Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a integridade da barreira sangue-testículo injetando inulina-FITC em testículos. Este é um método eficiente na vivo para estudar a integridade de barreira sangue-testículo, que pode ser comprometida por elementos genéticos e ambientais.
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Artigo de método
Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Espermatogênese é o desenvolvimento das espermatogónias em espermatozoides maduros nos túbulos seminíferos do testículo. Este processo é suportado por junções de células de Sertoli na barreira sangue-testículo (BTB), que é a barreira de tecido mais apertada no corpo dos mamíferos e segrega o epitélio seminífero em dois compartimentos, um basal e um adluminal. O BTB cria um microambiente exclusivo para as células germinativas em meiose eu / II e para o desenvolvimento de postmeiotic espermátides em espermatozoides através de acridina. Aqui, descrevemos um ensaio confiável para monitorar a integridade do BTB do rato testículo na vivo. Uma intacta BTB bloqueia a difusão de inulina FITC-Conjugado da basal para o compartimento apical dos túbulos seminíferos. Esta técnica é apropriada para o estudo de genes candidatos, vírus ou tóxicos ambientais que podem afetar a função do BTB ou integridade, com um procedimento fácil e de um requisito mínimo de habilidades cirúrgicas em comparação com métodos alternativos.
Introdução
Espermatogênese de mamíferos é considerado um processo altamente estruturado que engloba espermatogónias auto-renovação e diferenciação através de espermatócitos em espermatozoides haploides através de mitose e meiose acridina, durante o qual dramática ocorrem alterações bioquímicas e morfológicas. Desenvolvimento das células germinativas são progressivamente transportadas da base do túbulo seminífero em direção ao lúmen. Este processo é regulado pelo celular os contactos entre as células germinativas e células de Sertoli1,2. Células de Sertoli adjacentes formam o BTB que situa-se perto da base do túbulo semin....
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Protocolo
Todas as experiências em animais realizadas foram aprovadas pelo Comitê de Nanjing Medical University. Camundongos C57BL/6 machos foram mantidos em condições de fotoperíodo controlados e foram fornecidos com comida e água.
1. preparações
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Capilares de microinjeção
- Use os capilares microinjeção com um diâmetro exterior e interior Dímetro comprimento de 1,0 mm, 0.8 mm e 10,0 cm, respectivamente.
- Puxe os capilares de vidro com um puxador capilar (figura 1A). Testar e ajustar as configurações, dependendo da máquina de extrator capilar que está sendo usado.
- ....
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Resultados
A montagem experimental para a realização do ensaio de integridade BTB é mostrada na Figura 1. Puxe e aguçar os capilares microinjeção com um extrator capilar e chanfrador micropipeta, respectivamente (figura 1A e 1C). O aquecedor termostático e equipamentos para o microinjection estão ilustradas na figura 1B e 1D.
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Discussão
Espermatogênese ocorre no epitélio seminífero e é um processo altamente ordenado e dinâmico que é regido por células germinativas e células somáticas (por ex., células de Sertoli)13. A estrutura do BTB, que é construída pelas células de Sertoli, divide o epitélio seminífero em um basal e um compartimento apical. O desenvolvimento das células germinativas haploides e meióticas ocorre no compartimento apical que forma uma barreira imunológica14.
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela nacional chave R & D programa de China (2016YFA0500902), Nacional Natural Science Foundation da China (31471228, 31771653), a Fundação de ciência de Jiangsu para ilustres jovens estudiosos (BK20150047), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) e o programa inovadora e empreendedorismo da província de Jiangsu para K.Z.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Extrator capilar | SUTTER INSTRUMENT (EUA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (EUA) | SH30258.01 | diluição para 1× em ddH2O |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma (EUA) | F6057 | |
| Lâminas de microscópio de adesão | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cloreto de cádmio | Sigma (EUA) | 655198-5G | |
| Microscópio confocal | Zeiss (Alemanha) | LSM700 | |
| Papel sem poeira | Kimberly-Clark (EUA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (EUA) | F3272 | |
| Capilares de microinjeção | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1,0 mm 0,8 mm &vezes; 100 mm |
| Chanfrador de micropipeta | NARISHIGE (JAPÃO) | EG-400 | |
| OUT | SAKURA (JAPÃO) | 4583 | |
| Paraformaldeído | Sigma (EUA) | P6148 | |
| Pentobarbital sódico | Merck (Alemanha) | P11011 | |
| Máquina de barbear | Yashen (China) | ||
| Microscópio estéreo | Nikon (JAPÃO) | SMZ1000 | |
| Sacarose | Sangon Biotech (China | )A610498 | |
| Instrumentos cirúrgicos | Mais forte (China) | tesouras, pinças, porta-agulhas | |
| Seringa | KDL (China | )20163150518 | 0,45 mm e vezes; 0,16 mm RW LB |
| aquecedor termostático | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7,6 | |||
| 0,2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1,37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
Referências
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al.
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Reimpressões e permissões
