Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

إعداد حبيبات غوشوكانغ (GSK) للتجارب في الجسم الحي وفي المختبر

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59171
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Summary

توفر هذه المقالة بروتوكول مفصل لإعداد حل عمل من حبيبات Gushukang للدراسات الحيوانية وحبيبات GSK التي تحتوي على المصل للتجارب في المختبر. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على التحقيقات الدوائية للأدوية العشبية، فضلا عن الوصفات الطبية لكل من التجارب الحية والمختبرية.

Abstract

يلعب الطب العشبي الصيني التقليدي دورًا كطريقة بديلة في علاج العديد من الأمراض، مثل هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث (POP). الحبيبات Gushukang (GSK)، وصفة طبية تسويقها في الصين، لها آثار واقية من العظام في علاج POP. قبل الإدارة إلى الجسم، هناك حاجة عادة إلى إجراء إعداد معيار واحد، والذي يهدف إلى تعزيز الإفراج عن المكونات النشطة من الأعشاب الخام وتعزيز الآثار الدوائية، فضلا عن النتائج العلاجية. تقترح هذه الدراسة بروتوكولمفصل لاستخدام حبيبات GSK في الاختبارات التجريبية في الجسم الحي وفي المختبر. يقدم المؤلفون أولاً بروتوكولاً مفصلاً لحساب الجرعات المناسبة للحيوانية من حبيبات في التحقيق في الجسم الحي: وزنها، حل، تخزين، والإدارة. ثانياً، تصف هذه المقالة بروتوكولات المسح المقطعي الدقيق وقياس معلمات العظام. وتم تقييم إعداد العينات، وبروتوكولات لتشغيل آلة التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة، والتحديد الكمي لبارامترات العظام. ثالثا، يتم إعداد حبيبات GSK التي تحتوي على المصل، ويتم استخراج المصل الذي يحتوي على المخدرات لنشأة العظام في المختبر وأوستيولاستوجينيسيس. كانت حبيبات GSK داخل المعدة تدار مرتين في اليوم للفئران لمدة ثلاثة أيام متتالية. ثم تم جمع الدم، والطرد المركزي، وتعطيل، وتصفيتها. وأخيرا، تم تخفيف المصل واستخدامها لإجراء تكوين العظام وosteoblastogenes. يمكن اعتبار البروتوكول الموضح هنا مرجعًا للتحقيقات الدوائية للأدوية العشبية الموصوفة، مثل حبيبات.

Introduction

الطب الصيني التقليدي (TCM) هو واحد من النهج التكميلية والبديلة الهامة لعلاج هشاشة العظام1،2. ديكوتيون المياه هو الشكل الأساسي والأكثر استخداما من الصيغة3. ومع ذلك، توجد عيوب أيضا: سوء الذوق، وإزعاج النقل، وقصر مدة الصلاحية والبروتوكولات غير المتسقة، والحد من الاستخدامات، فضلا عن الآثار العلاجية. لتجنب العيوب المذكورة أعلاه، فضلا عن متابعة آثار أفضل، تم تطوير حبيبات واستخدمت على نطاق واسع4. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد استكشفت الآليات الدوائية لواحد أو أكثر من المكونات الفعالة من حبيبات5و6و7، والآليات الدقيقة والعمليات الدوائية الكامنة لا تزال من الصعب تحديدها. وذلك لأن الكثير من المكونات الفعالة من حبيبات واحدة قد تمارس في وقت واحد آثار مماثلة أو معارضة4. ولذلك، فإن وضع بروتوكول قياسي واحد لإعداد حبيبات قبل تسليمها إلى الجسم ليس فقط سيكون لها تأثير كبير على النتائج العلاجية ولكن مطلوب أيضا لكل من الاختبارات في الجسم الحي وفي المختبر.

وعلاوة على ذلك، فإن الآثار العلاجية للحبيبات في العيادة من الصعب تأكيد وتحديد بالضبط باستخدام في المختبر أو الدراسات الخارجية، مما يخلق تحديا لأن الآليات الدوائية معقدة للغاية. لحل هذه المشكلة، تم اقتراح إعداد المصل الذي يحتوي على المخدرات لأول مرة من قبل Tashino في الثمانينات8. ومنذ ذلك الحين، طبق العديد من الباحثين المصل المحتوي على الأدوية على الأدوية العشبية، بما في ذلك حبيبات9و10و11 . وفي الوقت الراهن، يعتبر اختيار المصل المحتوي على المخدرات للتحقيقات في المختبر استراتيجية واحدة تحاكي الظروف الفسيولوجية عن كثب.

تم تطوير حبيبات Gushukang (GSK) لعلاج هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث (POP) على أساس الممارسة السريرية في ضوء نظرية TCM. حبيبات GSK منع فقدان العظام في الفئران المبيض (OVX) في الجسم الحي، وتمنع ارتشاف العظامالعظمية، وتحفيز تشكيل العظام osteoblastic 4. وبالتالي، وجد لي وآخرون12 أن حبيبات GSK لها آثار وقائية على العظام في الفئران OVX عن طريق تعزيز أنشطة مستقبلات الكالسيوم لتحفيز تشكيل العظام. لتأكيد آثار حماية العظام، فضلا عن الآثار الدوائية من حبيبات GSK، والمؤلفين هنا توفير إجراء مفصل لإعداد حلول العمل والمخدرات (GSK الحبيبية) التي تحتوي على المصل. وعلاوة على ذلك، تصف هذه المقالة تطبيق حبيبات GSK في نموذج الماوس العظمي المستحث OVX والمصل الذي يحتوي على حبيبات GSK في المختبر osteoclastogenes/ osteoblastogenes.

وتتكون حبيبات GSK من العديد من الأعشاب13،14 ويمكن حلها تماما في المالحة بسهولة. لذلك، المالحة بمثابة السيارة. وكانت الفئران التي تديرها الشام (الشام) وفئران OVX تدار بنفس حجم الفئران المالحة التي تديرها الفئران الحبيبية. تم حساب الجرعات المكافئة من حبيبات GSK للماوس على أساس معادلة Meeh-Rubner15. هذه المعادلة ليس فقط لديه ميزة الحصول على جرعات آمنة ولكن أيضا يضمن الآثار الدوائية15. تم إنشاء الجرعات الثلاث من حبيبات GSK على النحو التالي: (1) GSKL: OVX + حبيبات GSK جرعة منخفضة، 2 غرام / كغ / يوم. (2) GSKM: OVX + جرعة متوسطة حبيبات GSK، 4 غرام / كغ / يوم. (3) GSKH: OVX + جرعة عالية من حبيبات GSK، 8 غرام / كغ / يوم. وكانت الفئران في مجموعات GSKL وGSKM و GSKH حبيبات GSK تدار داخل المعدة. كربونات الكالسيوم (600 ملغ / قرص) مع فيتامين D3 (125 وحدة دولية / قرص)، على سبيل المثال، في منتج ناضجة وتسويقها (على سبيل المثال، Caltrate [CAL]) لعلاج والوقاية من هشاشة العظام، واستخدمت كسيطرة إيجابية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات التجريبية بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة شنغهاي التابعة للجنة TCM (SZY201604005).

1. إعداد وإدارة حل العمل GSK

  1. حساب الجرعات المكافئة من حبيبات GSK للماوس.
    1. حساب سطح الجسم استناداً إلى معادلة Meeh-Rubner15: سطح الجسم = K x (وزن الجسم 2/3)/1000، حيث قيم K هي 10.6 للإنسان و 9.1 للماوس. على افتراض وزن جسم الإنسان من 70 كجم، ثم سطح جسم الإنسان (م2)= 10.6 × (70 2/3)/1000 = 1.8 م2. على افتراض وزن جسم الماوس من 20 غرام (0.02 كجم؛ على سبيل المثال، 1 شهر من العمر، الإناث، C57/BL6)، ثم سطح جسم الماوس (م2)= 9.1 × (0.02 2/3)/1000 = 0.0067 م2.
    2. استنادًا إلى سطح الجسم المحسوب، قم بحساب نسبة تحويل الجسم للإنسان والفأر. الإنسان: 70 كجم/1.8 م2 = 39. الماوس: 0.02 كجم / 0.0067 م2 = 3. حبيبات GSK = 20 غرام/70 كجم × 39/3 = 3.72 غرام/كغ = 4 غرام/كغ.
    3. استناداً إلى وزن الجسم من 20 غرام لكل ماوس، حساب الجرعة المكافئة للماوس: 4 غرام / كغ × 0.02 كجم = 0.08 غرام.
    4. حساب ثلاث جرعات مكافئة من حبيبات GSK على أساس 20 فأراً لكل مجموعة وتدخل يدوم لمدة 3 أشهر (90 يوماً): (1) GSKL (OVX + حبيبات GSK منخفضة الجرعة [2 غرام/كغ/يوم]): 0.04 غرام فأر/يوم × 20 فأراً × 90 يوماً = 72 غرام (2) جم (OVX + حبيبات GSK متوسطة الجرعة [4 غرام/كغ/ اليوم]): 0.08 غرام فأر/يوم × 20 فأراً × 90 يوماً = 144 غرام (3) غاغس (OVX + حبيبات GSK عالية الجرعة [8 غرام/كغ/يوم]): 0.12 غرام فأر/يوم × 20 فأراً × 90 يوماً = 216 غرام.
      ملاحظة: إعداد 20٪ إضافية من حبيبات GSK في الممارسة العملية للتعويض عن الخسارة.
  2. حساب حجم حبيبات GSK لكل ماوس على أساس وزن الجسم15: على سبيل المثال، حجم (V) = 0.24 مل / الماوس / يوم.
    ملاحظة: حجم الإدارة داخل المعدة للماوس هو 0.12 مل /10 غرام.
  3. وزن 10 أيام بقيمة ثلاث جرعات من حبيبات GSK. وزن 8 غرام، 16 غرام، و 24 غرام من حبيبات GSK وبمثابة GSKL، GSKM، وGSKH، على التوالي.
  4. حساب الجرعة المكافئة من كربونات الكالسيوم مع فيتامين D3 (CAL) للماوس استناداً إلى معادلة Meeh-Rubner15 كما هو الحال في الخطوتين 1.1.1 و1.1.2: جرعة CAL = 2 قرص/70 كجم × 39/3 = 0.372 قرص/كغ - 0.4 قرص/كغ.
  5. على أساس وزن الجسم من 20 غرام لكل فأر (على سبيل المثال، 1 شهر من العمر، الإناث، C57/BL6)، حساب الجرعة المكافئة من CAL للماوس: 0.4 قرص / كجم × 0.02 كجم = 0.008 قرص. ثم حساب الجرعة المكافئة من CAL على أساس 20 الفئران لكل مجموعة والتدخل تستمر لمدة 3 أشهر (90 يوما): 0.008 قرص × 20 × 90 = 14.4 أقراص. وزن 10 أيام من CAL (1.6 أقراص).
  6. حل
    1. ضع 8 غرام من حبيبات GSK في أنبوب 50 مل. إضافة 48 مل من المالحة ويهز أنبوب لتذوب تماما.
      ملاحظة: معيار الانحلال الكامل هو عدم وجود رواسب. يمكن تأكيد الانحلال الكامل إذا كان يمكن لإبرة الغافية أن تضع حل العمل ثم تطردها بسلاسة.
    2. كرر الخطوة 1.5.1 مع 16 غرام و 24 غرام من حبيبات GSK.
    3. وضع 1.6 أقراص (10 أيام' قيمتها) من CAL في أنبوب 50 مل. إضافة 48 مل من المالحة ويهز أنبوب لتذوب تماما.
      ملاحظة: يمكن تخزين حلول العمل عند -4 درجة مئوية وإعدادها كل 10 أيام.
  7. الإدارة داخل المعدة
    1. فهم الجزء الخلفي من الماوس (1 شهر من العمر، أنثى، C57/BL6) مع الماوس التي تواجه إلى الأمام وضمان أن يبقى بحزم في هذا الموقف. حافظ على هدوء الماوس لمدة دقيقتين أو ثلاث دقائق قبل الإدارة.
      ملاحظة: تأكد من أن الباحث يمكن أن نرى بوضوح الجزء الأمامي من الماوس. ارتداء قفازات لمنع لدغات الماوس، وخاصة بالنسبة للباحثين الجدد.
    2. ضع إبرة الغافاج (الحجم: #12، 40 مم) في حل العمل من حبيبات GSK ورسم 0.24 مل من حل العمل.
    3. وضع إبرة الغافاج في الماوس من خلال جانب واحد من فمه حتى تصل إبرة الغافج إلى المعدة.
      ملاحظة: لتأكيد إبرة الغافية وصلت إلى المعدة: (1) إبرة الغافج يواجه الشعور بالمقاومة. وفي الوقت نفسه، يظهر الماوس عمل البلع قبل أن تمر إبرة الغافية بالتضييق المادي للمريء. (2) حقن ما يقرب من 0.5 مل من حل العمل في الماوس والانتظار لمدة دقيقة واحدة. إذا لم يكن هناك حل يخرج من الماوس ، وهذا يعني أن إبرة الغافج قد وصلت إلى المعدة.
    4. حقن حل العمل من حبيبات GSK (0.24 مل / الماوس) في المعدة ومن ثم رسم إبرة gavage. إرجاع الماوس إلى قفصه.
    5. كرر الخطوة 1.6.4 مع حل CAL وحقن 0.24 مل من حل CAL لكل ماوس.
      ملاحظة: يتم حساب وحدة تخزين حل CAL كما في الخطوة 1.2.

2. التصوير المقطعي المحوسب الصغير

  1. T محمد محمد الحصاد والإعداد
    1. الفأر ة التخدير داخل الشبيرية مع 300 مل / 100 غرام من 80 ملغ / كغ الكيتامين في اليوم التالي للتدخل 90 يوما. استخدام قرصة إبرة من أصابع القدم للتأكد من ما إذا كان الماوس هو التخدير تماما. لا توجد استجابة تشير إلى التخدير الناجح. ثم قتل الماوس مع خلع عنق الرحم.
    2. إصلاح الماوس مع كل من الذراعين والساقين على رغوة مع المسامير.
    3. قطع الجلد مع مقص (حجم: 8.5 سم) وملاقط (حجم: 10 سم) من الساقين من القريبة إلى نهاية القاصي ثم حصاد tibias.
    4. على الفور وضع tibias في 70٪ الكحول الإيثيلي وغسل لمدة 3 مرات.
  2. التفاف الساق اليسرى من الماوس مع رغوة الإسفنج ووضعها في أنبوب عينة (35 ملم قطرها، 140 ملم طول).
    ملاحظة: يجب أن يكون المحور الطويل للعينة جنبا إلى جنب مع أن أنبوب العينة. تأكد من النهاية القريبة من نقاط الساق صعودا.
  3. تشغيل جهاز المسح الضوئي MICRO-CT 80
    1. بدء تشغيل مايكرو CT 80 آلة المسح الضوئي في درجة حرارة الغرفة.
    2. تعيين أنبوب عينة في ميكرو CT 80 وبدء المسح الضوئي المقطع العرضي مع المعلمات المسح الضوئي التالية: حجم بكسل 15.6 ميكرومتر، أنبوب الجهد 55 كيلو فولت، أنبوب الحالي 72 درجة مئوية، وقت التكامل 200 مللي ثانية، القرار المكاني 15.6 م، دقة بكسل 15.6 ميكرومتر، ومصفوفة الصور 2048 x 2048.
      ملاحظة: يتميز العظم الملغي عن العظم القشري عن طريق المسح المسبق. يتم تعريف منطقة المسح الضوئي من الساق على أنها منطقة العظام الملغاة من 5 ملم تحت الهضبة الساقية إلى نهاية القاصي.
  4. تحديد حجم معلمة العظام
    1. بعد الانتهاء من المسح المقطعي، احصل على صور الساقية اليسرى.
    2. تعيين عتبة الكثافة إلى 245-1000. استخدم برنامج تقييم التصوير المقطعي المحوسب الصغير V6.6 لقياس معلمات العظام التالية: الكثافات المعدنية للعظام (BMD)، وحجم العظام على الحجم الإجمالي (BV/TV)، وعدد العظام trabecular (Tb.N)، وسمك العظام trabecular (Tb.Th)، فضلا عن فصل العظام trabecular العظام ( Tb.Sp).

3. إعداد مصل الدم للتجارب المختبرية

  1. حساب
    1. على أساس وزن جسم الفئران من 0.2 كجم (1 شهر من العمر، أنثى، Sprague-Dawley)، حساب جرعة حبيبات GSK: جرعة الإنسان / يوم س وزن الجسم من الإنسان × K / وزن الجسم من الفئران = 20 غرام / 70 كجم / يوم × 70 كجم × K (K = 0.018) / 0.2 كجم = 2 غرام / كغ / يوم.
      ملاحظة: K هو معامل التحول الدوائي بين الإنسان والماوس15 (K = 0.018).
    2. كرر الخطوة 3.1.1 وحساب الجرعات التالية.
      1. حساب جرعة GSKL: 10 غرام / 70 كجم / يوم × 70 كجم × K / 0.2 كجم = 1 غرام / كجم / يوم.
      2. حساب جرعة من GSKM: 20 ز / 70 كجم / يوم × 70 كجم × K / 0.2 كجم = 2 غرام / كجم / يوم.
      3. حساب جرعة GSKL: 40 غرام / 70 كجم / يوم × 70 كجم × K / 0.2 كجم = 4 غرام / كجم / يوم.
      4. حساب جرعة CAL: 2 قرص / 70 كجم / يوم × 70 كجم × K / 0.2 كجم = 0.2 قرص / كجم / يوم.
    3. حساب الجرعة الإجمالية من حبيبات GSK وCAL.
      1. حساب الجرعة الإجمالية لGSKL: 1 غرام / كغ / يوم × 0.2 كجم × 6 فئران × 3 أيام = 3.6 غرام.
      2. حساب الجرعة الإجمالية لGSKM: 2 غرام / كغ / يوم × 0.2 كجم × 6 فئران × 3 أيام = 7.2 غرام.
      3. حساب الجرعة الإجمالية لGSKH: 4 غرام / كغ / يوم × 0.2 كجم × 6 فئران × 3 أيام = 14.4 غرام.
      4. حساب الجرعة CAL = 0.2 قرص / كجم / يوم × 0.2 كجم × 6 فئران × 3 أيام = 0.72 قرص.
        ملاحظة: هناك حاجة إلى ما مجموعه 10 مل من المصل الذي يحتوي على حبيبات GSK لإعداد 100 مل وسط الثقافة (20٪ GSK الحبيبية التي تحتوي على المصل). ومن المتوقع أن يوفر كل فأر (6 فئران/مجموعة) 1.5-2 مل من المصل المحتوي على حبيبات GSK بعد الطرد المركزي.
    4. حساب حجم حبيبات GSK المطبقة لكل فأر على أساس وزن الجسم15: على سبيل المثال، حجم (V) = 2 مل / الفئران / يوم.
      ملاحظة: حجم الإدارة داخل المعدة للفئران هو 0.1 مل / 10 غرام.
  2. وزن 3 أيام بقيمة ثلاث جرعات من حبيبات GSK. وزن 3.6 غرام، 7.2 غرام، و 14.4 غرام من حبيبات GSK وبمثابة GSKL، GSKM، وGSKH، على التوالي. وزن 0.72 قرص لمجموعة CAL.
  3. ضع 7.2 غرام من حبيبات GSK في أنبوب 50 مل. إضافة 36 مل من المالحة ويهز أنبوب لتذوب تماما. كرر هذا مع 3.6 غرام و 14.4 غرام من حبيبات GSK.
  4. كرر القسم 1.6 للإدارة داخل المعدة مع 2 مل من حل العمل GSK.
    ملاحظة: إدارة نفس الحجم من المالحة (2 مل لكل فأر) لإعداد المصل ويعمل كمجموعة مراقبة فارغة للاختبارات في المختبر.
  5. إعداد المصل الذي يحتوي على GSK
    1. التخدير داخل perperitoneally الفئران مع 300 مل / 100 غرام من 80 ملغ / كغ الكيتامين 1 ساعة بعد الإدارة الأخيرة من حبيبات GSK. استخدام قرصة إبرة من أصابع القدم للتأكد من ما إذا كان الفئران هو التخدير تماما. لا توجد استجابة تشير إلى التخدير الناجح.
    2. تعريض البطن إلى الجزء السفلي من صدر الفئران باستخدام مقص التشغيل المستقيم بعد قطع الجلد والصفاق.
      ملاحظة: يجب تعقيم الأداة الجراحية في درجات حرارة عالية وضغوط عالية قبل الاستخدام. يجب تعقيم المنطقة الجراحية مع الإيثانول بنسبة 70٪ أثناء جمع الدم.
    3. إزالة النسيج الضام من الشريان الأبهر البطني مع ورقة الأنسجة لفضح السفينة بوضوح.
    4. سحب الدم من الشريان الأبهري البطني باستخدام حقنة 10 مل، 22 غرام. ثم إزالة الإبرة ونقل الدم إلى أنبوب معقم 15 مل. عادة، يمكن الحصول على 6-8 مل من الدم من فأر واحد.
      ملاحظة: يجب أن يبقى كل فأر يعيش عند سحب الدم. أحد المؤشرات هو أن الشريان الأبهري البطني ينبض عندما يكون الجرذ على قيد الحياة. الجرذ ميت بعد سحب الدم
    5. حافظ على الأنبوب مستقيمًا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة حتى يتم وضع الدم في الأنبوب. ثم طرد الأنبوب بالطرد المركزي في 500−600 × ز لمدة 20 دقيقة.
    6. تعطيل المصل عن طريق احتضان في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يُحفظ عند درجة حرارة -80 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل (أقل من عام واحد).
      ملاحظة: يمكن استخدام المصل الذي تمت تصفيته في تكوين العظام في المختبر والتكوين العظمي.
  6. تطبيق
    1. في المختبر هشاشة العظام
      1. تخفيف الجرعات الثلاث من المصل الذي يحتوي على GSK (GSKL، GSKM، GSKH) بنسبة 1:4 مع الحد الأدنى من المتوسطة النسر (α-MEM) التي تحتوي على L-الجلوتامين، ريبونوكليوسيدات، وديوكسيريبونوكليوسيدات.
        ملاحظة: تأكد من أن التركيز النهائي للمصل الذي يحتوي على GSK لنشأة العظام في المختبر والتكوين العظمي هو 20٪.
      2. إضافة المصل المخفف المحتوي على GSK (200 μL/well) من الخطوة 3.6.1.1 إلى الضامة نخاع العظم (BMMs) من 4-6 أسابيع من الفئران C57BL/6 القديمة لنشأة العظام وتحفيز BMMs مع عامل تحفيز مستعمرة الضامة (M-CSF، 10 نانوغرام /مل) ومنشط المستقبلات للعامل النووي -1B ligand (RANKL, 100 ng/mL) كما سبق وصفه2.
    2. في المختبر هشاشة العظام
      1. كرر الخطوة 3.6.1.1.
      2. أضف المصل المخفف المحتوي على GSK (2 مل/بئر) إلى الخلايا الجذعية المتوسطة العظام (BMSCs) من 4-6 أسابيع من الفئران C57BL/6 القديمة لتوليد osteoblast كما سبق وصفه16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأشارت نتائج المسح المقطعي الدقيق إلى أن فئران OVX أظهرت خسارة كبيرة في العظام مقارنة بفئران التحكم المالحة (الشكل1A). التدخل (90 يوما) من حبيبات GSK زيادة كبيرة في BMD، لا سيما في مجموعة GSKM (الشكل1B). تم تحديد معايير هيكل العظام، مثل BMD، BV/TV، Tb.N، وTb.Th. أدت علاجات حبيبات GSK إلى زيادة BMD، BV / TV، Tb.N و Tb.Th ولكن انخفض Tb.Sp (الشكل1C).

وأظهرت تلطيخ حمض الطرطات المقاوم (TRAP) زيادة في عدد الأوهشاشة في الفئران OVX مقارنة مع الفئران السيطرة (الشكل2A). انخفضت علاجات حبيبات GSK العظام الإيجابية TRAP مقارنة مع مجموعة OVX. وقد تأكدت هذه النتائج عن طريق حساب نسبة المنطقة الإيجابية من TRAP إلى سطح العظام trabecular (OCs/BS٪) ونسبة عدد العظام إلى منطقة العظام (OCs /mm2). وأظهرت هذه النتائج الكمية انخفاضا كبيرا في عدد osteoclasts في مجموعات GSK بالمقارنة مع مجموعة OVX (الشكل2B،C).

تم إعطاء المصل الذي يحتوي على حبيبات GSK إلى الضامة نخاع العظم (BMMs) من 4-6 أسابيع من الفئران C57BL/6 القديمة لتوليد osteoclast وتم تحليل عدد من osteoclasts عن طريق تلطيخ TRAP. وأظهرت النتائج أن المصل الذي يحتوي على حبيبات GSK انخفض عدد osteoclasts TRAP إيجابية في مجموعات GSK مقارنة مع مجموعة التحكم (الشكل3A،B).

أظهر تلطيخ الفوسفاتيز القلوي (ALP) أن مصل GSK الحبيبية المعالج مارس تأثيرات تحفيزية على تكوين العظام مع MSCs من الفئران C57BL/6. وأظهرت تلطيخ ALP أن جميع المجموعات الثلاث من GSK الحبيبية المصل المعالج قد زادت من نشاط ALP (الشكل4A،B) مقارنة مع مجموعة التحكم.

Figure 1
الشكل 1: حبيبات GSK يمنع فقدان العظام في الفئران التي يسببها OVX. (أ) تم التعامل مع الفئران مع حبيبات GSK لمدة 3 أشهر وتم حصاد tibias اليسار لإجراء تحليل التصوير المقطعي المحوسب الصغير. تم عرض صور إعادة بناء ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للعظم ة التتراسية من الساق اليسرى. شريط مقياس = 0.5 مم (ب) تم قياس كثافة معادن العظام (BMD) وكميّة. (C) معلمات العظام من الساق اليسرى، مثل عدد العظام trabecular (Tb.N)، وحجم العظام على الحجم الكلي (BV / TV)، وسمك العظام trabecular (Tb.Th)، وفصل العظام trabecular (Tb.Sp)، المتعلقة بنية العظام trabecular في جميع المجموعات وقد أظهرت. تمت مقارنة مجموعات GSKL وGSKM وGSKH بالتحكم (Con; sham+ saline) ومجموعة OVX (n = 6, *P < 0.05, مقابل التحكم; *P < 0.05, vs OVX). CAL: كربونات الكالسيوم مع فيتامين D3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: حبيبات GSK قمع عدد من osteoclasts في الفئران OVX. (أ) تم تنفيذ تلطيخ TRAP على الفقرة القطنية 3 (L3) بعد حصاد الفئران المعالجة GSK. نتائج فخ من السيطرة (الشام + المالحة)، OVX (OVX + ملحي)، CAL (OVX + Caltrate)، GSKL (OVX + جرعة منخفضة GSK، 2 غرام / كغ / يوم)، GSKM (OVX + جرعة متوسطة GSK، 4 غرام / كغ / يوم)، وGSKH (OVX + جرعة عالية GSK، 8 ز / كغ / يوم) تم قياسها وتحليلها. شريط مقياس = 100 ميكرومتر (أعلى الصور) أو 50 ميكرومتر (الصور السفلية). (ب) القياس الكمي للسطح المغطى بالعظام على سطح العظام. (C) رقم Osteoclast. تم التعبير عن القيم على أنها متوسط ± خطأ قياسي من المتوسط (SEM). *P < 0.05, OVX مقابل السيطرة (كون); *P < 0.05, مجموعات CAL أو GSKL/GSKM/GSKH مقابل مجموعة OVX. تم تكرار جميع الاختبارات مع ما لا يقل عن 3 فئران. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يقلل المصل المعالج من حبيبات GSK من عظم العظام من الضامة نخاع العظام (BMMs). (أ) تم حصاد قذائف BMMs من الفئران C57BL/6 (4-6 أسابيع من العمر)، ومثقفة مع M-CSF (10 نانوغرام/مل) وRANKL (100 نانوغرام/مل) (التحكم)، M-CSF وRANKL بالإضافة إلى GSK، أو الأمصال المعالجة CAL. تم تقييم تكوين العظام في اليوم 4-6 من قبل تلطيخ TRAP. شريط مقياس = 100 درجة مئوية. (ب) تم تحديد عدد الأوستيوكلوست. *P < 0.05, مجموعات GSKL / GSKM / GSKH مقابل السيطرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: يعزز المصل المعالج بحبيبات GSK تكوين العظم. (أ) تم عزل الخلايا الجذعية المتوسطة العظمية (MSCs) من الفئران C57BL/6 (4-6 أسابيع من العمر) ومعالجتها مع مصل GSK أو CAL المعالج. تم إجراء تلطيخ ALP في اليوم 7 لتقييم تكوين العظمية. شريط مقياس = 100 درجة مئوية. (ب) تم تحديد عدد الأوستيوبلاست. *P < 0.05, مجموعات CAL أو GSKL/GSKM/GSKH مقابل السيطرة. وتكررت جميع الاختبارات مع ما لا يقل عن 3 فئران أو 3 مرات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حبيبات وكلاء TCM أصبحت واحدة من الخيارات المشتركة للتركيبات أو الوصفات الطبية. وتتكون حبيبات GSK من العديد من الأدوية العشبية على أساس التجارب السريرية أو نظرية TCM, وأنها تمارس آثار علاجية أفضل مع آثار جانبية أقل4. بالمقارنة مع ديكوتيون المياه، وحبيبات لديها هذه المزايا: الذوق الجيد، والراحة من التسليم، والتخزين على المدى الطويل، والبروتوكول القياسي والآثار العلاجية متسقة، فضلا عن زيادة الإنتاجية. حاليا، حبيبات هي واحدة من التكوينات الصيدلة الأكثر استخداما في TCM. ومع ذلك، لا تزال الآليات الأساسية للآثار الدوائية لا تزال تدرس نادرا. من الضروري تحديد الخطوات الحاسمة في إعداد حبيبات للتحقيق في الآليات الدوائية الكامنة.

في العقود الماضية، وعادة ما تستخدم واحدة أو أكثر من المكونات الفعالة التمثيلية من الأدوية العشبية لإجراء الاختبارات الجزيئية والنتائج الدوائية بسبب وضوحها الهيكلي. وقد أجريت العديد من التحقيقات لفهم الآثار العلاجية مع مكونات فعالة من الأعشاب TCM5،6،7. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الصعب تقليد ما سيحدث في المريض بسبب البيئة المعقدة، مع العديد من المكونات الفعالة تعمل معا. لحل هذه المشكلة، يمكن للتحقيقات مع حبيبات استكشاف العمليات الدوائية، وهي خيار واحد في إجراء الدراسات الجزيئية مقارنة مع التحقيقات مع مكونات فعالة.

إعداد حلول العمل للحبيبات يحتوي على أربع خطوات أساسية. الخطوة الأولى هي الحل. عادة ما يتم خلط حبيبات في المالحة بعد التحريك لاستكمال حل قبل مزيد من التحقيقات. كمية وممتلكات حبيبات يؤثر على الوقت والاستقرار من حبيبات خلال عملية الانحلال. الاختلاف في وقت الانحلال والاستقرار يعتمد على الأعشاب، وذلك بسبب خصائصها الفيزيائية والكيميائية والدوائية17. عادة ما يعزز الهز السليم وارتفاع درجة الحرارة ويضمنان الانحلال الكامل للحبيبات. الخطوة التالية هي التركيز. يتم النظر بعناية في الحجم المناسب لإدارة اللقاحات للالحيوانات ويتم تحديدها من قبل حجم الحل العمل. يمكن أن تؤدي اللقاحات الفموية بتركيزات عالية، مثل 10 مل/كغ أو أكثر، إلى العديد من المشاكل المتعلقة بالامتصاص. سرعة البحث عن حل العمل من حبيبات في الاثني عشر هي مشكلة واحدة شائعة. ويلاحظ أيضا مشاكل أخرى، مثل الالتهاب الرئوي الطموح، بسبب الجزر السلبي من حل العمل من حبيبات في المريء،أيضا 18. الترشيح هو الخطوة الثالثة، مما يساعد إبرة الغافية على انخفاض في الحجم ويمنع من انسداد مع حبيبات العشبية، فضلا عن يساعد على هضم حبيبات. الخطوة الرابعة هي التخزين. تخزين حلول العمل من حبيبات في درجة حرارة منخفضة (-20 درجة مئوية) يضمن نتائج أفضل.

نهج لحساب الجرعة الحيوانية المكافئة بيولوجيا مهم لتحديد آثار حبيبات في ممارسة TCM. يتم النظر في وزن الجسم (مغ/كغ) والأنواع عادة. منطقة سطح الجسم (ملغ / م2) يستخدم في كثير من الأحيان لإجراء حساب19 لأن معدل التمثيل الغذائي يرتبط بحجم الحيوان الفردي. فمن المنطقي أن تنظر في كل من مساحة سطح الجسم ووزن الجسم، وبالتالي، تم استخدام معادلة Meeh-Rubner، وهو أمر شائع في التحقيقات في الجسم الحي في الدراسات الدوائية19،20.

يتم اختيار عدة أنواع من الحيوانات لإعداد المصل التي تحتوي على المخدرات، مثل الأرانب والخنازير غينيا والفئران والفئران. لفي تحقيقات الجسم الحي، ويفضل نفس النوع. تم اختيار الفئران لأنها لا توفر المصل أكثر من الفئران فحسب، بل هي أيضا أقرب إلى الفئران من حيث التطور من الحيوانات الأخرى. كما يوصى بمعادل الجرعة في الجسم الحي (الفئران: 7 أضعاف الجرعة المكافئة) والاستخدام السريري للمرضى. عشرة أضعاف الجرعة المكافئة للخلايا التي يوفرها المصل لا يتم تطبيقها عادة في التحقيقات في الجسم الحي لأن الخلايا المعالجة أو الأعضاء يمكن أن تؤدي إلى ردود فعل سامة محتملة21. طرق مثل الحقن, إدارة الجلد, والاستنشاق هي الإجراءات الإدارية شائعة الاستخدام وفقا لإدارات الجسم الحي. وقد تم اختيار الإدارة عن طريق الفم بواسطة الإبر الغافاج في هذه الدراسة. يختلف تردد إدارة الحبيبية من مرة واحدة إلى مرتين في اليوم، وفترة التدخل هي 3-14 يومًا. وعادة ما يتم إجراء المجموعة النهائية من الدم في غضون 2 ح بعد الإدارة الأخيرة22،23، عندما يكون تركيز حبيبات في الدم مستقرة نسبيا وعلى مستوى الذروة وفقا لدراسة سابقة24.

المصل الذي يحتوي على المخدرات للاختبارات في المختبر قبل الاستخدام لا يزال مثيرا للجدل. ويرى بعض الباحثين أنه قد يؤدي إلى ردود فعل غير متوقعة أو آثار جانبية، والتي تؤثر على النتائج بسبب وجود العديد من المكونات النشطة في المصل، بما في ذلك الإنزيمات والهرمونات والأجسام المضادة، ويكمل25. ومع ذلك، يرى بعض الباحثين الرأي المعاكس بأن المكونات النشطة قد تتم إزالتها أيضًا بواسطة عملية التعطيل26. للوصول إلى أرضية وسطى، تم تعطيل المصل في هذه الدراسة قبل الحضانة في حمام مائي عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وعلاوة على ذلك، تم تضمين مجموعة مصل فارغة، حيث يتم استخدام المصل من الحيوانات المعالجة المالحة، لاستبعاد الآثار الجانبية المحتملة. ولذلك، قد يكون المصل المحتوي على المخدرات بمثابة طريقة محتملة للتحقيق في الآليات الدوائية أو النتائج العلاجية.

وبالمقارنة مع الأساليب المماثلة، فإن البروتوكول هنا له المزايا التالية: (1) الشمولية. وتستخدم كل من في المختبر وفي طرق الجسم الحي في وقت واحد، ويمكن أن تدعم بعضها البعض في الآثار الدوائية. (2) الملاءمة. يتم تضمين الفئران والجرذان فقط لأنها ترتبط ارتباطا وثيقا. (3) التكرار. يتم شراء كل من الفئران والفئران بسهولة بتكلفة منخفضة، ويمكن تكرار الأساليب بسهولة. (4) منخفضة التكلفة. نموذج الماوس العظمي المستحث OVX شائع الاستخدام وموثوق بها27،28 ويمكن بسهولة إجراء أو شراؤها. ولذلك، فإن البروتوكولات هنا هي أكثر ملاءمة بالمقارنة مع طرق أخرى لدراسة الآثار الدوائية للطب العشبية، مثل حبيبات.

ومع ذلك، هناك العديد من القيود على البروتوكولات مع حبيبات GSK. أولاً، تم إعطاء ثلاث جرعات، على الرغم من أن حبيبات أظهرت أي ميل كبير تعتمد على الجرعة للتحقيقات في الجسم الحي. قد يكون السبب في ذلك أن جرعات للدراسات الحيوانية ليست حساسة ووقت التدخل ليست طويلة بما فيه الكفاية, الأمر الذي يتطلب المزيد من الاختبار. بعد ذلك، هناك حاجة إلى فترة أطول من التدخل للتحقيقات الموازية في المختبر. المصل الذي يحتوي على المخدرات، على الرغم من تعطيله، قد يسبب آثار جانبية بعد التدخل لفترات طويلة. ثالثا، يتم استخدام مجلد واحد فقط من حل العمل لإدارة الحيوان، والتي يمكن تعديلها في الدراسات المستقبلية. وأخيرا، يمكن تغيير الأنواع الحيوانية التي يتم اختيارها لإعداد المصل المحتوي على المخدرات وروتين الإدارة وسيتم اختبارها في مزيد من الدراسات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المنح المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81804116، 81673991، 81770107، 81603643، و 81330085)، وبرنامج الفريق المبتكر، وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (2015RA4002 إلى WYJ)، وبرنامج فريق مبتكر، وزارة التعليم في الصين (IRT1270 إلى WYJ)، مركز شنغهاي الطبي للأمراض المزمنة (2017ZZ01010 إلى WYJ)، عمل ثلاث سنوات لتسريع تطوير خطة الطب الصيني التقليدي (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 إلى WYJ)، و المشاريع الوطنية الرئيسية لتطوير البحوث (2018YFC1704302).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Hyclone
laboratories		 SH30265.018 For cell culture
β-Glycerophosphate Sigma G5422 Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL) Wyeth L96625 Animal interventation
C57BL/6 mice SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Ainimal preparation
Dexamethsome Sigma D4902
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438 Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Sangon Biotech 60-00-4 Samples treatmnet
Fetal bovine serum Gibco FL-24562 For cell culture
Gushukang granules kangcheng companyin china Z20003255 Herbal prescription
Light microscope Olympus BX50 Olympus BX50 Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate Sigma A8960-5G Osteoblastogenesis
Microscope Leica DMI300B Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF Peprotech AF-300-25-10 Osteoclastogenesis
Μicro-CT Scanco
Medical AG		 μCT80 radiograph microtomograph Bone Structural analsysis
RANKL Peprotech 11682-HNCHF Osteoclastogenesis
Sprague Dawley SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT TRAP staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
  2. Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
  3. Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
  4. Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
  5. Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
  6. Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
  7. Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
  8. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
  9. Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
  10. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
  11. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
  12. Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
  13. Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
  14. Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
  15. Zhang, Y. P. Pharmacology Experiment. , 2nd edition, People’s medical publishing house. Beijing, China. (1996).
  16. Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
  17. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  18. Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
  19. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  20. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  21. Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
  22. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  23. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  24. Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  25. Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  26. Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
  27. Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
  28. Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).

Tags

الطب، العدد 147، الطب الصيني التقليدي، حبيبات غوشوكانغ، المصل الذي يحتوي على المخدرات، علم الصيدلة المصل، تكوين العظام، الفئران المبيض، تكوين العظام، في الجسم الحي، في المختبر
إعداد حبيبات غوشوكانغ (GSK) للتجارب في الجسم الحي وفي المختبر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang,… More

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang, Y., Shu, B., Zhao, D. Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59171, doi:10.3791/59171 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter