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Medicine

Vorbereitung von Gushukang (GSK) Granulat en for In Vivo und In Vitro Experiments

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59171
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung einer Arbeitslösung von Gushukang-Granulat für Tierstudien und GSK-Granulat, das Serum für In-vitro-Experimente enthält. Dieses Protokoll kann auf pharmakologische Untersuchungen von pflanzlichen Arzneimitteln sowie auf Verschreibungen für In-vivo- und In-vitro-Experimente angewendet werden.

Abstract

Die traditionelle chinesische Kräutermedizin spielt eine Rolle als alternative Methode bei der Behandlung vieler Krankheiten, wie postmenopausale Osteoporose (POP). Gushukang (GSK) Granulat, ein vermarktetes Rezept in China, haben knochenschützende Wirkung bei der Behandlung von POP. Vor der Verabreichung an den Körper, ein Standard-Vorbereitungsverfahren ist allgemein erforderlich, die die Freisetzung von aktiven Bestandteilen aus Rohkräutern fördern und die pharmakologischen Wirkungen sowie therapeutische Ergebnisse zu verbessern. Diese Studie schlägt ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von GSK-Granulat in in vivo- und in vitro-Experimentellen Assays vor. Die Autoren liefern zunächst ein detailliertes Protokoll zur Berechnung der tiergerechten Dosierungen von Granulaten für in vivo-Untersuchungen: Wiegen, Auflösen, Lagern und Verstoffen. Zweitens werden in diesem Artikel Protokolle für Mikro-CT-Scans und die Messung von Knochenparametern beschrieben. Die Probenvorbereitung, Protokolle zum Betrieb der Mikro-CT-Maschine und die Quantifizierung der Knochenparameter wurden ausgewertet. Drittens werden serumhaltige GSK-Granulate hergestellt und medikamentenhaltiges Serum für In-vitro-Osteoclastogenese und Osteoblastogenese extrahiert. GSK-Granulat wurde zweimal täglich an drei aufeinanderfolgenden Tagen intragastrisch an Ratten verabreicht. Anschließend wurde Blut entnommen, zentrifugiert, inaktiviert und gefiltert. Schließlich wurde Serum verdünnt und zur Durchführung von Osteoclastogenese und Osteoblastogenese verwendet. Das hier beschriebene Protokoll kann als Referenz für pharmakologische Untersuchungen von verschreibungspflichtigen pflanzlichen Arzneimitteln wie Granulaten betrachtet werden.

Introduction

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) ist einer der wichtigen ergänzenden und alternativen Ansätze zur Behandlung von Osteoporose1,2. Wasserabkochung ist die grundlegende und am häufigsten verwendete Form der Formel3. Es gibt jedoch auch Nachteile: schlechter Geschmack, Unannehmlichkeiten für den Transport, kurze Haltbarkeit und inkonsistente Protokolle, Begrenzung der Verwendungen sowie die heilende Wirkung. Um die oben genannten Nachteile zu vermeiden und um bessere Effekte zu erzielen, wurden Granulate entwickelt und weit verbreitet4verwendet. Obwohl viele Studien die pharmakologischen Mechanismen einer oder mehrerer wirksamer Komponenten aus dem Granulat5,6,7untersucht haben, sind die genauen Mechanismen und zugrunde liegenden pharmakologischen Prozesse schwer zu identifizieren. Dies liegt daran, dass zu viele effektive Komponenten aus einem Granulat gleichzeitig ähnliche oder entgegengesetzte Effekte ausüben können4. Daher würde die Entwicklung eines Standardprotokolls zur Vorbereitung des Granulats vor der Lieferung an den Körper nicht nur einen großen Einfluss auf die therapeutischen Ergebnisse haben, sondern ist auch für In-vivo- und In-vitro-Assays erforderlich.

Darüber hinaus sind die heilenden Wirkungen von Granulaten in der Klinik schwer zu bestätigen und anhand von In-vitro- oder Ex-vivo-Studien genau zu identifizieren, was eine Herausforderung schafft, da die pharmakologischen Mechanismen zu komplex sind. Um dies zu lösen, wurde die Herstellung von drogenhaltigem Serum zuerst von Tashino in den 1980er Jahrenvorgeschlagen 8. Von da an wandten zahlreiche Forscher medikamentenhaltiges Serum auf die Kräutermedizin an, einschließlich Granulat9,10,11. Derzeit wird die Wahl des medikamentenhaltigen Serums für In-vitro-Untersuchungen als eine Strategie betrachtet, die physiologische Bedingungen genau nachahmt.

Gushukang (GSK) Granulat wurde entwickelt, um postmenopausale Osteoporose (POP) auf der Grundlage der klinischen Praxis im Lichte der Theorie der TCM zu behandeln. GSK-Granulat verhindert Knochenverlust bei ovariectomisierten (OVX) Mäusen in vivo, hemmt die osteoklastische Knochenresorption und stimuliert die osteoblastische Knochenbildung4. Daher fanden Li et al.12 heraus, dass GSK-Granulate bei OVX-Mäusen Knochenschutzwirkungen haben, indem sie die Aktivitäten des Calciumrezeptors zur Stimulierung der Knochenbildung verbessern. Zur Bestätigung der knochenschützenden Wirkungen sowie der pharmakologischen Wirkungen von GSK-Granulat stellen die Autoren hier ein detailliertes Verfahren zur Herstellung von Arbeitslösungen und Medikamenten (GSK-Granulat) -haltigem Serum zur Verfügung. Darüber hinaus beschreibt dieser Artikel die Anwendung von GSK-Granulat in einem OVX-induzierten osteoporotischen Mausmodell und GSK-Granulat-haltigem Serum für In-vitro-Osteoclastogenese/Osteoblastogenese.

GSK-Granulat besteht aus mehreren Kräutern13,14 und kann leicht in Derinline gelöst werden. Daher dient Saline als Fahrzeug. Scheinoperierte Mäuse (Sham) und OVX-Mäuse wurden das gleiche Volumen an Salin verabreicht wie die mit Granulat verabreichten Mäuse. Die Äquivalentdosen von GSK-Granulat für die Maus wurden auf der Grundlage der Meeh-Rubner-Gleichung15berechnet. Diese Gleichung hat nicht nur den Vorteil, sichere Dosierungen zu erhalten, sondern garantiert auch pharmakologische Effekte15. Die drei Dosierungen von GSK-Granulat wurden wie folgt erzeugt: (1) GSKL: OVX + niedrig dosierte GSK-Granulate, 2 g/kg/Tag. (2) GSKM: OVX + mitteldosiertes GSK-Granulat, 4 g/kg/Tag. (3) GSKH: OVX + hochdosiertes GSK-Granulat, 8 g/kg/Tag. Mäuse in den GSKL-, GSKM- und GSKH-Gruppen wurden intragastrisch mit GSK-Granulat verabreicht. Als Positivkontrolle wurde beispielsweise Calciumcarbonat (600 mg/Tablette) mit Vitamin D3 (125 internationale Einheit/Tablette) in einem ausgereiften und vermarkteten Produkt (z. B. Caltrat [CAL]) zur Behandlung und Vorbeugung von Osteoporose verwendet.

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Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Shanghai University of TCM (SZY201604005) durchgeführt.

1. Vorbereitung und Verwaltung der GSK-Arbeitslösung

  1. Berechnen Sie die äquivalenten Dosen von GSK-Granulat für die Maus.
    1. Berechnen Sie die Körperoberfläche basierend auf der Meeh-Rubner-Gleichung15: Körperoberfläche = K x (Körpergewicht2/3)/1000, wobei die K-Werte 10,6 für den Menschen und 9,1 für die Maus sind. Geht man von einem menschlichen Körpergewicht von 70 kg aus, dann die Körperoberfläche des Menschen (m2) = 10,6 x (702/3)/1000 = 1,8 m2. Bei einem Mauskörpergewicht von 20 g (0,02 kg; z.B. 1 Monat alt, weiblich, C57/BL6), dann Mauskörperoberfläche (m2) = 9,1 x (0,022/3)/1000 = 0,0067 m2.
    2. Berechnen Sie auf der Grundlage der berechneten Körperoberfläche das Körpertransformationsverhältnis für Mensch und Maus. Mensch: 70 kg/1,8 m2 = 39. Maus: 0,02 kg/0,0067 m2 = 3. GSK-Granulat = 20 g/70 kg x 39/3 = 3,72 g/kg bei 4 g/kg.
    3. Berechnen Sie auf Der Grundlage eines Körpergewichts von 20 g pro Maus die äquivalente Dosierung für die Maus: 4 g/kg x 0,02 kg = 0,08 g.
    4. Berechnen Sie drei Äquivalentdosen von GSK-Granulat auf der Grundlage von 20 Mäusen pro Gruppe und einer Intervention von 3 Monaten (90 Tage): (1) GSKL (OVX + niedrig dosierte GSK-Granulat [2 g/kg/Tag]): 0,04 g Maus/Tag x 20 Mäuse x 90 Tage = 72 g. (2) GSKM (OVX + mitteldosiertes GSK-Granulat [4 g/kg/ Tag]): 0,08 g Maus/Tag x 20 Mäuse x 90 Tage = 144 g. (3) GSKH (OVX + hochdosiertes GSK-Granulat [8 g/kg/Tag]): 0,12 g Maus/Tag x 20 Mäuse x 90 Tage = 216 g.
      HINWEIS: Bereiten Sie zusätzliche 20 % des GSK-Granulats in der Praxis vor, um den Verlust auszugleichen.
  2. Berechnen Sie das Volumen des GSK-Granulats pro Maus basierend auf dem Körpergewicht15: z.B. Volumen (V) = 0,24 ml/Maus/Tag.
    HINWEIS: Das Volumen für die intragastrische Verabreichung für die Maus beträgt 0,12 ml/10 g.
  3. Wiegen Sie 10 Tage im Wert von drei Dosen GSK-Granulat. Wiegen Sie 8 g, 16 g und 24 g GSK-Granulat und dienen als GSKL, GSKM und GSKH.
  4. Berechnen Sie die Äquivalentdosis von Calciumcarbonat mit Vitamin D3 (CAL) für die Maus auf der Grundlage der Meeh-Rubner-Gleichung15 wie in den Schritten 1.1.1 und 1.1.2: CAL-Dosierung = 2 Tablette/70 kg x 39/3 = 0,372 Tabletten/kg bei 0,4 Tabletten/kg.
  5. Berechnen Sie auf der Grundlage eines Körpergewichts von 20 g pro Maus (z. B. 1 Monat alt, weiblich, C57/BL6) die äquivalente Dosierung von CAL für die Maus: 0,4 Tabletten/kg x 0,02 kg = 0,008 Tablette. Berechnen Sie dann die Äquivalentdosis von CAL basierend auf 20 Mäusen pro Gruppe und einer Intervention, die 3 Monate (90 Tage) dauert: 0,008 Tabletten x 20 x 90 = 14,4 Tabletten. Wiegen Sie 10 Tage CAL (1,6 Tabletten).
  6. auflösung
    1. 8 g GSK-Granulat in ein 50 ml-Rohr geben. 48 ml Saline hinzufügen und Rohr schütteln, um sich vollständig aufzulösen.
      HINWEIS: Der Standard für die vollständige Auflösung ist das Fehlen von Sedimenten. Die vollständige Auflösung kann weiter bestätigt werden, wenn eine Gavage-Nadel die Arbeitslösung aufstellen und dann reibungslos vertreiben kann.
    2. Wiederholen Sie Schritt 1.5.1 mit 16 g und 24 g GSK-Granulat.
    3. Legen Sie 1,6 Tabletten (10 Tage Wert) von CAL in ein 50 ml Rohr. 48 ml Saline hinzufügen und Rohr schütteln, um sich vollständig aufzulösen.
      HINWEIS: Die Arbeitslösungen können bei -4 °C gelagert und alle 10 Tage vorbereitet werden.
  7. Intragastrische Verabreichung
    1. Greifen Sie die Rückseite der Maus (1 Monat alt, weiblich, C57/BL6) mit der Maus nach vorne und stellen Sie sicher, dass sie fest in dieser Position bleibt. Halten Sie die Maus vor der Verabreichung für 2 x 3 min ruhig.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Forscher die Vorderseite der Maus deutlich sehen kann. Tragen Sie Handschuhe, um Mausbisse zu verhindern, vor allem für neue Forscher.
    2. Die Gavage-Nadel (Größe: #12, 40 mm) in die Arbeitslösung des GSK-Granulats geben und 0,24 ml der Arbeitslösung ziehen.
    3. Setzen Sie die Gavage-Nadel durch eine Seite ihres Mundes in die Maus, bis die Gavage-Nadel den Magen erreicht.
      HINWEIS: Um zu bestätigen, dass die Gavage-Nadel den Magen erreicht hat: (1) Die Gavage-Nadel trifft auf das Gefühl des Widerstands. In der Zwischenzeit zeigt die Maus die Wirkung des Schluckens, bevor die Gavage-Nadel die physische Verengung der Speiseröhre passiert. (2) Etwa 0,5 ml der Arbeitslösung in die Maus injizieren und 1 min warten. Wenn es keine Lösung aus der Maus kommt, bedeutet dies, dass die Gavage-Nadel den Magen erreicht hat.
    4. Injizieren Sie die Arbeitslösung von GSK-Granulat (0,24 ml/Maus) in den Magen und ziehen Sie dann die Gavage-Nadel heraus. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück.
    5. Wiederholen Sie Schritt 1.6.4 mit der CAL-Lösung und injizieren Sie 0,24 ml CAL-Lösung pro Maus.
      HINWEIS: Das Volumen der CAL-Lösung wird wie in Schritt 1.2 berechnet.

2. Micro-CT-Scannen

  1. T ibia Ernte und Zubereitung
    1. Intraperitoneal anästhesieren Maus mit 300 ml/100 g 80 mg/kg Ketamin am Tag nach der 90-tägigen Intervention. Verwenden Sie eine Nadelprise der Zehen, um zu bestätigen, ob die Maus vollständig beästhetisiert ist. Keine Antwort deutet auf eine erfolgreiche Anästhesie hin. Dann töten Sie die Maus mit Zervix-Dislokation.
    2. Fixieren Sie die Maus mit den Armen und Beinen auf Schaum mit Tacks.
    3. Schneiden Sie die Haut mit Schere (Größe: 8,5 cm) und Pinzette (Größe: 10 cm) der Beine vom proximalen bis zum distalen Ende ab und ernten Sie tibias.
    4. Die Tibias sofort in 70% Ethylalkohol geben und 3 Mal waschen.
  2. Die linke Tibia der Maus mit Schwammschaum umwickeln und in ein Probenrohr (35 mm Durchmesser, 140 mm Länge) geben.
    HINWEIS: Die lange Achse der Probe sollte zusammen mit der des Probenrohrs sein. Stellen Sie sicher, dass das proximale Ende der Tibia nach oben zeigt.
  3. Ausführen der Micro-CT 80 Scanmaschine
    1. Starten Sie die Micro-CT 80 Scanmaschine bei Raumtemperatur.
    2. Stellen Sie das Probenrohr in micro-CT 80 ein und starten Sie den Querschnittsscan mit den folgenden Scanparametern: Pixelgröße 15,6 m, Röhrenspannung 55 kV, Röhrenstrom 72 a, Integrationszeit 200 ms, räumliche Auflösung 15,6 m, Pixelauflösung 15,6 m und Bildmatrix 2048 x 2048.
      HINWEIS: Der Cancellousknochen unterscheidet sich durch Vorscannen vom kortikalen Knochen. Der Scanbereich der Tibia ist definiert als der cancellous Knochenbereich von 5 mm unterhalb des Tibialplateaus bis zum distalen Ende.
  4. Quantifizierung des Knochenparameters
    1. Nach Abschluss des Querschnittsscans erhalten Sie die Bilder der linken Tibias.
    2. Legen Sie den Dichteschwellenwert auf 245 bis 1000 fest. Verwenden Sie das Mikro-CT-Evaluierungsprogramm V6.6, um die folgenden Knochenparameter zu messen: Knochenmineraldichte (BMD), Knochenvolumen über Gesamtvolumen (BV/TV), trabekuläre Knochenzahl (Tb.N), trabekuläre Knochendicke (Tb.Th) sowie Knochen-Trabekularknochen-Trennung ( Tb.Sp).

3. Vorbereitung von Blutserum für In-vitro-Experimente

  1. berechnung
    1. Berechnen Sie auf der Grundlage eines Körpergewichts der Ratte von 0,2 kg (1 Monat alt, weiblich, Sprague-Dawley) die Dosierung von GSK-Granulat: menschliche Dosierung/Tag x Körpergewicht der menschlichen x K/Körpergewicht der Ratte = 20 g/70 kg/Tag x 70 kg x K (K = 0,018) /0,2 kg = 2 g/kg/Tag.
      HINWEIS: K ist der pharmakologische Transformationskoeffizient zwischen Mensch und Maus15 (K = 0,018).
    2. Wiederholen Sie Schritt 3.1.1 und berechnen Sie die folgenden Dosierungen.
      1. Berechnen Sie die Dosierung von GSKL: 10 g/70 kg/Tag x 70 kg x K/0,2 kg = 1 g/kg/Tag.
      2. Berechnung der Dosierung von GSKM: 20 g/70 kg/Tag x 70 kg x K/0,2 kg = 2 g/kg/Tag.
      3. Berechnen Sie die Dosierung von GSKL: 40 g/70 kg/Tag x 70 kg x K/0,2 kg = 4 g/kg/Tag.
      4. Berechnen Sie die Dosierung von CAL: 2 Tabletten /70 kg/Tag x 70 kg x K/0,2 kg = 0,2 Tabletten/kg/Tag.
    3. Berechnen Sie die Gesamtdosis von GSK-Granulat und CAL.
      1. Berechnen Sie die Gesamtdosis für GSKL: 1 g/kg/Tag x 0,2 kg x 6 Ratten x 3 Tage = 3,6 g.
      2. Berechnen Sie die Gesamtdosis für GSKM: 2 g/kg/Tag x 0,2 kg x 6 Ratten x 3 Tage = 7,2 g.
      3. Berechnen Sie die Gesamtdosis für GSKH: 4 g/kg/Tag x 0,2 kg x 6 Ratten x 3 Tage = 14,4 g.
      4. Berechnen Sie die CAL-Dosierung = 0,2 Tabletten/kg/Tag x 0,2 kg x 6 Ratten x 3 Tage = 0,72 Tabletten.
        HINWEIS: Für die Herstellung von 100 ml Kulturmedium (20% GSK-Granulat-haltiges Serum) werden insgesamt 10 ml GSK-Granulat-haltiges Serum benötigt. Es wird erwartet, dass jede Ratte (6 Ratten/Gruppe) nach der Zentrifugation 1,5 x 2 ml GSK-Granulat-haltiges Serum liefert.
    4. Berechnen Sie das Volumen des Pro-Ratten-Granulats aufderte GSK-Granulat auf der Grundlage des Körpergewichts15: z. B. Volumen (V) = 2 ml/Ratte/Tag.
      HINWEIS: Das Volumen für die intragastrische Verabreichung bei Ratten beträgt 0,1 ml/10 g.
  2. Wiegen Sie 3 Tage im Wert von drei Dosen GSK-Granulat. Wiegen Sie 3,6 g, 7,2 g und 14,4 g GSK-Granulat und dienen als GSKL, GSKM und GSKH. Wiegen Sie 0,72 Tablette für die CAL-Gruppe.
  3. 7,2 g GSK-Granulat in ein 50 ml-Rohr geben. 36 ml Saline hinzufügen und Rohr schütteln, um sich vollständig aufzulösen. Wiederholen Sie dies mit 3,6 g und 14,4 g GSK-Granulat.
  4. Wiederholen Sie Abschnitt 1.6 für die intragastrische Verabreichung mit 2 ml GSK-Arbeitslösung.
    HINWEIS: Verabreichen Sie das gleiche Volumen an Saline (2 ml pro Ratte) zur Herstellung von Serum und dient als leere Kontrollgruppe für In-vitro-Assays.
  5. Zubereitung des GSK-haltigen Serums
    1. Intraperitoneal anästhesieren die Ratten mit 300 ml/100 g 80 mg/kg Ketamin 1 h nach der letzten Verabreichung von GSK-Granulat. Verwenden Sie eine Nadelprise der Zehen, um zu bestätigen, ob die Ratte vollständig beäschend ist. Keine Antwort deutet auf eine erfolgreiche Anästhesie hin.
    2. Setzen Sie den Bauch nach dem Einschneiden der Haut und des Peritoneums mit einer geraden Schere auf den Boden des Thorax von Ratten aus.
      HINWEIS: Das chirurgische Instrument muss vor der Anwendung bei hohen Temperaturen und hohen Drücken sterilisiert werden. Der Operationsbereich muss während der Blutentnahme mit 70% Ethanol sterilisiert werden.
    3. Entfernen Sie das Bindegewebe der Bauchaorta mit Gewebepapier, um das Gefäß deutlich zu belichten.
    4. Mit einer 10 ml, 22 G Spritze Blut aus der Bauchaorta ziehen. Entfernen Sie dann die Nadel und übertragen Sie das Blut in ein 15 ml steriles Rohr. In der Regel können 6-8 ml Blut von einer Ratte erhalten werden.
      HINWEIS: Jede Ratte muss beim Blutziehen am Leben erhalten bleiben. Ein Indikator ist, dass die Bauchaorta pulsiert, wenn die Ratte am Leben ist. Die Ratte ist nach dem Blutziehen tot.
    5. Halten Sie die Röhre bei Raumtemperatur 30 bis 60 min aufrecht, bis das Blut in der Röhre geklont wird. Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 x 600 x g für 20 min. Übertragen Sie den gesamten Überstand (Serum) von einer Gruppe (6 Ratten) auf eine 50 ml sterile Röhre und schütteln, um zu mischen.
    6. Inaktivieren Sie das Serum, indem Sie 30 min in einem 56 °C-Wasserbad inkubieren. Filtern Sie das Serum mit einem hydrophilen Polyethersulfonspritzenfilter im Porenformat. Bei -80 °C für den langzeitigen Einsatz (weniger als 1 Jahr) lagern.
      HINWEIS: Das gefilterte Serum kann für In-vitro-Osteoclastogenese und Osteoblastogenese verwendet werden.
  6. bewerbung
    1. In-vitro-Osteoclastogenese
      1. Verdünnen Sie die drei Dosierungen des GSK-haltigen Serums (GSKL, GSKM, GSKH) im Verhältnis 1:4 mit dem minimalen Eagle-Medium (-MEM), das L-Glutamin, Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside enthält.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die endige Konzentration von GSK-haltigem Serum für In-vitro-Osteoclastogenese und Osteoblastogenese 20 % beträgt.
      2. Fügen Sie das verdünnte GSK-haltige Serum (200 L/Well) von Schritt 3.6.1.1 zu Knochenmarkmakrophagen (BMMs) von 4-6 Wochen alten C57BL/6-Mäusen für Osteoclastogenese hinzu und stimulieren BMMs mit Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF, 10 ng/mL) und Rezeptoraktivator für Kernfaktor-B-Ligand (RANKL, 100 ng/ml) wie zuvor beschrieben2.
    2. In-vitro-Osteoblastogenese
      1. Wiederholen Sie Schritt 3.6.1.1.
      2. Fügen Sie das verdünnte GSK-haltige Serum (2 ml/well) zu den mesenchymalen Knochenstammzellen (BMSCs) von 4-6 Wochen alten C57BL/6-Mäusen hinzu, um Osteoblasten zu erzeugen, wie zuvor beschrieben16.

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Representative Results

Die Ergebnisse des Mikro-CT-Scans zeigten, dass die OVX-Mäuse im Vergleich zu Saline-Kontrollmäusen einen signifikanten Knochenverlust zeigten (Abbildung 1A). Die Intervention (90 Tage) von GSK-Granulat hat die BMD stark erhöht, insbesondere in der GSKM-Gruppe (Abbildung 1B). Die Knochenstrukturparameter wie BMD, BV/TV, Tb.N und Tb.Th wurden quantifiziert. GSK-Granulatbehandlungen führten zu erhöhten BMD, BV/TV, Tb.N und Tb.Th, verringerten jedoch Tb.Sp (Abbildung1C).

Tartrate-resistente Säurephosphatase (TRAP) Färbung zeigte einen Anstieg der Anzahl der Osteoklasten bei OVX-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen (Abbildung2A). GSK-Granulatbehandlungen verringerten TRAP-positive Osteoklasten im Vergleich zur OVX-Gruppe. Diese Ergebnisse wurden durch die Berechnung des Verhältnisses von TRAP-positiver Fläche zu trabekulärer Knochenoberfläche (OCs/BS%) bestätigt. und das Verhältnis von Osteoklastzahl zu Knochenbereich (OCs/mm2). Diese quantitativen Ergebnisse zeigten eine signifikante Abnahme der Anzahl der Osteoklasten in GSK-Gruppen im Vergleich zur OVX-Gruppe (Abbildung 2B,C).

Das GSK-Granulat-haltiges Serum wurde Knochenmarkmakrophagen (BMMs) von 4-6 Wochen alten C57BL/6-Mäusen verabreicht, um Osteoklast zu erzeugen, und die Anzahl der Osteoklasten wurde durch TRAP-Färbung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass GSK-Granulat-haltiges Serum die Anzahl der TRAP-positiven Osteoklasten in GSK-Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe verringerte (Abbildung 3A,B).

Alkalische Phosphatase (ALP) Färbung zeigte, dass GSK-Granulat-medikamentöses Serum stimulierende Wirkung auf Osteoblastogenese mit MSCs von C57BL/6-Mäusen ausübte. ALP Färbung zeigte, dass alle drei Gruppen von GSK-Granulat-medikamentösem Serum die Aktivität von ALP erhöht hatten (Abbildung 4A,B) im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Figure 1
Abbildung 1: GSK-Granulat verhindert Knochenverlust bei OVX-induzierten Mäusen. (A) Mäuse wurden 3 Monate lang mit GSK-Granulat behandelt und linke Tibias wurden geerntet, um Mikro-CT-Analysen durchzuführen. Repräsentative dreidimensionale (3D) Rekonstruktionsbilder des trabekulären Knochens der linken Tibias wurden gezeigt. Skalenstab = 0,5 mm. (B) Die Knochenmineraldichte (BMD) wurde gemessen und quantifiziert. (C) Knochenparameter linker Tibias, wie die Trabekularknochenzahl (Tb.N), das Knochenvolumen über das Gesamtvolumen (BV/TV), die trabekuläre Knochendicke (Tb.Th) und die trabekkuläre Knochentrennung (Tb.Sp), die mit der Trabekularknochenstruktur in allen Gruppen zusammenhängt angezeigt wurden. GSKL-, GSKM- und GSKH-Gruppen wurden mit Derincontrol (Con; sham+ saline) und der OVX-Gruppe (n = 6, *P < 0,05, im Vergleich zur Steuerung; *P < 0,05, im Vergleich zu OVX) verglichen. CAL: Calciumcarbonat mit Vitamin D3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: GSK-Granulat unterdrückt die Anzahl der Osteoklasten bei OVX-Mäusen. (A) TRAP-Färbung wurde an Lendenwirbel n3 (L3) durchgeführt, nachdem die GSK-behandelten Mäuse geerntet wurden. Trap-Ergebnisse aus Kontrolle (Schein + Salin), OVX (OVX + Salin), CAL (OVX + Caltrate), GSKL (OVX + Low Dose GSK, 2 g/kg/Tag), GSKM (OVX + mittlere Dosis GSK, 4 g/kg/Tag) und GSKH (OVX + High Dose GSK, 8 g/kg/Tag) wurden gemessen und analysiert. Maßstabsleiste = 100 m (obere Bilder) oder 50 m (untere Bilder). (B) Quantifizierung der osteoklastbedeckten Oberfläche über die Knochenoberfläche. (C) Osteoklastennummer. Die Werte wurden als mittlerer Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt. *P < 0,05, OVX versus Steuerung (Con); *P < 0.05, die Gruppen von CAL oder GSKL/GSKM/GSKH im Vergleich zur OVX-Gruppe. Alle Assays wurden mit mindestens 3 Mäusen wiederholt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: GSK-Granulat-Medizinserum verringert die Osteoclastogenese aus Knochenmarkmakrophagen (BMMs). (A) BMMs von C57BL/6-Mäusen (4 bis 6 Wochen alt) wurden geerntet und mit M-CSF (10 ng/mL) und RANKL (100 ng/mL) (Steuerung), M-CSF und RANKL plus GSK oder CAL-Medizinseren kultiviert. Die Osteoclastogenese wurde an Tag 4 bis 6 durch TRAP-Färbung beurteilt. Skalenbalken = 100 m. (B) Die Zahl der Osteoklasten wurde quantifiziert. *P < 0.05, die Gruppen von GSKL/GSKM/GSKH versus Steuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: GSK-Granulat-medikamentöses Serum fördert die Osteoblastogenese. (A) Knochenmesenchymale Stammzellen (MSCs) von C57BL/6-Mäusen (4 x 6 Wochen alt) wurden isoliert und mit gSK- oder CAL-medikamentiertem Serum behandelt. Alp-Färbung wurde an Tag 7 durchgeführt, um Osteoblastogenese zu bewerten. Skalenbalken = 100 m. (B) Die Zahl der Osteoblasten wurde quantifiziert. *P < 0.05, die Gruppen von CAL oder GSKL/GSKM/GSKH versus Steuerung. Alle Assays wurden mit mindestens 3 Mäusen oder 3 Mal wiederholt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Granulat von TCM-Agenten sind eine der gemeinsamen Entscheidungen für Formulierungen oder Rezepte geworden. GSK-Granulat besteht aus mehreren pflanzlichen Arzneimitteln auf der Grundlage klinischer Erfahrungen oder der TCM-Theorie, und sie üben bessere heilende Effekte mit weniger Nebenwirkungen4. Im Vergleich zur Wasserabkochung haben die Granulate folgende Vorteile: guter Geschmack, Lieferkomfort, Langzeitlagerung, Standardprotokoll und konsistente Heileffekte sowie höhere Produktivität. Derzeit sind Granulate eine der am häufigsten verwendeten Apothekenformationen in TCM. Die zugrunde liegenden Mechanismen pharmakologischer Wirkungen werden jedoch noch selten untersucht. Es ist notwendig, die kritischen Schritte bei der Herstellung von Granulaten zu bestimmen, um die zugrunde liegenden pharmakologischen Mechanismen zu untersuchen.

In den letzten Jahrzehnten, eine oder mehrere repräsentative wirksame Komponenten aus der Kräutermedizin wurden in der Regel verwendet, um molekulare Assays und pharmakologische Ergebnisse aufgrund ihrer strukturellen Klarheit durchzuführen. Viele Untersuchungen wurden durchgeführt, um die heilende Wirkung mit wirksamen Komponenten aus TCM-Kräutern5,6,7zu verstehen. Es ist jedoch immer noch schwierig zu imitieren, was bei einem Patienten aufgrund der komplexen Umgebung passieren wird, mit vielen effektiven Komponenten, die zusammenarbeiten. Um dieses Problem zu lösen, können Untersuchungen mit Granulaten pharmakologische Prozesse untersuchen und sind eine Wahl bei der Durchführung molekularer Studien im Vergleich zu Untersuchungen mit wirksamen Komponenten.

Die Vorbereitung von Arbeitslösungen für Granulate umfasst vier grundlegende Schritte. Der erste Schritt ist die Auflösung. Granulatwird üblicherweise nach Rühren in Derinline gemischt, um sich vor weiteren Untersuchungen vollständig aufzulösen. Die Menge und Eigenschaft des Granulats beeinflusst die Zeit und Stabilität des Granulats während des Auflösungsprozesses. Die Variation der Auflösungszeit und Stabilität hängt von den Kräutern ab, aufgrund ihrer physikalischen, chemischen und pharmakologischen Eigenschaften17. Richtiges Schütteln und höhere Temperatur fördern und gewährleisten in der Regel die vollständige Auflösung des Granulats. Der nächste Schritt ist die Konzentration. Das richtige Volumen der Gavage-Verabreichung für Tiere wird sorgfältig geprüft und wird durch das Volumen der Arbeitslösung bestimmt. Orale Gavages bei hohen Konzentrationen, wie 10 ml/kg oder mehr, können zu mehreren absorptionsbedingten Problemen führen. Ein häufiges Problem ist das schnelle Rangieren der Arbeitslösung von Granulat in das Zwölffingerdarm. Andere Probleme, wie Aspirationspneumonie, aufgrund des passiven Rückflusses der Arbeitslösung von Granulat in die Speiseröhre, werden ebenfalls beobachtet18. Filtration ist der dritte Schritt, der der Gavage-Nadel hilft, das Volumen zu verringern und verhindert, dass sie mit Kräutergranulat verstopft wird, und die Verdauung von Granulat enthaiert. Der vierte Schritt ist die Speicherung. Die Lagerung von Arbeitslösungen von Granulaten bei niedriger Temperatur (-20 °C) garantiert bessere Ergebnisse.

Der Ansatz zur Berechnung der bioäquivalenten Dosis des Tieres ist wichtig, um die Auswirkungen von Granulat in der Praxis der TCM zu bestimmen. Das Körpergewicht (mg/kg) und die Arten werden häufig berücksichtigt. Die Körperoberfläche (mg/m2 ) wird häufig zur Berechnung19 verwendet, da die Stoffwechselrate mit der Größe des einzelnen Tieres zusammenhängt. Es ist vernünftig, sowohl die Körperoberfläche als auch das Körpergewicht zu berücksichtigen, und daher wurde die Meeh-Rubner-Gleichung verwendet, die in in in vivo-Untersuchungen in pharmakologischen Studien19,20üblich ist.

Für die arzneimittelhaltige Serumzubereitung werden verschiedene Arten von Tieren ausgewählt, wie Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten und Mäuse. Für In-vivo-Untersuchungen wird dieselbe Art bevorzugt. Ratten wurden ausgewählt, weil sie nicht nur mehr Serum als Mäuse liefern, sondern auch in Bezug auf die Evolution näher an Mäusen sind als andere Tiere. Die Äquivalentdosis in vivo (Ratte: 7-fach der Äquivalentdosis) und die klinische Anwendung für Patienten werden ebenfalls empfohlen. Das Zehnfache der Äquivalentdosis der mit Serum bereitgestellten Tiere wird für In-vivo-Untersuchungen nicht häufig angewendet, da behandelte Zellen oder Organe zu potenziellen toxischen Reaktionen führen können21. Methoden wie Injektion, Hautverabreichung und Inhalation sind die häufig verwendeten Verabreichungsverfahren in Übereinstimmung mit In-vivo-Verabreichungen. In der vorliegenden Studie wurde die orale Verabreichung durch Gavage-Nadeln gewählt. Die Häufigkeit der Granulatadministration variiert von ein bis zweimal pro Tag, und die Interventionsdauer beträgt 3 bis 14 Tage. Die endgültige Blutentnahme erfolgt in der Regel innerhalb von 2 h nach der letzten Verabreichung22,23, wenn die Konzentration von Granulat im Blut relativ stabil ist und auf dem Höchstenwert nach einer früheren Studie24.

Arzneimittelhaltiges Serum für In-vitro-Assays vor der Anwendung ist immer noch umstritten. Einige Forscher glauben, dass es zu unerwarteten Reaktionen oder Nebenwirkungen führen kann, die die Ergebnisse wegen des Vorhandenseins von zahlreichen aktiven Komponenten im Serum beeinflussen, einschließlich Enzyme, Hormone, Antikörper, und ergänzt25. Einige Forscher sind jedoch der gegenteiligen Meinung, dass aktive Komponenten auch durch den Inaktivierungsprozess entfernt werden könnten26. Um einen Mittelweg zu erreichen, wurde das Serum in dieser Studie vor der Inkubation in einem Wasserbad bei 56 °C für 30 min inaktiviert. Darüber hinaus wurde eine leere Serumgruppe aufgenommen, in der das Serum von mit Saline behandelten Tieren verwendet wird, um mögliche Nebenwirkungen auszuschließen. Daher kann arzneimittelhaltiges Serum als mögliche Methode zur Untersuchung der pharmakologischen Mechanismen oder therapeutischen Ergebnisse dienen.

Im Vergleich zu ähnlichen Methoden hat das Protokoll hier folgende Vorteile: (1) Vollständigkeit. Sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Methoden werden gleichzeitig eingesetzt und können sich gegenseitig in pharmakologischen Wirkungen unterstützen. (2) Eignung. Nur Mäuse und Ratten sind eingeschlossen, weil sie eng miteinander verwandt sind. (3) Wiederholbarkeit. Sowohl Mäuse als auch Ratten sind leicht zu niedrigen Kosten zu kaufen, und die Methoden können leicht wiederholt werden. (4) Niedrige Kosten. Das OVX-induzierte osteoporotische Mausmodell ist häufig verwendet und zuverlässig27,28 und kann leicht hergestellt oder gekauft werden. Daher sind die Protokolle hier besser geeignet im Vergleich zu anderen Methoden zur Untersuchung der pharmakologischen Wirkungen der Kräutermedizin, wie Granulat.

Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen für die Protokolle mit GSK-Granulat. Erstens wurden drei Dosierungen verabreicht, obwohl das Granulat keine signifikante dosisabhängige Tendenz für In-vivo-Untersuchungen zeigte. Der Grund kann sein, dass Dosierungen für Tierstudien nicht empfindlich sind und die Interventionszeit nicht lang genug ist, was weitere Tests erfordert. Als nächstes ist eine längere Interventionszeit für parallele In-vitro-Untersuchungen erforderlich. Das medikamentenhaltige Serum kann, obwohl inaktiviert, nach längerer Intervention Nebenwirkungen verursachen. Drittens wird für die Tierverabreichung nur ein Volumen an Arbeitslösungen verwendet, das in künftigen Studien geändert werden kann. Schließlich können Tierarten, die für die Herstellung von medikamentenhaltigem Serum ausgewählt wurden, und die Verabreichungsroutinen geändert werden und werden in weiteren Studien getestet.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Studie wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 und 81330085), das Programm für Innovatives Team, Ministerium für Wissenschaft und Technologie chinas (2015RA4002 bis WYJ), das Programm für Innovatives Team, Bildungsministerium Chinas (IRT1270 bis WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017ZZ01010 bis WYJ), Dreijahre Aktion zur Beschleunigung der Entwicklung des Plans für traditionelle chinesische Medizin (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 bis WYJ) und nationalen wichtigsten Forschungsentwicklungsprojekte (2018YFC1704302).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Hyclone
laboratories		 SH30265.018 For cell culture
β-Glycerophosphate Sigma G5422 Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL) Wyeth L96625 Animal interventation
C57BL/6 mice SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Ainimal preparation
Dexamethsome Sigma D4902
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438 Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Sangon Biotech 60-00-4 Samples treatmnet
Fetal bovine serum Gibco FL-24562 For cell culture
Gushukang granules kangcheng companyin china Z20003255 Herbal prescription
Light microscope Olympus BX50 Olympus BX50 Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate Sigma A8960-5G Osteoblastogenesis
Microscope Leica DMI300B Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF Peprotech AF-300-25-10 Osteoclastogenesis
Μicro-CT Scanco
Medical AG		 μCT80 radiograph microtomograph Bone Structural analsysis
RANKL Peprotech 11682-HNCHF Osteoclastogenesis
Sprague Dawley SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT TRAP staining

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References

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Medizin Ausgabe 147 Traditionelle Chinesische Medizin Gushukang-Granulat medikamentenhaltiges Serum Serumpharmakologie Osteoclastogenese ovariectomisierte Mäuse Osteoblastogenese in vivo in vitro
Vorbereitung von Gushukang (GSK) Granulat en for In Vivo und In Vitro Experiments
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Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang, Y., Shu, B., Zhao, D. Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59171, doi:10.3791/59171 (2019).

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