудование. Кроме того, обрабатывать фенол, хлороформ и изоамиловый спиртВ соответствии с правилами принимающего учреждения.- Повторите один раз.
- Очистите ДНК с помощью колонок очистки в соответствии с инструкцией изготовителя со следующими изменениями:
- Промойте мембрану дважды. После последней стирки оставляйте трубу открытой в течение 2 мин при комнатной температуре для испарения остаточного этанола.
- Для элюирования добавьте 50 мкл H 2 O, инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин, закрутите пробирку в течение 1 с для надлежащего смачивания мембраны и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин перед элюированием ДНК центрифугированием в течение 1 мин при 24 ° C и ~ 17 900 x g.
- Количественный анализ очищенной ДНК на флюорометре с использованием набора с высокой чувствительностью в соответствии с инструкциями производителя.
- Проанализируйте приблизительно 500 нг очищенной ДНК на 1,8% агарозном геле и приблизительно 1 нг на электрофоретической системе с использованием набора с высокой чувствительностью.
ПРИМЕЧАНИЕ. Ожидаемый результатE фрагментов ДНК составляет от 200 до 500 пар оснований.
Дни 3 и 4
4. Иммунопреципитация
- Разбавьте 1 объем срезанного лизата с 5 объемами буфера для разведения.
- Пречистите 30 мкл / мл белковых агарозных гранул (приготовленных согласно Приложению А ) в течение 30 мин при вращении в холодной комнате.
- Центрифуга при 4 ° С в течение 5 мин при ~ 750 х g.
- Соберите 10% входного сигнала и храните его при 4 ° C.
- Выровняйте необходимое количество лизата в новые пробирки (подробности см. В таблице 3 ). Добавьте необходимые антитела в каждую пробирку (см. Таблицу 3 ) и вращайте ее в течение ночи при 4 ° C.
- Добавить 40 мкл белковых гранул А и инкубировать в течение 1 ч при 4 ° С при вращении.
- Вымойте шарики 1 мл буфера с низким содержанием соли, буфера с высоким содержанием соли, буфера LiCl и буфера TE (для каждой промывки инкубируйте в течение 5 мин при 4 ° С при вращении и центрифугеВ течение 3 мин при 4 ° С и ~ 950 мкг). Подробную информацию см. В таблице 3 .
- Добавить 110 мкл буфера для элюирования и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре, встряхивая каждые 2 мин.
- Центрифугируют в течение 3 мин при 4 ° С и ~ 950 мкг и переносят 100 мкл супернатанта в новую пробирку объемом 1,5 мл.
- Повторите шаги 4.7-4.8 с помощью 100 мкл буфера для элюирования и объедините элюаты. Добавьте буфер элюции до 200 мкл для ввода образцов.
- Инкубируйте все образцы в течение ночи при 65 ° C, сотрясая.
День 5
5. Очистка ДНК
- Добавьте 200 мкл ТЕ-буфера в каждый элюат и 8 мкл 10 мг / мл РНКазы А (конечная концентрация 0,2 мкг / мкл). Смешать и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С, сотрясая.
- Добавьте 4 мкл 20 мг / мл протеиназы К (0,2 мкг / мкл конечной концентрации) в каждый элюат и инкубируйте в течение 2 ч при 55 ° С, сотрясая.
- Перенесите каждый образец в гельПробирка, подходящая для экстракции фенол / хлороформ / изоамиловый спирт; В соответствии с инструкциями производителя.
- Добавить 400 мкл фенола / хлороформа / изоамилового спирта (25: 24: 1) и встряхнуть трубки. Центрифуга в течение 5 мин при 24 ° С и ~ 16 000 х г. Перенесите верхнюю фазу на новые трубки.
Осторожно: фенол, хлороформ и изоамиловый спирт являются токсичными при вдыхании и коррозии; Работайте под вытяжным шкафом и надевайте надлежащее личное защитное оборудование. Кроме того, обрабатывайте отходы фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соответствии с правилами принимающего учреждения.- Повторите один раз.
- Очистите ДНК с помощью колонок очистки в соответствии с инструкциями производителя со следующими изменениями:
- Промойте мембрану дважды. После последней промывки оставьте трубки открытыми в течение 2 мин при комнатной температуре для испарения остаточного этанола.
- Для элюирования добавьте 50 мкл H 2 O, инкубируйте при комнатной температуреПовтор ют в течение 1 мин, вращают пробирки в течение 1 с дл надлежащего смачивани мембраны и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин перед элюированием ДНК путем центрифугировани в течение 1 мин при 24oC и ~ 17,900 & bull; g.
Representative Results
Зрелые мышиные Т-клетки подвергали анализу ChIP для исследования обогащения монометилирования метки гистоном лизина 4 на гистоне 3 (H3K4me1), триметилировании лизина 4 на гистоне 3 (H3K4me3) и ацетилировании лизина 27 на Гистона 3 (H3K27ac), а также при загрузке нуклеосом, как показано panH3 ChIP. Качество среза оценивали анализом на 1,8% агарозном геле ( фиг. 2А ) и на электрофоретической системе ( фиг. 2В ). H3K4me1 и H3K4me3 обычно используются для идентификации сайтов-энхансеров и промоторов соответственно ( фиг. 3А ). Фактически, H3K4me3 является заметным, но не исключительно обогащенным промоторами 5 , 8 , 14 . Характеристика активных энхансеров должна быть высоко обогащена для H3K4me1 и H3K27ac и плохо обогащена для H3K4me3 (<Сильный класс = «xfig»> Рисунок 3A, верхняя панель), тогда как неактивные усилители представляют низкие уровни H3K4me3 и H3K27ac, но высокие уровни H3K4me1 ( рисунок 3A , нижняя панель). Как показано на фиг.3В , ген Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( Gapdh ) является репрезентативным для анализа активных промоторов генов ( промотор Gapdh ). Фактически, он показывает высокие уровни H3K4me3 и H3K27ac и низкие уровни H3K4me1. На рисунке 3B Deltex1 ( Dtx1 ) представляет собой неактивные энхансеры ( усилитель Dtx1 ), поскольку он высоко обогащен H3K4me1 и плохо обогащен для H3K4me3 и H3K27ac. Джин-пустыня является репрезентативной для региона, в котором отсутствуют кодирующие гены, и обычно применяется в качестве отрицательного контроля для активных меток хроматина. Наблюдение, что H3K4me1, хорошо принятая энхансерная отметка 4 , 5 , 7 , 14 , 18 , не обогащается в Джин-пустыне, говорит о том, что в этом регионе отсутствуют энхансеры.
Рисунок 1: Схематический обзор представленного протокола ChIP. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Контроль качества среза зрелой мышиной линии Т-клеток. ( А ). Две различные аликвоты линии Т-клеток зрелой мыши E2-10HA были сдвинуты и приблизительно 500 нг очищенной ДНК были проанализированы на 1,8% агарозном геле для оценки их сдвигаКачества. ( B ) 1 нг очищенной ДНК из образца 2 анализировали электрофорезом для оценки его качества сдвига. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Хроматиновые метки, которые характеризуют усилители и промоторы. ( A ) Активные энхансеры (верхняя панель) характеризуются высоким H3K4me1, низким H3K4me3 и высоким H3K27ac, тогда как неактивные энхансеры (нижняя панель) имеют высокий H3K4me1, низкий H3K4me3 и низкий H3K27ac. ( B ) Образцы, представленные на фиг. 2A , объединяли вместе и использовали для анализа ChIP по сравнению с гистоновыми метками H3K4me1, H3K4me3 и H3K27ac и заполнением гистонов, как показано PanH3 ChIP. Этот анализ показывает, чтоE промотор гена домашнего хозяйства Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ( промотор Gapdh ) высоко обогащен для H3K4me3 и H3K27ac и слабо обогащен для H3K4me1. С другой стороны, энхансер неактивного гена Deltex1 ( усилитель Dtx1 ) сильно обогащен для H3K4me1, но плохо обогащен для H3K4me3 и H3K27ac. ChIP с использованием антитела panH3 использовали для исследования активности нуклеосом. Джин-пустыня использовалась как отрицательный контроль. Показан один представительный эксперимент. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Название буфера | реактив | Конечная концентрация |
| Буфер для разбавления | Натрий-додекИлсульфат (SDS) | 0,01% (мас. / Об.) |
| Triton X-100 | 1,1% (об. / Об.) | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 | 1,2 мМ | |
| Трис-HCl, pH 8,1 | 16,7 мМ | |
| Хлорид натрия (NaCl) | 167 мМ | |
| Решение DMA | Диметиладипимидат (DMA) | 10 мМ |
| Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) | 1x | |
| Элюирующий буфер | Додецилсульфат натрия (SDS) | 1% (мас. / Об.) |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 | 10 мМ | |
| Трис-HCl, pH 8,0 | 50 мМ | |
| Высокий буфер соли | Додецилсульфат натрия (SDS) | 0,1% (мас. / Об.) |
| Triton X-100 | 1% (об. / Об.) | |
| EthylenediamiНететрауксусная кислота (ЭДТА) pH 8,0 | 2 мМ | |
| Трис-HCl, pH 8,1 | 20 мМ | |
| Хлорид натрия (NaCl) | 500 мМ | |
| Среда IMDM | Исключительная среда Дульбекко (IMDM) | 1x |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | 2% (об. / Об.) | |
| Пенициллин / стрептомицин | 1x | |
| Пептон-приматон | 0,3 мг / мл | |
| Человеческий раствор инсулина | 4,8 мг / мл | |
| Минимальные незаменимые аминокислоты (MEM NEAA) | 1x | |
| Солевой буфер LiCl | Хлорид лития (LiCl) | 0,25 М |
| IGEPAL-CA630 | 1% (об. / Об.) | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 | 1 мМ | |
| Трис-HCl, pH 8.1 | 10 мМ | |
| Низкий буфер соли | Додецилсульфат натрия (SDS) | 0,1% (мас. / Об.) |
| Triton X-100 | 1% (об. / Об.) | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 | 2 мМ | |
| Трис-HCl, pH 8,1 | 20 мМ | |
| Хлорид натрия (NaCl) | 150 мМ | |
| Буфер для очистки белков A Sepharose | Трис-HCl, pH 8,0 | 20 мМ |
| Хлорид натрия (NaCl) | 500 мМ | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 | 2 мМ | |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | 0,1% (мас. / Об.) | |
| IGEPAL-CA630 | 1% (об. / Об.) | |
| Буфер для лизиса SDS | Додецилсульфат натрия (SDS) | 1% (мас. / Об.) |
| EthylenediАминететрауксусная кислота (ЭДТА), рН 8,0 | 10 мМ | |
| Трис-HCl, pH 8,1 | 50 мМ | |
| TE буфер | Трис-HCl, pH 8,0 | 10 мМ |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), pH 8,0 | 1 мМ |
Таблица 1: Список буферов и среды, используемой в этом протоколе.
| НА | OFF | |
| Пиковая мощность | 150,0 | 2.5 |
| Коэффициент полезного действия | 15,0 | 15,0 |
| Циклы / взрыв | 500 | 500 |
| Количество циклов | 28 | |
Таблица 2: Параметры сдвига, используемые в этом протоколе . Эти условия были оптимизированы для зрелой мышиной линии Т-клеток.
| антитело | поставщик | Количество антител / иммунопреципитация | Количество клеток / иммунопреципитация | Условия стирки |
| H3 | Аббам (ab1791) | 2,5 мг | 5 x 10 6 | Однажды в буфере с низкой солью, дважды в буфере с высоким содержанием соли, дважды в буфере для соли LiCl и три раза в буфере TE |
| H3K4me1 | Abcam (ab8895) | 2,5 мг | 5 x 10 6 | Однажды в буфере с низкой солью, дважды в буфере с высоким содержанием соли, дважды в буфере для соли LiCl и три раза в буфере TE |
| H3K4me3 | Диагодекс (pAb-003-050) | 2,5 мг | 5 x 10 6 | Однажды в буфере с низкой солью, дважды в буфере с высоким содержанием соли, дважды в буфере для соли LiCl и три раза в буфере TE |
| H3K27ac | Диагодекс (pAb-174-050) | 2,5 мг | 5 x 10 6 | Oce в буфере с низкой солью, дважды в буфере с высокой солью, дважды в буфере для соли LiCl и три раза в буфере TE |
| IgG | Диагеноз (C15410206) | Переменная * | Переменная * | Переменная * |
| * В случае контроля IgG количество как антитела, так и клеток, а также этапы промывки должны отражать условия других иммунопреципитаций. | ||||
Таблица 3: Антитела и условия стирки, используемые в этом исследовании.
| Ген | Передний праймер | Обратный праймер | зонд |
| Gapdh промотор (0 kb) | 5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 ' | 5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 ' | 68 |
| Усилитель Dtx1 (+26 kb) | 5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 ' | 5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 ' | 27 |
| Джин-пустыня | 5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 ' | 5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 ' | 94 |
Таблица 4: Грунты и зонды, используемые для qPCR в этом исследовании.
| проблема | причины | Решение |
| Хроматин находится под срезом, а фрагменты слишком большие. | Было использовано слишком много клеток. | Уменьшите количество ячеек. |
| Стрижка слишком низкая. | Увеличьте количество циклов сдвига. | |
| Увеличьте пиковую мощность сдвига, коэффициент заполнения и / или цикл / взрыв. | ||
| Хроматин перерезан, а фрагменты слишком малы. | Было использовано слишком мало клеток. | Увеличьте количество ячеек. |
| Сдвиг слишком высок. | Уменьшите количество циклов сдвига. | |
| Уменьшите пиковое значение сдвига, коэффициент заполнения и / или цикл / всплеск. | ||
| Слишком низкое восстановление по сравнению с IGG и / или отрицательный контроль (высокий фон). | Недостаточно хроматина, используемого для эксперимента. | Увеличьте количество хроматина. |
| Количество антител слишком низкое. | Увеличьте количество антител. | |
| Количество антител слишком велико. | Уменьшите количество антител. | |
| Антитело обладает низкой специфичностью. | Измените антитело. | |
| Условия стирки слишком строгие. | Уменьшите количество стирки. | |
| Уменьшите жесткость стиральных буферов. | ||
| Условия стирки не являются достаточно строгими. | Увеличьте количество стирки. | |
| Увеличьте жесткость стиральных буферов. | ||
| Слишком много ДНК пипетировали в qPCR. | Уменьшите количество ДНК, пипеткой в qPCR. | |
| Условия qPCR не являются оптимальными. | Оптимизируйте условия qPCR. | |
| Уменьшите количество циклов. | ||
| В реакции qPCR входного образца продукт или продукт не слишком низки. | Недостаточно ДНК пипетировали в qPCR. | Увеличьте количество ДНК, пипеткой в qPCR. |
| Условия qPCR не являются оптимальными. | Оптимизируйте условия qPCR. | |
| Увеличьте количество циклов. | ||
| Недостаточно хроматина, используемого для эксперимента. | Увеличьте количество хроматина. | |
| Нет сигнала в положительном контроле и / или panH3 ChIP. | Недостаточно хроматина, используемого для эксперимента. | Увеличьте количество хроматина. |
| Количество антител слишком низкое. | Увеличьте количество антител. | |
| АнтиТело имеет низкую специфичность. | Измените антитело. | |
| Элюирование является субоптимальным. | Не забудьте часто вихрировать образцы для поддержания бусинок в растворе. |
Таблица 5: Поиск и устранение неисправностей.
Discussion
ChIP является допустимым методом для исследования того, обогащены ли белки или их ПТМ в определенных геномных областях. Результаты анализа ChIP часто сложно интерпретировать по биологическим или техническим причинам. Биологические причины многообразны и включают слабое или непрямое связывание белков с ДНК. Существуют также технические ограничения, такие как ограниченная специфичность антител и неэффективный клеточный лизис или сдвиг хроматина. Руководство по поиску и устранению неисправностей ( Таблица 5 ) может помочь читателю решить проблемы, которые могут возникнуть при анализе ChIP.
Этот протокол, используя охлаждающее сфокусированное ультразвуковое устройство, позволяет эффективно сдвигать хроматин зрелой мышиной линии Т-клеток. Основной критический шаг протокола представлен сдвигом хроматина, который всегда должен быть оптимизирован для каждого типа ячейки. Предлагается варьировать количество ячеек и количество циклов обработки ультразвуком. Кроме того, она На эффективность реакции отрицательно влияет присутствие осадка SDS в образцах, которое может образоваться при лизении клеток на льду с помощью буфера для лизиса SDS. В этом случае лучше всего инкубировать образец после лизиса при комнатной температуре в течение нескольких минут, чтобы уменьшить присутствие осадков SDS. Рекомендуется оптимизировать протокол для получения срезанных фрагментов от 200 до 500 пар оснований и всегда оценивать качество срезанных образцов перед проведением иммунопреципитации. Кроме того, время фиксации, количество антитела и / или клеток и условия стирки должны быть оптимизированы для каждого антитела.
Еще одним важным шагом в успешном выполнении процедуры ChIP является выбор антитела, поскольку антитела с низкой специфичностью значительно снижают эффективность иммунопреципитации. Ранее единая процедура проверки качества позволила оценить специфичность нескольких антител, доступных на рынке Ss = "xref"> 19. Просеивающий трубопровод был основан на дот-блоте, вестерн-блоте и ChIP, предоставляя список высококачественных реагентов, подходящих для ChIP 19 . Совсем недавно специфика нескольких коммерчески доступных антител оценивалась с использованием высокоплотных гистоновых пептидных микроматричных платформ, позволяющих создать базу данных по специфичности антител 20 . Читатель может использовать этот полезный инструмент для определения наиболее специфических антител, которые могут быть использованы для экспериментов ChIP.
Этот протокол не был протестирован для первичных Т-клеток, и в этом случае читатель должен ссылаться на другие опубликованные протоколы, которые успешно выполняют ChIP на первичных Т-клетках 3 , 4 , 21 . Примечательно, что этот протокол был успешно использован для выполнения ChIP на линии T-клеток прародителя мыши, а также на линии эндотелиальных клеток мыши.
Ove_content "> 5 x 10 6 клеток должны использоваться для каждой иммунопреципитации для анализа меток гистонов. Поскольку этот протокол также может быть подходящим, с некоторой оптимизацией, для выполнения ChIP на TF или кофакторах, лучше всего увеличить количество клеток Используемого для иммунопреципитации в этих случаях. Чтобы достичь необходимого количества клеток для каждого эксперимента, больше аликвот срезанного лизата можно объединить вместе до разбавления хроматина в буфере для разведения.Этот протокол также можно было бы модифицировать для выполнения ChIP на эндогенных белках, которые не связываются непосредственно с ДНК. В этом случае может потребоваться предварительная фиксация белково-белковыми сшивающими агентами ( например, диметиладипимидатом, DMA) (дополнительную информацию см . В приложении B ). Успешное выполнение ChIP на кофакторах ранее выполнялось с помощью сверхэкспрессирующих белков, которые слиты с биотином. В этом случае белок очищали стрептавидином-конъюнктомБыли выполнены магнитные бусины и предварительная фиксация с помощью DMA 22 .
Disclosures
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны П. Кэсе и Т. Шмидт-Вёлл за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана совместным исследовательским грантом TRR81 и программой Гейзенберга (BO 1639 / 5-1) DFG (Германский исследовательский фонд), Общество Макса Планка и EXC 294 во Фрайбурге и Кластер Excellence для сердечно-легочной системы (ECCPS) в Гиссене с туберкулезом
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
| Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
| Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
| Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
| dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
| Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Gibco | 15140-122 | |
| Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
| Phase Lock Gel Heavy 2 mL | 5 Prime | 2302830 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |
References
- Rothenberg, E. V. The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming. Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).
- Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity. Cell. 149 (2), 467-482 (2012).
- Cauchy, P., et al. Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation. Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).
- Koch, F., et al. Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).
- Pekowska, A., et al. H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).
- Vanhille, L., et al. High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq. Nat Commun. 6, 6905 (2015).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Ostuni, R., et al. Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).
- Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. Dynamic chromatin regulation at Notch target genes. Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).
- Liefke, R., et al. Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex. Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).
- Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway. Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).
- Oswald, F., et al. A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes. Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).
- Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq. Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).
- Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. Cellular interactions involved in Th cell memory. J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).
- White, J., et al. Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors. J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).
- Ghisletti, S., et al. Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages. Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Fenouil, R., et al. CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters. Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).
- Hein, K., et al. Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response. Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).
