Summary
P19マウス胚癌細胞株(P19細胞株)は、生体内分析に比べて大幅に簡素化された神経新生の分子機構の研究に広く用いられている。ここでは、P19細胞株におけるレチノイン酸誘発神経新生に関するプロトコルを提示する。
Abstract
マウス胚由来の奇形癌に由来するP19細胞株は、3つの生殖層に分化する能力を有する。レチノイン酸(RA)の存在下で、懸濁培養P19細胞株はニューロンに分化するように誘導される。この現象は、インビトロで神経新生モデルとして広範囲に研究されている。したがって、P19細胞株は、神経新生に関連する分子および細胞研究に非常に有用である。しかしながら、文献に記載されているP19細胞株の神経分化のためのプロトコルは非常に複雑である。本研究で開発した方法は簡潔で、神経発達異常や神経変性疾患の分子機構解明に一役を果たします。
Introduction
胚の発達の間に、単一の細胞層は3つの別々の生殖層1、2、3に変換される。生体内で発生する現象の研究可能性を高めるために、便利なモデルとして三次元集合体(胚体)の生成が開発されました。このようにして形成された細胞凝集体は、細胞分化を引き起こす様々な条件にさらされ、胚4、5の発達を反映する。P19マウス胚癌細胞株(P19細胞株)は、ビトロ6、7、8における神経新生研究の細胞モデルとして一般的に使用される。P19細胞株は、典型的な多能性幹細胞の特徴を示し、細胞凝集中のレチノイン酸(RA)の存在下でニューロンに分化し、付着条件下で神経突起の成長を続けることができます。また、未分化P19細胞株は、ジメチルスルホキシド(DMSO)9、10、11、12の影響下で筋肉および心筋細胞様細胞を形成することもできる。
多くの方法13、14、15、16は、神経分化のために報告されているが、方法論は時々複雑であり、説明を読むだけでは理解しにくい。例えば、プロトコルは、ふくらはぎ血清(CS)と胎児ウシ血清(FBS)13の混合物を補充したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)培地の組み合わせを必要とする場合がある。さらに、神経発達に使用される培地は、しばしばニューロベースサルとB27サプリメント13、14、15、16で構成されている。そのため、既存のメソッドは準備の複雑さが含まれており、ここでの目標はプロトコルを簡素化することです。本研究では、FbSを用いてDMEMをP19細胞株(DMEM+10%FBS)の維持、ニューロン発達(DMEM+5%FBS+RA)に利用できることを実証した。P19細胞株を用いて神経新生を簡素化したこの簡略化された方法は、ニューロンがどのように発達するかの分子機構を研究することを可能にする。また、アルツハイマー病等の神経変性疾患に関する研究もP19細胞株17,18を用いて行われ、本研究で開発した方法が解明に一役を果たそして、神経発達異常および神経変性疾患における分子機構。
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Protocol
1. 文化維持
- メンテナンス培地中のP19細胞株を培養する(10%FBS、100単位/mLペニシリンおよび100単位/mLストレプトマイシンを補充した4,500mg/Lのグルコースを含むダルベッコの改変イーグル培地)。37 °C および 5% CO2でインキュベートします。
2. サブ培養細胞
- 細胞が約80%の合流点に達すると、使用した培地を細胞培養フラスコから除去する(表面積25cm2)。
- カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩分(PBS)の2mLで細胞を洗浄します。
- 0.25%トリプシン-EDTA(エチレンディアミンテトラセチン酸)の1 mLを細胞単層に加えます。
- フラスコをCO2インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に2~3分間入します。
- フラスコサーフェスへのセルアタッチメントを評価します。すべてのセルがデタッチされ、培地内に浮動していることを確認します。
- メンテナンス培地の9mLを加えて、トリプシンの酵素活性を止める。
- メンテナンスメディアでセルを再中断します。
- 細胞を15mLチューブに移し、遠心分離機を200xgと室温(RT)で5分間遠心分離機に移します。
- 上清を捨て、15 mLチューブに新鮮なメンテナンスミディアムの10 mLを追加します。
- セル懸濁液を使用して、製造元の指示に従ってセルカウンタを使用してセル番号を決定します。
- 新しい25 cm2フラスコで2 x 104細胞/cm2の種子細胞。
- メンテナンスメディアを最大10mLまで追加します。
- フラスコをCO2インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に2~3日間入れて入れします。
3. トリプシン消化
- セルフラスコからの吸引メンテナンス媒体。カルシウムとマグネシウムフリーのPBSの2 mLで細胞を一度洗います。
- 0.25%トリプシン-EDTAの1 mLを追加します。
- フラスコを細胞と一緒にCO2インキュベーターに入れ、37°Cで2~3分間入れておきます。
- 1 mL ピペットを使用して、細胞を 10 回ピペットで解離します。
- 分化媒体の9 mL(4500mg/Lのグルコースを添加した4500mg/Lのグルコースを添加したDulbeccoの改変イーグル培地、5%FBS、100単位/mLペニシリン、100単位/mLストレプトマイシン)を細胞に加えて中和する。
- 細胞を15mLチューブに移し、遠心分離機を200 x gとRTで5分間遠心分離機に移します。
- 上清を廃棄し、レチノイン酸(RA)なしで分化培地の1 mLを加えます。細胞ペレットを再中断します。
- セル懸濁液を使用して、製造元の指示に従ってセルカウンタを使用してセル番号を決定します。
4. 集約生成
- 分化媒体の10mLに5μLのRA(99.8%エタノールに溶解した1mMストック、-20°Cで保存)を加え、よく混ぜます(0.5μM RAの最終濃度)。
注:RA は光に敏感です。EtOHの低濃度は細胞分化19、20、21に影響を与えない。 - 100mmの非処理培養皿(懸濁培養専用)に分化媒体(RA付き)の10mLを加えます。
- 100mm皿(皿表面積56.5cm2)に1 x 106セルをシードします。
- 凝集体形成を促進するために、2日間37°Cおよび5%CO2で細胞を含むフラスコをインキュベーターに入れる。
- 2日後、分化媒体を交換する。10 mLピペットを用いて凝集体を含有する吸引媒体をRTで15mLチューブに移す。
- RTで1.5分間重力で凝集体を決済できるようにします。
- 上清を捨てます。
- 10 mLの血清ピペットを使用して、0.5 μM RAで新しい10 mLの分化媒体を追加します。
注意:セルの凝集体を上下にピペットにしないでください。 - 骨材を新しい100mm非処理培養皿(懸濁培養専用)にシードします。
- プレートをインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に2日間置きます。
5. 解離の集約
- 10 mLピペットを使用して細胞凝集体を吸引する。
- 凝集体を15 mLチューブに移します。セルの凝集体が重力で 1.5 分間定着できるようにします。
- 上清を取り除く。
- DMEM単独で凝集体を洗浄する(血清および抗生物質フリー)。
- RTで1.5分間、重力沈降によって細胞凝集体が沈降することを許可する。
- 上清を吸引し、トリプシンEDTA(0.25%)の2 mLを追加します。
- 細胞凝集体を水浴場(37°C)に10分間入れ、手でタップして2分ごとにゆっくりと凝集体を攪拌します。
- メンテナンス培地を4mL加えてトリプシン化プロセスを停止します。
- ピペットは1 mLピペットを使用して上下20回を集約します。
- 200 x gおよびRTで5分間遠心分離球。
- 上清を取り出し、5mLのメンテナンス培地でセルペレットを再度サスペンドします。
- セル カウンタを使用してセル番号を決定します。
6. めっきセル
- メンテナンスミディアムのウェルあたり3 mLを6ウェルプレートに加えます。
- 0.5 x 106/ウェルの密度で6ウェル培養板中の種子細胞。
- 5%CO2濃度で37°Cでインキュベートします。
- カバーガラス上の細胞を6ウェル培養プレートに播種し、抗MAP2抗体(20%合流)で免疫染色を行う。RNAを単離し、Map2、NeuN、Oct4、Nanog、およびGapdh(20%合流)のRT-PCRを実行するには、6ウェルプレートを使用します。
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Representative Results
P19細胞株における神経新生誘導のためのプロトコルの簡略化されたスキームを図1に示す。未分化状態および神経新生中にP19細胞株の特性を定義するために、RT-PCR(逆転転写-ポリメラーゼ連鎖反応)法が用いた。未分化されたP19細胞株は、有機カチオン/カルニチントランスポーター4(Oct4)およびナノホメオボックス(ナノグ)などの多能性遺伝子を発現した。RAの存在下での懸濁培養における細胞凝集によって誘発される神経新生は、Oct4およびNanog発現の急激な減少をもたらした。逆に、ニューロンマーカーの発現:微小管関連タンパク質2(Map2)、NeuN(RNA結合タンパク質とも呼ばれ、キツネ-1ホモログ3(Rbfox3))は、誘発された神経新生後に増加した(図2)6 ,14,15,22.各遺伝子に使用されるプライマーは、ヌクレオチド配列および表1の製品の大きさと共に示される。未分化P19細胞株の顕微鏡画像は、丸い形の形態を示した(図3A)。神経新生の誘導後、細胞の神経構造はめっきの4日後にはっきりと見えていた(図3B)。さらに、図4は、分化したP19細胞株におけるMAP2発現の蛍光画像(めっき細胞の4日後)14を表す。
図 1: P19胚癌細胞における神経新生の誘導のためのプロトコル回路図神経新生は、FBSおよび0.5 μM RAの5%を持つ100mm非処理培養皿でP19細胞株を培養することによって誘導される。4日後、細胞凝集体をトリプシンと解離し、次の4日間、付着細胞培養プレートに播種する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: P19細胞株における遺伝子発現の変化バンドグラフは、未分化P19細胞株(Oct4、Nanog)および神経新生中(Map2、NeuN)の遺伝子発現を表す。グリセラルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Gapdh)を参照遺伝子として用いていた。サンプルはアガロースゲルにロードされる(1.5%)二重レプリケーションで。略語: 未分化は、RA処理なしの未分化P19細胞株を表します。1日目〜4日目は、細胞めっき後の後の4日後のRA処理および細胞凝集段階の後の日を表す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:P19細胞株の分析の代表的な画像。(A) 未分化P19細胞株の光顕微鏡画像。(B)神経新生の4日後のP19細胞株の光顕微鏡画像-RA処置および細胞凝集段階の4日後。スケールバー = 100 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:分化したP19細胞株の代表的な免疫蛍光画像。メッキ後4日目に抗MAP2及びDAPIで染色したP19細胞株の免疫蛍光画像を合体させた。スケールバー = 100 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| プライマー | プライマーシーケンス | 製品 サイズ (bp) |
| ガプド | F: TGACCTCAACTACATTCTACA R: CTTCCCATTCTCGCTTG |
85名 |
| 地図2 | F: GCTGAGATCATカカカグツ R: TCCTGCCAAGAGCTCATGCC |
211の |
| 10月4日 | F: GGCGTTCTCTTTTGAAggTTTC R: CTCGAACCACATCCTCT |
313の |
| ノイン | F: GGCAAATGTTCG R: TCAATTTCCCTACGAT |
160の |
| ナノグ | F: アアガガグアグググググググッグ R: CTGGCTTTCCTGACTT |
520の |
表 1: RT-PCR に使用されるプライマー。
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Discussion
ここでは、P19細胞株を用いて神経新生に対する簡単なプロトコルについて説明する。この点に関して多くの報告が発表されているが、P19細胞株を用した神経新生誘導の詳細な方法論は不明のままである。また、実験全体で10%FBSの簡易高グルコース(4,500mg/L)DMEM培地を利用しました。これにより、ユーザーフレンドリーな方法で神経原性実験を行い、将来的にこの方法の使用を拡大することができました。
このプロトコル内で最も重要な点は、RA濃度と懸濁培養中の細胞凝集体の生成です。P19細胞株における神経新生の刺激は凝集体の形成なしに行うことができるが、産生される神経細胞の数は細胞培養22において3分の2減少する。Monzoらは、単層15でそれらを培養することによりP19細胞株における神経新生誘導を示している。その方法は懸濁培養プロセスを排除できるため非常に便利ですが、その方法を他のよく記述された方法と比較するには、さらなる研究が必要です。培地中の0.5μMのRA濃度は、RAの1μMと比較してめっき後の細胞凝集体およびニューロンの数が多かった。また、RA治療中に凝集体の大部分が懸濁培養皿の底部に取り付けられている場合、効率的な神経新生を観察することができなかったことに注意することも重要です。手順の開始時に使用されるP19細胞株の最適な数は、分化媒体の10 mL毎に1 x 106である。神経新生の誘導の間に、P19細胞株は様々な大きさの凝集体を形成し、さらには単一の細胞が培養中に見出される。この問題を克服するために、15mLチューブで自由落下の1.5分後に細胞凝集体を収集しました。このアプローチにより、単一細胞の汚染を排除できることがわかった。また、グリア細胞の広範な増殖を阻害する長期培養のための抗有化薬(例えば、シトシンアラビノシド)を用いて細胞培養を行うことが推奨される。
P19細胞株に由来するニューロンは、N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)とα-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸(AMPA)/カイニテ(KA)タイプ24、25の両方のイオノトロピックグルタミン酸受容体を発現する。機能性γ-アミノブチル酸(GABA)受容体25.したがって、P19細胞株は、神経分化26、27、28を支配する分子機構に関する研究で広く使用されている。さらに重要なことは、細胞移植29、30後に腫瘍の発症は認められなかった。
そのために、アルツハイマー病17、18などの神経変性疾患に関する研究もP19細胞株を用いて行っており、今回開発した方法が分子解明の一因となると考えています。神経発達異常および神経変性疾患のメカニズム。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、ポーランド国立科学センター(助成金なし)によって財政的に支援されました。UMO-2017/25/N/NZ3/01886)とKNOW(リーディング国立研究センター)科学コンソーシアム「健康な動物-安全な食べ物」、科学・高等教育省の決定 05-1/KNOW2/2015
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
References
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