Summary
توافر المنبوذة جسدية أمر حاسم بالنسبة للطب التجديدي، النمذجة المرض والتبصر في خصائص اتفاقية استكهولم. هنا نقدم استراتيجيات تجريبية لإعادة برمجة، ومتباينة في المختبر، الخلايا الكبار في الخلايا الجذعية الخاصة بالانسجة القابلة للتوسيع/السلف المناظرة لها بتعبير عابر المنشط المشارك النسخي واحد ياب.
Abstract
نقدم هنا البروتوكولات لعزل خلايا متمايزة أولية ودورة لهم داخل الخلايا الجذعية/السلف (المنبوذة) من نفس النسب حسب تعبير عابر عامل النسخ ياب. مع هذا الأسلوب، يتم تحويل لومينال (LD) متمايزة خلايا الغدة الثديية الماوس إلى الخلايا التي يحمل خصائص الجزيئية والوظيفية للطوائف المنبوذة الثديية. ياب أيضا يتحول متباينة تماما إفرازات خلايا البنكرياس في البنكرياس مثل لاصق موروث. وبالمثل، للطوائف المنبوذة الذاتية، والطبيعية، المستحثة ياب الخلايا الجذعية مثل ("يسكس") يمكن في نهاية المطاف توسيع أورجانويد الثقافات طويلة الأجل في المختبر، دون الحاجة إلى المزيد من حمل خارج الرحم ياب/طاز، كما هبت يسكس مع دولة مثل اتفاقية استكهولم الذاتي تجديد الموروثة.
هذا الإجراء إعادة برمجة المقدمة هنا يوفر إمكانية إنشاء وتوسيع نطاق الخلايا في المختبر السلف من مختلف المصادر الأنسجة بدءاً من الخلايا المتمايزة. توسيع مباشرة من خلايا جسدية السابقين فيفو قد آثار بالنسبة للطب التجديدي، لفهم آليات بدء الورم، وعموما، للخلية، ودراسات علم الأحياء التنموي.
Introduction
الخلايا الجذعية الجسدية الخاصة بالانسجة (المنبوذة) ذات أهمية حاسمة لإصلاح وتجديد الأنسجة بعد الإصابة. إمكانية عزل بسهولة وغير محدود توسيع السابقين فيفو جسدية المنبوذة يمثل قضية حاسمة للعلاجات التجدد المحتملة، فضلا عن تطبيقات اتفاقية استكهولم في البحوث الأساسية والنمذجة المرض. ومع ذلك، اقتصر التقدم في هذا الاتجاه، بصعوبة التقاط حالة اتفاقية استكهولم من مختلف الأجهزة الظهارية في المختبر. في الواقع، في أنسجة البالغين عدة المنبوذة المقيم قد غير موجود، أو لا تكون متوفرة بسهولة، أو قد تآكلت عددهم وإمكانات التجدد بظروف الشيخوخة أو المرض. في عام 2016، بدأنا لسد هذه الفجوة بالإبلاغ عن ذلك التعبير عن كواكتيفاتور النسخي واحد، ياب (البروتين المرتبط بنعم) أو البروتين ارتباطاً وثيقا طاز (المنشط النسخي مع فكرة بدز)، إلى خلايا متمايزة الميؤوس من شفائهم كفاءة يخلق السكان خلية الوظيفية، قابلة للتوسيع، وغير الورمية، الذاتي التي لا يمكن تمييزها عمليا وجزيئيا من الطوائف المنبوذة الأنسجة الخاصة بهم المقابلة1. نبض لاستدامة ياب أو نشاط طاز لبضعة أيام كافية للحث على مظهر الذاتي تجديد المنبوذة جسدية. هذه هي حالة مستقرة لم يعد يعتمد على التعبير التحوير مستمر، كما أنها يمكن أن تنتقل عبر الأجيال الخلية دون مزيد من التعبير عن حمل خارج الرحم طاز ياب/1. البروتوكول المعروضة هنا تفاصيل الإجراءات المستخدمة لتوليد الخلايا الجذعية/السلف الظهارية حيثياته الغدة الثديية والبنكرياس، بدءاً من خلايا متمايزة لهذه الأنسجة. هذا الإجراء يقوم بتعبئة مربع أسود على الساحة الحالية إعادة برمجة/ترانسديفيرينتييشن. الجهود الرئيسية في هذه الاتجاهات لها في الواقع حتى الآن تركزت على انتقال الخلية إلى حالة المستحثة pluripotent خلايا الجذعية (اللجنة التوجيهية)، متبوعاً بتحويل هذه الأجنة وأكثر تمايزاً المنبوذة pluripotent في الخلايا. ومع ذلك، إيبسكس الورمية مرة أدخلت في أنسجة البالغين، زيادة الحاجة إلى وضع بروتوكولات ل التمايز كاملة وفعالة على2. ومع ذلك، التمايز، حتى عندما يكون ذلك ممكناً، وتأتي هذه الخطوة بسعر طويلة الأمد القابلية للتوسعة، والتنظيم الذاتي والجهاز إمكانات إعادة تعمير. هذه هي سمات أساسية لتجديد الجهاز التي في الواقع نموذجية فقط الذاتية الخاصة بالانسجة المنبوذة ووصف حاليا المنبوذة التي يسببها ياب (يسكس). وبالمثل، ميزت transdifferentiation مباشرة من نوع خلية واحدة إلى أخرى عن طريق استخدام زجاجات نسخ مختلف العوامل أيضا توليد الخلايا التي تفتقر إلى أساسي من التكاثري وستيمنيس المحتملة3.
يأخذ الإجراء الموضح هنا أيضا استفادة التكنولوجيا أورجانويد أدخل مؤخرا، والذي يمكن توسيع المنبوذة الذاتية وميزت السابقين فيفو4. قد تنشئ المنبوذة التي يسببها ياب أورجانويد تشكيل اللجان الدائمة حتى في الظروف البيولوجية أو المرض التجريبية، المنبوذة الذاتية التي ليست موجودة. ونود أن نلاحظ أنه قد تتوافق مع نوع الخلية اللدونة تقدمها ياب في الاختلاف مع إجراءات أخرى لإعادة برمجة، الشكل الوحيد للعودة إلى حالة شبيهة باتفاقية استكهولم التي تحدث في الأنسجة الحية. لقد ارتبطت اكتسابها للصفات مثل اتفاقية استكهولم مع إصلاح الأنسجة أو التنشيط النمطان5. على الرغم من أن يمكن الاستغناء عنها للتوازن من عدة أنسجة البالغين، ياب و/أو طاز ضرورية على الإطلاق للتجديد ونمو الورم وتوسيع المنبوذة جسدية في المختبر1،،من67،8 ،9،10،،من1112
Protocol
وأجريت إجراءات الحيوان جميع التمسك بمبادئنا التوجيهية المؤسسية ووافق عليها أوببا ووزارة الصحة
1-توليد المستحثة ياب الثديية الخلايا الجذعية مثل (يماسكس)
ملاحظة: يتم تحديد كافة وسائل الإعلام وحل التراكيب للقسم 1 في الجدول 1.
- عزل السكان الرئيسية الخلية الثديية
- إعداد تحت غطاء ثقافة خلية: المشارط المتاح، حل البروتين السكري المثبط، تفارق المتوسطة، حل الانحلالي، حل الفرز، الكولاجين طلاء الحل، Ca2 + شيلاتينغ الحل، غسل المتوسطة #1، أغسل المتوسطة #2، حل ديسباسي، الثديية في 2D الثقافة المتوسطة، والجليد الباردة حبس/س.
- لتجربة نموذجية، التضحية الفئران الإناث 10 (أما مؤتمر نزع السلاح-1 من سلالة C57BL/6)، 8-12 أسابيع القديمة بالتفكك عنق الرحم. تعقيم البطن مع وفرة الحل الإيثانول 70% قبل التشريح.
- تشريح الغدد الثديية مما شق على شكل Y على طول جلد البطن ويفصل بعناية في الغدد من الصفاق عن طريق سحب بلطف مع الملقط دومون. ضع تشريح الغدد في صحن الخلية غير لاصقة مع 10 مل الجليد الباردة حبس/PS (الغدد 20 لكل طبق)، مع التأكد من عدم تحمل أكثر من أي جزء من الجلد.
- تحت غطاء زراعة الأنسجة، يغسل كل غدة مرة في 10 مل من حبس جديدة/PS ووضعها في غير الخلية صحن لاصق فارغة (الغدد 20 لكل طبق). لا تستخدم لوحات زراعة الأنسجة، والخلايا وسوف تميل إلى التمسك بها مما تسبب في خسائر كبيرة للمواد.
- فرم ناعما في الغدد الثديية مع المشارط حتى يتم الحصول على مزيج متجانس من شظايا3 1 مم. استعادة الأنسجة مفروم من كل طبق في 10 مل من تفكك المتوسطة مع ماصة 25 مل مصلية تجنب انسداد ونقل التعليق في أنبوب مخروطي 50 مل بيبيتينج x على الأقل 5 تجزئة كتل الأنسجة.
ملاحظة: لهضم كفاءة وتنميق السليم للأنسجة في خطوة 1.1.5 أمر حاسم. - احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية مع الهز قوي مستمر. بعد ح 1، تحقق من هوموجيناتي وإطالة أمد الحضانة قبل 10 دقيقة إذا كتل لا تزال موجودة. تدور أسفل النسيج هضمها في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الأنسجة في 3 مل من محلول الانحلالي واحتضان 3 دقيقة على الجليد.
ملاحظة: انحلال الدم علاج بل قاسية، حتى توقيت صارمة أمر حاسم في هذه الخطوة. - تغسل الخلايا مع 10 مل من غسل المتوسطة #1 وتدور أسفل النسيج هضمها في ز 400 x لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الأنسجة في 10 مل أغسل المتوسطة رقم 2 ولوحة في 10 سم أطباق زرع الأنسجة. احتضان أطباق ح 1 في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة خلية.
ملاحظة: هذه الخطوة ستسمح إزالة غالبية الليفية، التي ينبغي أن تلتزم بالطبق الثقافة. - استرداد تعليق خلية من الأطباق وتصب في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. تدور في 400 غرام x لمدة 5 دقائق والقضاء على المادة طافية. أغسل بيليه مرتين في 10 مل Ca2 + خالب الحل من الغزل إلى أسفل في ز 400 x لمدة 5 دقائق في كل مرة. ريسوسبيند بيليه في 5 مل من 0.25% التربسين/يدتا واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل من محلول ديسباسي على رأس الحل التربسين وتكملة مع الدناز 1μg/mL. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً على الأقل 5 x عن طريق مل 1-تلميح تفصيل كتل الحمض النووي واحتضان لمدة 10 دقيقة على 37 درجة مئوية، وتهز كل دقيقة 3.
- إضافة 10 مل من غسل المتوسطة #2 والتصفية في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. تدور أسفل تعليق خلية في 400 غرام x لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية، مع التأكد من إزالة جميع السائل.
- تنقية الخلايا الظهارية الثديية بنظام مراقبة الأصول الميدانية
- إعداد مزيج الأجسام المضادة بإضافة 10 ميكروليتر لين (الماوس النسب جسم كوكتيل)، 12 ميكروليتر مكافحة--CD326 (الجيش الشعبي-كام)، إلى تركيز نهائي 30 نانوغرام/مل، مكافحة ميكروليتر 10-CD49f، إلى تركيز نهائي من 25 نانوغرام/ملليلتر، مكافحة ميكروليتر 10-CD61، إلى تركيز نهائي 10 نانوغرام/مل ، مكافحة ميكروليتر 2.5-CD29، إلى تركيز نهائي 2.5 نانوغرام/مل.
ملاحظة: من هذا 1.3 خطوة بخطوة، تعمل دائماً في الظلام، لتجنب تبيض من الأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي. لكل بيليه: - تبقى عدد قليل من الخلايا (بالغمس تلميح 100 ميكروليتر في بيليه) في أنبوب منفصل. ريسوسبيند الخلايا في 500 ميكروليتر من الفرز الحل في أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية والحفاظ على الجليد كالعينة غير مسمى لإجراءات نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- ريسوسبيند كل بيليه في 200 ميكروليتر من غسل المتوسطة #1 وإضافة 44.5 ميكروليتر من مزيج الأجسام المضادة، "الماصة؛" دقة واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام. تمييع تعليق خلية في 10 مل من غسل المتوسطة #1، وتدور إلى أسفل في 400 غرام x لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل من الفرز الحل والتصفية من خلال توبيند نظام مراقبة الأصول الميدانية كاب-مصفاة الشروع في نظام مراقبة الأصول الميدانية-الفصل بين سكان الخلية (كما هو الحال في الشكل 1B). قبل تنفيذ البروتوكول نظام مراقبة الأصول الميدانية متعددة الألوان، تأكد من تصحيح للتداعيات الممكنة لكل فلوروتشرومي إلى كل من الآخرين. للقيام بذلك، احتضان كل جسم fluorophore مترافق بشكل منفصل مع تعليق خلية وقياس قيم التداخل الطيفي لجميع فلوروفوريس وفي الكشف عن كافة، عبر عناصر التحكم في لون واحد، من أجل إنشاء مصفوفة تعويض.
ملاحظة: استخدمت في هذه التجربة، فارز مزودة بفوهة ميكرومترات 85. إعداد نموذجي من الفئران الإناث 10 سوف تسفر عن ما يقرب من 800,000 الخلايا دينار. المضي قدما للترشيح الثانوي إذا كان تشكيل كتل أثناء إجراء نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- إعداد مزيج الأجسام المضادة بإضافة 10 ميكروليتر لين (الماوس النسب جسم كوكتيل)، 12 ميكروليتر مكافحة--CD326 (الجيش الشعبي-كام)، إلى تركيز نهائي 30 نانوغرام/مل، مكافحة ميكروليتر 10-CD49f، إلى تركيز نهائي من 25 نانوغرام/ملليلتر، مكافحة ميكروليتر 10-CD61، إلى تركيز نهائي 10 نانوغرام/مل ، مكافحة ميكروليتر 2.5-CD29، إلى تركيز نهائي 2.5 نانوغرام/مل.
- زرع خلايا LD الثديية الرئيسية
- أثناء إجراء نظام مراقبة الأصول الميدانية معطف صفيحة جيدا زراعة الأنسجة متعددة مع الكولاجين أنا طلاء الحل. احتضان ح 1 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 في حاضنة ثقافة خلية. إزالة الحل الطلاء وتغسل بغسل المتوسطة #1 فقط قبل الطلاء.
- يغسل خلايا المستردة من نظام مراقبة الأصول الميدانية الداخلي مع 10 مل من محلول الغسيل #1 وتدور أسفل 400 غرام x لمدة 5 دقائق والقضاء على المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 2D الثديية الثقافة المتوسطة (500 ميليلتر في البئر) ولوحة الكولاجين معاملة. السماح للخلايا الجلوس في خلية ثقافة حاضنة ل 48 ساعة للسماح لمرفق الخلية الصحيحة ونشر.
ملاحظة: فرز نموذجية من الفئران الإناث 10، 6-8 آبار للوحة متعددة 24-جيدا جيدا سوف تسفر عن بكثافة خلية مثلى (كل 100000 خلايا في البئر).
- تحريض يماسكس (التي يسببها ياب الخلايا الجذعية الثديية)
ملاحظة: من هذه الخطوة، ينبغي إجراء جميع الإجراءات في ظل الظروف BSL-2.- تعد مستعمرة الثديية المتوسطة. طازجة إضافة مصفوفة الغشاء إلى المتوسط قبل البذر الخلية.
- لتحريض الخلايا الجذعية الثديية المستحثة ياب (يماسكس)، ترانسدوسي الخلايا LD الأولية من الإصابة لينتيفيرال بمزج حجم واحد من فوديلتاجو-رتا الفيروسية المادة طافية، وحجم المادة طافية فو-تيتو-ياب (أو طاز)، واحد مع مجلدين من المصل خالية الثديية 2D الثقافة المتوسطة 2 x تركيزات من المكملات الغذائية، في إجمالي حجم 500 مل. احتضان الخلايا مع سوبيرناتانتس لينتيفيرال ح 48. لإعداد لينتيفيرال نموذجي، يرجى الرجوع إلى بروتوكول الإنترنت22.
- بعد الإصابة، يغسل خلايا ملتصقة وتعامل مع مستنبت 2D الثديية وتستكمل مع 2 ميكروغرام/مل الدوكسي للحث على التعبير الجيني ياب (أو طاز) خارجية. تستخدم الخلايا المصابة مع فارغة، وناقلات وإذ تعرب عن اجفب أو YAPS94A، أو الخلايا المصابة مع ناقلات ياب (أو طاز) إيندوسيبلي، لكنه ترك دون الدوكسي كعناصر سلبية.
ملاحظة: الإصابة بنجاح يمكن التحقق من صحة ببكر قرت مع الإشعال محددة للتحوير ياب الإنسان ، كما هو موضح سابقا1. - بعد 7 أيام الاستقراء مع الدوكسي، فصل خلايا ملتصقة بالحضانة مع 0.05% التربسين/يدتا (150 ميكروليتر/جيد) لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية؛ وقف تريبسينيزيشن بتمييع 1:5 في غسل المتوسطة #2 (600 ميكروليتر/جيد) وحساب عدد الخلايا. ريسوسبيند الخلايا في الأجلين المتوسط ومستعمرة الثديية (1 مل لكل بئر)، تستكمل مع 2 ميكروغرام/مل الدوكسي والبذور في كثافة كلونوجينيك 1000 خلايا/بئر في لوحات مرفق معالجات 24-جيدا.
ملاحظة: تأكد من أن المتوسط مستعمرة الثديية الجليد الباردة وقت الغشاء مصفوفة وباﻹضافة إلى ذلك. مصفوفة الغشاء يجب دائماً المخزنة في-20 درجة مئوية عند وصولهم، وتحسنت ببطء في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها؛ بمجرد إذابة، فإنه يجب دائماً معالجة على الجليد، طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة. - مرة ياب-الإعراب عن الخلايا LD تبدأ تنتشر وتنمو كمستعمرات مثل الفريق في تعليق (يماسك المستعمرات) (14 يوما بعد البذر) والعد وعملية لمزيد من التحليل (الشكل 1).
ملاحظة: سوف تظل خلايا المراقبة السلبية (كما هو الحال في نقطة 1.4.3) كالخلايا المفردة. - تجديد الثقافة مع الطازجة "الثديية مستعمرة المتوسطة" كل ح 72 خلال الأيام ال 14 يماسك مستعمرة النمو؛ للقيام بهذا الأمر يعد قاسمة المتوسطة مستعمرة الثديية دون مصفوفة غشاء الطابق السفلي 5%، وتستكمل مع تركيز 10 x ملاحق وإضافة 01:10 الحجم الإجمالي لكل بئر (مثلاً 100 ميكروليتر في 1 مل متوسط الإجمالي)، لتجنب إضعاف المفرط تعليق المصفوفة.
- دون استزراع من يماسكس
- استرداد المستعمرات الأولية من المتوسطة مستعمرة الثديية، ثم فصل و reseed.
ملاحظة: المستعمرات يماسك المستمدة من الخلايا LD برمجتها ياب اكتساب القدرات الذاتي تجديد ويمكن بنجاح دون مثقف دون زيادة الدوكسي الإدارة (أي، مستقل عن التعبير عن المحورة وراثيا ياب/طاز). - إعداد، تحت غطاء ثقافة خلية، مستعمرة الثديية المتوسطة كما هو الحال في الخطوة 1.4.1 والمتوسطة أورجانويد الثديية.
- جمع كل عينة واحتضان في حجم الزائدة (10:1) الجليد الباردة حبس ح 1 على الجليد، بغية جعل المصفوفة الغشاء. أغسل المستعمرات 3 x من سينتريفوجينج في 180 x ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في الجليد الباردة حبس. احتضان المستعمرات في 0.05% التربسين/يدتا لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية للحصول على تعليق خلية مفردة. ماصة المستعمرات صعودا وهبوطاً x 10 مع تلميح p1000 لضمان الانفصال الكامل على مستوى الخلية الواحدة.
- خلايا العد و reseed في مستعمرة الثديية المتوسطة (1 مل لكل بئر) دون الدوكسي في كثافة كلونوجينيك 1000 خلايا/بئر في لوحات مرفق معالجات 24-جيدا. كرر هذا باساجينج الداخلي كل 10-14 يوما لتقييم الذاتي تجديد.
- قبل سن الثالثة، ممر المستعمرات يماسك في ظروف ثقافة أورجانويد، لتعزيز توسيع يماسك والسماح لتشكيل ميني-الغدد، أن تنظيم ذاتي في ظهارة بيلاييريد تذكر عن كثب للغدة الثديية في فيفو منظمة النسيجي.
- استرداد المستعمرات من المتوسطة مستعمرة الثديية كما في الخطوة 1.5.3 إلى 1.5.4. ريسوسبيند المستعمرات في عامل النمو 100 ٪ تخفيض المصفوفة الغشاء، النظر إلى ريبلاتي كحد أقصى مستعمرات 20-25 لكل بئر من صفيحة مرفق معالجات 24-جيدا في 150 ميليلتر من المصفوفة.
- احتضان اللوحات في خلية ثقافة حاضنة لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية واسمحوا المصفوفة الغشاء يصلب وثم تراكب المواد الهلامية مع 500 ميكروليتر من المتوسط أورجانويد الثديية.
- بعد أيام قليلة تحقق لتكوين مستعمرات للنموذج الناشئين أورجانويدس (الشكل 1E).
- بعد 10-14 يوما أو مرور أو عملية أورجانويدس لمزيد من التحليل.
- ممر أورجانويدس الثقافات، واسترداد أورجانويدس بجمع كل عينة وتفرخ في الحجم الزائد (10:1) للجليد الباردة حبس ح 1 على الجليد، بغية جعل المصفوفة الغشاء. أغسل أورجانويدس 3 x التي تدور إلى أسفل في 180 x ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في الجليد الباردة حبس.
- احتضان أورجانويدس في 0.05% التربسين/يدتا لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية للحصول على تعليق خلية مفردة. أورجانويدس ماصة صعودا وهبوطاً x 10 مع تلميح p1000 لضمان الانفصال الكامل على مستوى الخلية الواحدة.
- ريسيد كتعليق خلية مفردة في قطره من عامل النمو 100 ٪ تخفيض الغشاء مصفوفة (ميكروليتر 150 لكل بئر من صفيحة مرفق معالجات 24-جيدا). واسمحوا المصفوفة الغشاء تشكل جل التي تفرخ 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة خلية وتراكب المواد الهلامية مع 500 ميكروليتر من المتوسط أورجانويد الثديية.
ملاحظة: يمكن cryopreserved يماسك أورجانويدس التي تتعافى من الثقافة مصفوفة الغشاء 100% كما هو الحال في الخطوة 1.5.13، تجنب تريبسينيزيشن. تخزين في المتوسط أورجانويد الثديية وتستكمل مع [دمس] 10%. - تجمد بسرعة أورجانويدس يماسك في-80 درجة مئوية، وثم الاحتفاظ بالنيتروجين السائل.
- استرداد المستعمرات الأولية من المتوسطة مستعمرة الثديية، ثم فصل و reseed.
2-جيل يدوكتس
ملاحظة: يتم تحديد كافة وسائل الإعلام وحل التراكيب للقسم 2 في الجدول 2.
- عزل أسيني البنكرياس الأولية
- ضع ملقط تشريح ومقص في 70% EtOH وإعداد إطار خلية ثقافة هود acinar ثقافة وسيلة، 15 مل لكل الماوس؛ أسينار الانتعاش المتوسطة، 60 مل لكل الماوس; برنامج تلفزيوني/PS؛ كولاجيناز الأسهم الحل الأول؛ كولاجيناز أنا الحل أ، 15 مل لكل الماوس; تحييد ذيل الجرذ الكولاجين أنا الحل. تحييد الكولاجين ذيل الجرذ الأول للأس الهيدروجيني = 7، عن طريق ضبط أولاً مع هيدروكسيد الصوديوم N 0.1 المخزن المؤقت حمض الخليك في الذي يذوب في الكولاجين، ومن ثم مع 10N HCl. ديلوتى إلى 2.5 ملغ/مل في الحفاظ على برنامج تلفزيوني/س. "الكولاجين ذيل فأر" أنا وجميع الكواشف على الجليد لتحييد ذلك. التضحية من 6 إلى 9 أسابيع من العمر الفئران للنمط الوراثي السليم.
- ضع كل الماوس على ظهرها، وتغسل البطن مع محلول إيثانول 70%. إجراء شق طولي على طول جدار البطن. تحديد موقع وتشريح البنكرياس (باستخدام الطحال كدليل) ووضعه في طبق لاصقة غير خلية 10 سم في 10 مل الجليد الباردة "نقل" برنامج تلفزيوني/س. الأطباق مباشرة تحت غطاء ثقافة خلية. من هذه الخطوة فصاعدا، تعمل دائماً تحت غطاء ثقافة خلية.
- نقل كل البنكرياس في خلية غير جديدة صحن لاصق سابقا مليئة ب 7 مل كولاجيناز أنا الحل أ
- بسرعة فرم كل البنكرياس مع زوج من المشارط المتاح، للحصول على تعليق أنسجة متجانسة تقريبا 1 ملم3 أجزاء.
ملاحظة: من المهم أن نلاحظ أن هذا الإجراء ينبغي أن لا يزيد عن 2 دقيقة لبقاء الخلية أمثل. - احتضان الطبق الهضم كولاجيناز عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 في خلية ثقافة حاضنة ل 10 دقيقة، تهز كل 3 دقيقة لضمان هضم أنسجة متجانسة.
- استعادة الأنسجة هضمها في أنبوب 50 مل مخروطية (واحد لكل البنكرياس)، يغسل الطبق مع 10 مل من "أسينار غسل المتوسطة" ووضعه في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل نفسه، بيبيتينج هضم الأنسجة صعودا وهبوطاً x ليس أكثر من 3.
- تدور أسفل النسيج هضمها لمدة 5 دقائق في 100 غرام x عند 18 درجة مئوية وإزالة المادة طافية.
ملاحظة: تدور أسفل الخلايا عند 18 درجة مئوية إلى انخفاض نشاط كولاجيناز أثناء هذه الخطوة. - ريسوسبيند الأنسجة بيليه في 7 مل كولاجيناز حل أ وصب هذا الحل في طبق لاصقة غير خلية 10 سم جديدة.
- احتضان الطبق لجولة ثانية من الهضم كولاجيناز في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة كما هو الحال في الخطوة 2.1.5، تهز كل 3 دقيقة لضمان هضم أنسجة متجانسة. وفي الوقت نفسه، تعد أنبوب مخروطي نظيف 50 مل واحد لكل البنكرياس وتصدرت مع مصفاة خلية 100 ميكرومتر.
- استعادة الأنسجة هضمها وتمر من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر ماسيراتينج الأنسجة مع المكبس المحاقن معقمة 10 مل (تأكد من بعناية اضغط لأسفل الأنسجة، وتجنب قوات القص عرضية على سطح مصفاة). أغسل الطبق مع 10 مل من الغسيل أسينار المتوسطة، ويمر هذا 10 مل نفس 100 ميكرومتر خلية مصفاة.
- تدور أسفل النسيج هضمها لمدة 5 دقائق في 100 غرام x عند 18 درجة مئوية وإزالة المادة طافية.
- استرداد بيليه الأنسجة مع 10 مل متوسطة أسينار المياه والصرف الصحي. نقل الحل خلية في أنبوب 50 مل مخروطية الفعل يتضمن إضافية 10 مل من المتوسطة أغسل أسينار جديدة، وتجنب بيبيتينج المفرط لاستثارة لبيليه.
- تدور أسفل النسيج هضمها لمدة 5 دقائق في 100 غرام x عند 18 درجة مئوية وإزالة المادة طافية.
- عناية ريسوسبيند الأنسجة هضمها في 6 مل من الانتعاش acinar المتوسطة وتوزيعها في الآبار 2 متعدد 6-جيدا جيدا زراعة الأنسجة بليت، 3 مل. تحت ستيريوميكروسكوبي عناية تقييم نوعية عزل أسينار، التي تظهر كتعليق متجانسة لمجموعات أسينار، مع نسبة ضئيلة من الخلايا المفردة (انظر الشكل 2)؛ إزالة أي أنسجة كبيرة كتل في نهاية المطاف تقديم (عادة مرئية بالعين المجردة أيضا)، بيبيتينج لهم الخروج من الحل.
- بذر من الابتدائي acini البنكرياس
- احتضان مجموعات acinar هضمها عند 37 درجة مئوية في خلية ثقافة حاضنة ح 2، للسماح باسترداد الخلية.
- أثناء معطف استرداد خلية متعددة 48-بئر الآبار مع 100 ميكروليتر الكولاجين ذيل معادلتها الجرذ أنا واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية في خلية ثقافة حاضنة للسماح بوسادة المائية بشكل.
- بعد جمع ح 2 خلية الإنعاش، تعليق خلية acinar في أنبوب مخروطي، معين باستمرار لمدة 5 دقائق في 100 غرام x عند 18 درجة مئوية وإزالة المادة طافية.
- ريسوسبيند أسيني في حجم مناسب acinar الثقافة المتوسطة (ميكروليتر 150 لكل بئر من لوحة 48 زراعة الأنسجة جيدا). بذور كل فصل البنكرياس في آبار 16 الحصول كثافة مثلى (100-120 acinar مجموعات/جيد).
- تمييع هذا التعليق أسينار مع حجم متساوية من الفئران معادلتها الذيل الكولاجين أنا الحل، حفظ أنابيب على الجليد. المزيج بعناية وبسرعة البذور تعليق خلية فوق وسادة الكولاجين الموصوفة في 2.2.2 (300 ميكروليتر لكل بئر من صفيحة جيدا زراعة الأنسجة المتعددة جيدا 48).
- احتضان ح 1 في 37 درجة مئوية في خلية ثقافة حاضنة للسماح المائية بشكل.
- تحريض البنكرياس أورجانويدس
- تراكب الهلاميات المائية الكولاجين مع 500 ميكروليتر من المتوسطة الثقافة Acinar تكملة مع 2 ميكروغرام/مل الدوكسي ياب تعتمد على تحريض البنكرياس أورجانويدس من R26-rtTAM2؛ ياب تيتوS127A الفئران؛ عناصر سلبية يقدمها wt الخلايا المستزرعة في نفس الظروف أو R26-rtTAM2؛ ياب تيتوS127A الخلايا المستزرعة في غياب الدوكسيسيكلين.
- الثقافة أسينار الخلايا في المتوسط الثقافة Acinar تستكمل مع 2 ميكروغرام/مل الدوكسيسيكلين لمدة 5 إلى 7 أيام تحديث الثقافة المتوسطة (300 ميكروليتر/جيد) كل 48 ساعة وبعد تشكيل أورجانويد بالتغييرات الشكلية نحو كيسه تشكيل الهياكل الشبيهة بالاقنية ( الشكل 2). حالما يتم تشكيل أورجانويدس، يمكن باساجيد في ظروف الثقافة أورجانويد البنكرياس خلايا أو حصادها لمزيد من التحليلات (مثلاً: استخراج الحمض النووي الريبي، الفلورة).
- دون استزراع من أورجانويدس البنكرياس
- لتقييم قدرتها على التجديد الذاتي، كلونالي المرور التي يسببها ياب البنكرياس أورجانويدس (يدوكتس) في الغشاء ثلاثي الأبعاد مصفوفة الهلاميات المائية (شروط الثقافة أورجانويد البنكرياس) مستقل عن العرض ياب/طاز خارجية (أي. ، مستقلة عن الإدارة الدوكسي).
- إعداد التربسين 0,05%/EDTA؛ مصفوفة الغشاء انخفاض عامل النمو 100%؛ البنكرياس والمتوسطة أورجانويد كولاجيناز أنا الحل باء
- إعداد 15 مل مخروطية أنبوب مع 4 مل كولاجيناز حل ب لكل بئر يكون باساجيد.
- تجاهل الثقافة المتوسطة، بعناية استخراج الهلاميات المائية من الآبار بتطلع لطيف وتحويلها إلى أنابيب مخروطية الشكل.
- احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، مع الهز قوية مستمرة للسماح الهضم الكامل مصفوفة الكولاجين (التحقق من كل 10 دقيقة حتى solubilized في المائية هو تماما). وتدور أسفل الخلايا المستردة في 750 س ز 2 دقيقة لإزالة المادة طافية.
- احتضان خلايا المستردة في 1 مل التربسين 0,05%/EDTA لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية للحصول على تعليق خلية مفردة. تمييع التربسين مع مل 9 من برنامج تلفزيوني 1 x، تدور إلى أسفل في 750 غ س ل 2 دقيقة وإزالة المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في مصفوفة الغشاء انخفاض عامل النمو الباردة الجليد والبذور في لوحات مرفق منخفضة للغاية (عادة قطره 150 ميكروليتر في بئر واحدة من صفيحة 24-جيدا).
- اسمحوا المائية مصفوفة الغشاء يصلب التي تفرخ اللوحات في حاضنة ثقافة خلية 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية وثم تراكب مع البنكرياس أورجانويد المتوسطة (500 ميكروليتر لكل بئر). يدوكتس سوف تنمو كيسه مثل أورجانويدس في 7-10 أيام (الشكل 2D).
- لزيادة باساجينج أورجانويدس يمكن إزالتها من مصفوفة الغشاء بالحضانة في برنامج تلفزيوني الباردة الجليد 1 x ل 30 دقيقة، تليها بالغسيل 3 مرات تدور أسفل ز x 180 لمدة 5 دقائق واستثارة في برنامج تلفزيوني الباردة الجليد 1 x لتجنب ترحيل المصفوفة. أورجانويدس ثم فصل مع التربسين 0.05% لمدة 10 دقيقة للحصول على تعليق خلايا مفردة وريسيديد في مصفوفة جديدة الغشاء وثم مضافين مع البنكرياس أورجانويد المتوسطة (كما هو الحال في 2.4.7-2.4.8).
- يمكن cryopreserved أورجانويدس يدوكت في النتروجين السائل التي تتعافى من الثقافة مصفوفة الغشاء 100% كما هو الحال في الخطوة 2.4.9، تجنب تريبسينيزيشن، وتخزينها في البنكرياس أورجانويد المتوسطة وتستكمل مع [دمس] 10%.
- أورجانويدس يدوكت بسرعة المجمدة في-80 درجة مئوية وثم الاحتفاظ بالنيتروجين السائل.
Representative Results
جيل يماسكس
لمحة عامة عن استراتيجية تجريبية لإعادة برمجة الخلايا LD الثديية الرئيسية حسب تعبير عابر ياب يرد في الشكل 1 ألف. يتم تنقية الابتدائي الخلايا الظهارية الثديية LD خلية تنشيط الفلورسنت فرز13. يمثل الشكل 1 باء إجراء فرز نموذجية للحصول على ثلاثة من الفئات السكانية الفرعية متميزة: الخلايا القاعدية (ابكاممنخفضCD49fعاليةCD61–)، خلايا السلف لومينال (ليرة لبنانية) (ابكامعاليةCD49fمنخفضCD61+ ) والخلايا LD (ابكامعاليةCD49fمنخفضCD61–). حذراً النابضة من الجمهرات الفرعية الثلاثة ضروري لعزل إعداد نقية من الخلايا LD، التي هي تماما تختلف وتماماً النمو القبض عند المصنف في مستعمرة الغدة الثديية تشكيل الشروط (انظر الشكل 1، غادر الفريق). على العكس من ذلك، عندما حملت على التعبير عن ياب خارجية، LD الخلايا تبدأ في التكاثر لتشكل مستعمرات الظهارية كثيفة يمكن التعرف عليها بسهولة في غشاء الطابق السفلي 5% مصفوفة تعليق الثقافات (الشكل 1). ويشهد كفاءة إعادة برمجة، حوالي 3% لنموذجي التجربة، يمكن أن يكون سجل إحصاء عدد المستعمرات على العدد الخلايا المفردة التي تبذر أصلاً في الغشاء مصفوفة تعليق الثقافات (الشكل 1). أعيدت برمجتها الخلايا لومينال (يماسكس) ثم يمكن أن يكون مرور 100% الغشاء مصفوفة أورجانويد الثقافة الظروف (انظر المخطط في الشكل 1A)، التنظيم الذاتي في هياكل معقدة مثل أورجانويد الذي وضع حول لومن متعددة و عرض القدرة الذاتي تجديد ملحوظا حتى في غياب الدوكسي (أي في غياب المعدلة وراثيا ياب التعبير) (الشكل 1E). الأشيع، المستمدة من يماسك أورجانويدس عرض طبقة القاعدية (K14 الإيجابية)، تواجه المصفوفة الغشاء أعيد تشكيل إدارة المحتوى في المؤسسة وطبقة لومينال (K8 الإيجابية)، التي تواجه في تجاويف مثل التجويف داخل أورجانويد (الشكل 1F). هذا الهيكل لا يمكن تمييزها عن أورجانويدس التي شكلتها ماسكس الأصلي (الشكل 1F).
جيل يدوكتس
لمحة عامة عن استراتيجية تجريبية لإعادة برمجة acini البنكرياس الرئيسية حسب تعبير عابر ياب يرد في الشكل 2 ألف. وفيما يلي المجموعات acinar كامل معزولة عن الجزء الأكبر أنسجة البنكرياس بمزيج من الانفصال معتدل وحجم الاستبعاد عن طريق الترشيح. ويرد إعداد نموذجي في الشكل 2. بعد عزلة، يجب أن تظهر المجموعات خلية acinar كتعليق لوحدات acinar إفرازات من حجم متجانسة، مع أي تلوث من جزيرات لانغرهانس الغدد الصماء أو أجزاء من شجرة الأقنية البنكرياس وتفكك الحد الأدنى للخلايا المفردة. التلوث من الجزيرات الغدد الصماء أو أجزاء الأقنية دليل على نقص الترشيح الانتقائي (الخطوة 2.1.10)، ربما بسبب معالجة قاسية؛ قد يكون الانفصال غير المرغوب فيها من مجموعات أسينار إلى الخلايا المفردة بسبب المعاملة كولاجيناز المفرطة أو unbuffered نشاط الإنزيمات proteolytic الصادرة في الأنسجة، والتي يمكن كبحها بمعاملة سبتي إضافية.
تجربة إعادة برمجة acinar نموذجية ويرد في الشكل 2؛ في غضون 5-7 أيام للثقافة في الكولاجين 3D--أنا أساس المائية حضور الدوكسي، البنكرياس acini المستمدة من الفئران R26-rtTAM2/تيتو-يابS127A سهولة تتحول إلى مجموعات مثل لاصق (أن نحن المسماة يدوكتس)، يتألف من قبل رقيقة أحادي الطبقة خلايا الظهارية التي تتكاثر حولها تجويف مركزي الآخذة في توسع. ويمكن قياس كفاءة إعادة برمجة، وهو حوالي 70 في المائة لتجربة نموذجية، بسهولة بتسجيله عدد الكتل مثل لاصق على العدد الإجمالي للمصنف acini (الشكل 2D). خلايا المراقبة السلبية، هو R26-rtTAM2/+ الخلايا أو الخلايا R26-rtTAM2/تيتو-يابS127A اليسار دون الدوكسي، تظل دائماً كمجموعات acinar بعد الانقسامية في هذه الظروف الثقافة، كما أفيد سابقا1 ،،من1415. يمكن ثم باساجيد يدوكتس أعيدت برمجتها على مستوى الخلية الواحدة في ظروف الثقافة المستندة إلى ماتريجيل أورجانويد16 (انظر المخطط في الشكل 2 ألف)، عرض قدرة الذاتي تجديد رائعة حتى في غياب الدوكسي (أي في غياب المعدلة وراثيا ياب التعبير) (الشكل 2E).
رقم 1: خلايا عزلة LD الثديية الأولية وتحريض الثديية الخلايا الجذعية. (أ) اعتمدت التمثيل التخطيطي من الإجراءات التجريبية لإعادة برمجة خلايا LD الثديية أولية. (ب) ممثل نظام مراقبة الأصول الميدانية-المؤامرات التي توضح إجراء فرز نموذجية لتنقية الخلايا LD. ط) هي بوابات الخلايا ينتابها وفقا مبعثر الأمامية والجانبية للخلايا الحية (P1 الأزرق)؛ ثانيا) ثم هو السكان P1 بوابات كذلك طبقاً لصورتها لين: يتدنى الخلايا النسب السلبية (P2؛ غراي) محدداً، باستثناء النسب-إيجابية الخلايا المكونة للدم؛ الثالث) ثم يتم فصل السكان P2 إلى ابكامعالية (ف-3؛ والأصفر + الأخضر) وابكاممنخفضة (P6؛ الأحمر) الفئات السكانية الفرعية؛ رابعا) P3 و P6 هي ثم زيادة بوابات وفقا للتشكيل الجانبي CD61/CD49f إلى الفئات السكانية الفرعية الثلاثة: ابكاممنخفضCD49fعاليةCD61– الخلايا القاعدية (P7؛ الأحمر)، ابكامعاليةCD49fمنخفضCD61+ ليرة لبنانية الخلايا (P8؛ أصفر) وابكامعاليةCD49fمنخفضCD61– LD الخلايا (P9؛ الأخضر). (ج) صور توضيحية من قدرة الخلايا LD، المصابين بنيات المشار إليها، تشكل مستعمرات الثديية بعد البذر في مستعمرة الثديية المتوسطة 15 يوما. الإعراب عن ياب تتحول الخلايا إلى تشكيل مستعمرة الخلايا، بينما خلايا المراقبة السلبية (المصابة اجفب) تبقى فقط كالقبض على نمو الخلايا المفردة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (د) القياس الكمي للمستعمرة تشكل قدرة الخلايا المشار إليها، كما هو الحال في (ج). يعني + المرسوم العالي وتعرض البيانات وهي الممثل لخمس تجارب مستقلة، كل منها ستة replicates التقنية. (ه) صورة تمثيلية برمجتها ياب الثديية الخلايا الجذعية مثل الخلايا (يماسكس) بعد 12 يوما في ظروف الثقافة أورجانويد في مصفوفة المائية الغشاء 100% ثلاثية الأبعاد جديدة في الغياب الدوكسي. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (و) الصور الفلورة الممثل لعلامة القاعدية K14 (الأخضر) وعلامة لومينال K8 (الأحمر) من أورجانويدس المستمدة من الخلايا المشار إليها، وبعد 12 يوما في ظروف الثقافة أورجانويد. شريط المقياس = 10 ميكرومترات. ويرد هذا الرقم من بانسيرا et al., 20161. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : عزل خلايا أولية acinar البنكرياس وتحريض البنكرياس موروث. (أ) اعتمدت التمثيل التخطيطي من الإجراءات التجريبية لإعادة برمجة خلايا acinar إفرازات البنكرياس أولية. (ب) صورة الممثل الرئيسي acini البنكرياس فقط بعد إجراء العزل (الخطوة 2.1.14). يجب أن تظهر إعداد acinar تعليق متجانسة لمجموعات أسينار، مع وجود الحد الأدنى من الخلايا المفردة. شريط المقياس = 400 ميكرومتر. (ج) صور الممثل من أسيني البنكرياس الأساسية المستمدة من R26-rtTAM2 (لوحات العلوي)أو R26-rtTAM2؛ ياب تيتوS127A (أقل أفرقة) الفئران ومثقف في الكولاجين ثلاثي الأبعاد وأنا-على أساس المائية لمدة 5 أيام مع أو بدون الدوكسيسيكلين (دوز)، كما هو مبين. فقط تحويل معربا عن ياب acini الأولية للخلايا التي تنمو كمثل كيسه أورجانويد بعد إضافة الدوكسي. تغيير حجم أشرطة = 70 ميكرومتر. (د) القياس الكمي لقدرة البنكرياس أسيني على شكل أورجانويدس الأقنية عند overexpression ياب المعدلة وراثيا كما هو الحال في (ج). يعني + المرسوم العالي وتعرض البيانات وهي الممثل لخمس تجارب مستقلة، يؤديها مع أربعة replicates التقنية. (ه) صورة تمثيلية الأقنية مثل ريبروجراميد ياب الخلايا (يدوكتس) بعد ثلاثة ممرات في مصفوفة المائية الغشاء 100% ثلاثية الأبعاد جديدة في غياب الدوكسي. شريط المقياس = 130 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| عزل الخلايا الثديية الرئيسية | |
| Ca2 + خالب الحل | مخزن في 4 درجات مئوية |
| يدتا | 0.02% w/V |
| برنامج تلفزيوني | |
| الكولاجين أنا طلاء الحل | |
| حمض الخليك 0.02N، درجة الحموضة 3,23 | |
| فأر "الذيل الكولاجين" (الطلاء) | 01:50 |
| الحل ديسباسي | مخزن في 4 درجات مئوية |
| ديسباسي | 5 ملغ/مل |
| برنامج تلفزيوني | |
| المتوسطة الانفصال | |
| DMEM:F12 | |
| حل مخزون البروتين السكري المثبط | 400 U/mL |
| القلم/بكتيريا | س 1 |
| حل الأسهم كولاجيناز أنا | 600 U/mL |
| الحل الانحلالي | مخزن في 4 درجات مئوية |
| NH4Cl الحل | أجزاء 1 |
| تريسباسي 20.6 غرام/لتر | 9 أجزاء |
| ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.2 | |
| هبس/PS | مخزن في 4 درجات مئوية |
| حبس | |
| القلم/بكتيريا | 2 x |
| حل مخزون البروتين السكري المثبط | فلتر 0.2 ميكرون، مخزن في 4 درجات مئوية |
| البروتين السكري المثبط من الخصيتين البقري (مسحوق) | 2,000 U/mL |
| فوسفات الصوديوم العازلة 1 م pH7.3 | |
| NH4Cl الحل | تخزين في السفير ت. |
| ح2س | |
| NH4Cl | 7.1 غرام/لتر |
| ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.65 | |
| الفرز الحل | فلتر 0.2 ميكرون، مخزن في 4 درجات مئوية |
| جيش صرب البوسنة | 0.1% |
| يدتا | 1 مم |
| حبيس الأس الهيدروجيني 7 | 25 مم |
| برنامج تلفزيوني | |
| أغسل المتوسطة #1 | |
| DMEM/F12 | |
| القلم/بكتيريا | س 1 |
| أغسل المتوسطة #2 | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 5% |
| القلم/بكتيريا | س 1 |
| الثديية في 2D الثقافة المتوسطة | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 2% |
| الهيبارين | 4 مغ/مل |
| لام-الجلوتامين | س 1 |
| مورين بفجف | 10 نانوغرام/مل |
| لو مورين | 10 نانوغرام/مل |
| القلم/بكتيريا | س 1 |
| التعريفي وباساجينج من يماسكس | |
| المتوسطة مستعمرة الثديية | |
| DMEM:F12 | |
| FBS | 5% |
| الهيبارين | 4 ميكروغرام/مل |
| لام-الجلوتامين | س 1 |
| ماتريجيل (إضافة فورا قبل البذر) | 5% |
| مورين بفجف | 20 نانوغرام/مليلتر |
| لو مورين | 10 نانوغرام/مل |
| القلم/بكتيريا | س 1 |
| الثديية أورجانويد المتوسطة | |
| DMEM:F12 متقدمة | |
| B27 | س 1 |
| جلوتاماكس | س 1 |
| الهيبارين | 4 ميكروغرام/مل |
| حبيس | س 1 |
| رأس الإنسان | 100 نانوغرام/مليلتر |
| مورين بيجف | 20 نانوغرام/مليلتر |
| لو مورين | 50 نانوغرام/مليلتر |
| R-سبوندين 1 | 1 ميكروغرام/مل |
الجدول 1: جيل يماسكس- تكوين كافة وسائل الإعلام المختلفة في الثقافة والحلول المطلوبة لعزل خلايا LD الثديية أولية وتحريض يماسكس (القسم 1).
| عزل أسيني البنكرياس الأولية | |
| أسينار الثقافة المتوسطة | |
| بب | 50 ميكروغرام/مل |
| جيش صرب البوسنة | 0.1% |
| الديكساميتازون | 1 ميكروغرام/مل |
| FBS | 0.1% |
| ه-X | س 1 |
| القلم/بكتيريا | س 1 |
| سبتي | 0.2 مغ/مل |
| المتوسطة في وايموث | |
| أغسل أسينار المتوسطة | |
| جيش صرب البوسنة | 0.1% |
| القلم/بكتيريا | س 1 |
| ربمي المتوسطة | |
| سبتي | 0.2 مغ/مل |
| أسينار الانتعاش المتوسطة | |
| أسينار الثقافة المتوسطة | |
| FBS | 30% |
| كولاجيناز أنا الحل A | |
| أغسل أسينار المتوسطة | |
| حل الأسهم كولاجيناز أنا | 360 يو/مليلتر |
| برنامج تلفزيوني/PS | مخزن في 4 درجات مئوية |
| برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) | |
| القلم/بكتيريا | س 1 |
| حل الأسهم كولاجيناز أنا | مخزن في-20 درجة مئوية |
| كولاجيناز، اكتب أنا (مسحوق) | 6,000 U/mL |
| برنامج تلفزيوني | |
| باساجينج من أورجانويدس البنكرياس | |
| كولاجيناز أنا حل ب | |
| برنامج تلفزيوني 1 x | |
| حل الأسهم كولاجيناز أنا | 240 U/mL |
| البنكرياس أورجانويد المتوسطة | |
| متقدمة DMEM/F12 | |
| B27 | س 1 |
| جاسترين | 10 نانومتر |
| FGF10 البشرية | 100 نانوغرام/مليلتر |
| رأس الإنسان | 100 نانوغرام/مليلتر |
| لو مورين | 50 نانوغرام/مليلتر |
| ن-أسيتيل | 1.25 مم |
| نيكوتيناميد | 10 ملم |
| القلم/بكتيريا | س 1 |
| R-سبوندين 1 | 1 ملغ/مل |
| سبتي | 0.2 مغ/مل |
الجدول 2: جيل يدوكتس- تكوين كافة وسائل الإعلام المختلفة في الثقافة والحلول المطلوبة لعزل الخلايا أسينار الأولية والتعريفي وباساجينج من يدوكتس (القسم 2).
Discussion
هنا نقدم البروتوكولات لإعادة برمجة السابقين فيفو الميؤوس من شفائهم يميز الخلايا الظهارية من أنسجة مختلفة في الخلايا السلف الخاصة بالانسجة المناظرة (أو يسكس) بتعبير عابر ياب، كما ذكرت سابقا1. نحن مفصلة إجراءات اثنين: واحد مما يتيح إعادة برمجة خلايا تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية عن طريق ناقلات لينتيفيرال وثانية واحدة أن يتجنب العدوى الفيروسية ويستفيد من المعدلة وراثيا ياب التعبير. ويعرض كل بروتوكول استراتيجية فعالة لعزل والثقافة الأولية الخلايا المتمايزة ووضع استراتيجية لقوة خارجية ياب التعبير الجيني في الخلايا المتمايزة، وتوليد حيثياته الجسمانية الخاصة بالانسجة القابلة للتوسيع الخلايا الجذعية (انظر مخططات في الأرقام 1A و 2A).
أظهرنا أن استراتيجيات العزلة هنا عرض فعال عزل سكان نقية من الخلايا المتمايزة، كما يتضح من حقيقة أن نكشف ابدأ أي ثمرة من عينات المراقبة السلبية (الأرقام 1 و 2 (ج)).
ناقلات لينتيفيرال المستخدمة في هذه الدراسة لإعادة برمجة الخلايا LD الثديية الرئيسية هي الدوكسيسيكلين إيندوسيبلي، توفر إمكانية رقابة صارمة من التعبير التحوير؛ وهذا ما يسمح لتشغيل وإيقاف ياب خارجية سوف التعبير. ينبغي إيلاء اهتمام خاص في تجنب استخدام عيار الفيروسية المفرطة، كهذه يمكن أن تكون ضارة من حيث إعادة برمجة الكفاءة. في حالة الخلايا acinar الأولية، تحولنا إلى اتباع نهج محوره وراثيا تماما للحصول على ياب تعتمد على إعادة برمجة مع الحد الأدنى من التلاعب. هذه الاستراتيجية الأخيرة أيضا مناسبة بوجه خاص للابتدائي acini البنكرياس، كما مجموعات acinar معزولة نادراً ما قابلة للإصابة لينتيفيرال وهشة للغاية. الاستراتيجية المعدلة وراثيا المستخدمة توفر نفس ميزة ناقلات الدوكسي تعتمد على لينتيفيرال لمراقبة مشددة من التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، يتحمل الاستراتيجية المعدلة وراثيا استغلالها مع الابتدائية acini البنكرياس ميزة إضافية كفاءة إعادة برمجة أعلى كثيرا مقارنة الفيروسية الناجمة عن إعادة برمجة الخلايا LD الثديية. بعد اللدونة الجوهرية المختلفة المرتبطة بالخلايا المشتقة من أنسجة مختلفة، معدل أعلى من إعادة برمجة البنكرياس قد تستمد من كفاءة أعلى تعبير المقترن بالتعبير ياب موحدة ومستقلة في جميع الخلايا اكسبلانتيد. جدير بالذكر أن أثبتنا أن ياب خارجية لم يعد المطلوب بعد جيل يسكس (مستعمرات يماسك ويدوكتس)، دون التأثير على قدرتها على التجديد الذاتي. هذا سبب يسكس تنشيط الذاتية ياب/طاز واستخدامها لأغراض التجديد الذاتي عند إيقاف ياب خارجية1.
علينا التحقق من صحة الفكرة القائلة بأن يسكس الواقع الخروج من الخلايا المتمايزة بالسيطرة على الخلية الأصلية لتجاربنا إعادة برمجة عن طريق عمليات التحقق من صحة النسب-تتبع الوراثية1.
توصيف واسعةمن يسكس يبين أن ياب الناجمة عن إعادة برمجة يولد المنبوذة طبيعية جسدية1 كما) على المستوى ترانسكريبتوميك، عرض يسكس التداخل ضخمة مع الطوائف المنبوذة الأصلية؛ ثانيا) يسكس عرض التمايز المحتملة ويمكن أن تولد من ذرية مولتيلينيجي تقتصر دائماً على هوية على أنسجة المنشأ؛ ثالثا) يسكس غير متحولة وغير الورمية عند زرعها في الجسم الحي.
هنا يصف لنا أيضا إجراءات للحفاظ على وتوسيع في الثقافة يماسكس ويدوكتس أورجانويدس جزءا لا يتجزأ من الهلاميات المائية مصفوفة الغشاء 100%. هذه الظروف تسمح للتنظيم الذاتي من يسكس إلى أورجانويدس ثلاثي الأبعاد التي تكفل الحفاظ على خصائص ستيمنيس طويلة الأجل في الثقافة، تمكن من توسيع نطاق هذه تنبع من السكان المعرضين للإرادة لتحليلات المتلقين للمعلومات والتطبيقات. لأسباب غير معروفة، ونحن فشلوا في الحصول على يماسك أورجانويدس بوضع إصابة الخلايا LD مباشرة في ظروف الثقافة أورجانويد 7 أيام بعد العلاج الدوكسي في لوحة بلاستيكية زراعة الأنسجة؛ وبعبارة أخرى، خطوة متوسطة النمو في ظروف مستعمرة الثديية ضروري. في أيدينا، تتطلب ماسكس الأصلية حتى مستعمرة الثديية الشروط قبل باساجينج في الثقافة أورجانويد. وعلاوة على ذلك، يتم الحصول على ثمرة أورجانويد الأكثر فعالية عندما علينا تجنب فصل المستعمرات الأولية إلى الخلايا المفردة، ولكن بدلاً من ذلك نقل المستعمرات سليمة في ظروف الثقافة أورجانويد.
كما تتحمل ظروف الثقافة أورجانويد ميزة إعطاء إمكانية كريوبريسيرفي يسكس، شريطة أن يتم استردادها أورجانويدس من تلك المصفوفات، تجنب تفكك الخلية قبل تجميد في حمام النيتروجين.
يمكن تحويل ياب إعادة برمجة الإجراء تعرض أنواع متميزة من خلية متمايزة المستمدة من مختلف الأنسجة الكبار إلى على الخلايا الجذعية المقابلة الخاصة بالانسجة (اختبرناها باستخدام الخلايا الثديية، والبنكرياس والخلايا العصبية)1. في الفرق من إيبسكس أو جهود إعادة برمجة أخرى، يمكن الحفاظ على الطوائف المنبوذة ياب/الناجم عن ذكريات على أنسجة المنشأ. ملاحظة، التمايز دي من خلايا جسدية في خلايا تتمتع بخصائص الشبيهة الجذعية هو الشكل الوحيد للخلية مصير اللدونة وإعادة برمجة ولاحظ الحية، على سبيل المثال بعد تلف الأنسجة ودعم الجرح الشفاء5،17 , 18 , 19 , 20-من الجدير بالذكر أن ياب وطاز لا يمكن الاستغناء عنها إلى حد كبير للتوازن الطبيعي ولكنها حاسمة لإصلاح الأنسجة في أنسجة متعددة11،21. دائماً مع وظيفة فسيولوجية لإعادة برمجة الخطوات المذكورة هنا، ياب/طاز مؤخرا تبين أن يشترط في التجديد المعوية في نماذج الماوس لمرضى التهاب القولون التقرحي يسبب تحويل الخلايا المعوية الكبار في ظهارة إصلاح يعرض ميزات القناة الهضمية الجنينية19. إعادة برمجة ياب مما يوسع استراتيجيات اللدونة المستحث الخلية الحالية بتوفير وسيلة لتوليد الخلايا الجذعية الجسدية، دولة التي قد تم حتى الآن تحديا لالتقاط في المختبر. هذا النهج، إذا امتد أيضا إلى الخلايا المستمدة من الإنسان، قد صلة واسعة من تطبيقات الطب التجديدي للدراسة حالة جسدية ستيمنيس وأن لتوسيع جسدية تنبع الخلايا في المختبر.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن نشكر كامارغو واو على هدية الفئران ياب تيتوS127A ؛ R26-rtTAM2 الفئران (الأسهم #006965) تم شراؤها من جاكسون المختبر. ونشكر فراسون كيارا وباسو جوزيبي للمساعدة في إجراءات نظام مراقبة الأصول الميدانية. هذا العمل تدعمه "التحكيمية الخاصة البرنامج جزيئية علم الأورام السريري" '' 5 كل ميل '' والتحكيمية PI-منحة لليرة، والمشروع "الرائد التخلق" لجنة المصالحة الوطنية-وزارة المنح إلى إس بي وتلقى هذا المشروع تمويلاً من مجلس البحوث الأوروبي (المنسق) ضمن الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 برنامج البحوث والابتكار (منح اتفاق دينوفوستيم رقم 670126).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
| 100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
| 24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
| 40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
| 48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
| 50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
| 6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
| BPE | Gibco | 13028014 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 1705-041 | |
| Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DnaseI | Roche | 11284932001 | |
| doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
| FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
| FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
| FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
| FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
| FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
| HBSS | Gibco | 24020117 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
| ITS-X | Gibco | 51500056 | |
| K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
| K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
| Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
| non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
| PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
| PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
| PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
| Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
| Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
| recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
| SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
| Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Waymouth medium | Gibco | 31220023 |
References
- Panciera, T. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Bar-Nur, O. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Bai, H. Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation. Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).
- Cai, J. The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program. Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).
- Elbediwy, A. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Taniguchi, K. A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration. Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).
- Zhang, W. Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma. Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S.
- Azzolin, L. YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response. Cell. 158 (1), 157-170 (2014).
- Stingl, J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Means, A. L. Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates. Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).
- Shi, G. Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia. Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).
- Huch, M. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).
- Fernandez Vallone, V. Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage. Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).
- Yanger, K. Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration. Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).
- Yui, S. YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration. Cell Stem Cell. , (2017).
- Pan, F. C. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140 (4), 751-764 (2013).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).
- Lentiviral production and infection. , http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf (2016).
