Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Utarbeidelse av Gushukang (GSK) granulat for in vivo og in vitro eksperimenter

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59171
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for å utarbeide en fungerende løsning av Gushukang granulater for dyrestudier og GSK granule som inneholder serum for in vitro eksperimenter. Denne protokollen kan anvendes på farmakologiske undersøkelser av urte medisiner, samt resepter for både in vivo-og in vitro-eksperimenter.

Abstract

Tradisjonell kinesisk urtemedisin spiller en rolle som en alternativ metode i behandling av mange sykdommer, slik som postmenopausale osteoporose (POP). Gushukang (GSK) granulat, en markedsført resept i Kina, har bein-beskyttende effekter i behandling av POP. Før administrering til kroppen, en standard forberedelse prosedyre er vanligvis nødvendig, som har som mål å fremme frigjøring av aktive bestanddeler fra rå urter og forsterke de farmakologiske effektene samt terapeutiske utfall. Denne studien foreslår en detaljert protokoll for å bruke GSK granulater i in vivo og in vitro eksperimentelle analyser. Forfatterne først gi en detaljert protokoll for å beregne dyret-passende dosering av granulat for in vivo etterforskning: veiing, oppløsning, lagring og administrasjon. For det andre beskriver denne artikkelen protokoller for Micro-CT-skanning og måling av Ben parametre. Eksempel forberedelser, protokoller for å kjøre Micro-CT-maskinen og kvantifisering av Ben parametre ble evaluert. Tredje, serum-inneholdende GSK granulater er forberedt, og medikament som inneholder serum er ekstrahert for in vitro osteoclastogenesis og osteoblastogenesis. GSK granulater ble intragastrically administreres to ganger per dag til rotter i tre påfølgende dager. Blod ble deretter samlet inn, sentrifugert, deaktivert og filtrert. Til slutt ble serum fortynnet og brukt til å utføre osteoclastogenesis og osteoblastogenesis. Protokollen som er beskrevet her kan betraktes som en referanse for farmakologiske undersøkelser av urte reseptbelagte medisiner, slik som granulater.

Introduction

Tradisjonell kinesisk medisin (TCM) er en av de viktigste komplementære og alternative tilnærminger til behandling av osteoporose1,2. Vann avkok er den grunnleggende og mest brukte form av formelen3. Men ulempene finnes også: dårlig smak, ulempe for befordring, kort holdbarhet og inkonsekvent protokoller, begrense bruker så vel som helbredende effekter. For å unngå de ovennevnte ulempene så vel som å forfølge bedre effekter, ble granulater utviklet og har vært mye brukt4. Selv om mange studier har utforsket farmakologiske mekanismer av en eller flere effektive komponenter fra granulater5,6,7, den eksakte mekanismer og underliggende farmakologiske prosesser er fortsatt vanskelig å identifisere. Dette er fordi for mange effektive komponenter fra en granule kan samtidig utøve lignende eller motsatte effekter4. Derfor vil utviklingen av en standard protokoll for å forberede granulater før levering til kroppen ikke bare ha en stor innvirkning på de terapeutiske resultatene, men er også nødvendig for både in vivo-og in vitro-analyser.

Videre er de helbredende virkningene av granulater i klinikken vanskelig å bekrefte og nøyaktig identifisere ved hjelp av in vitro eller ex vivo studier, noe som skaper en utfordring fordi de farmakologiske mekanismene er for kompliserte. For å løse dette ble utarbeidelsen av medikament som inneholder serum først foreslått av Tashino i 1980-årene8. Fra da av, mange forskere anvendt legemiddel som inneholder serum til urtemedisin, inkludert granulater9,10,11. For øyeblikket betraktes valget av medikament som inneholder serum for in vitro-undersøkelser som en strategi som etterligner fysiologiske tilstander.

Gushukang (GSK) granulater ble utviklet for å behandle postmenopausale osteoporose (POP) basert på klinisk praksis i lys av teorien om TCM. GSK granulater hindre bein tap i ovariectomized (OVX) mus in vivo, hemme osteoclastic bein resorpsjon, og stimulere osteoblastaktivitet beindannelse4. Følgelig Li et al.12 fant at GSK granulater har bein beskyttende effekter i OVX mus ved å forbedre aktivitetene til kalsium reseptor å stimulere beindannelse. For å bekrefte Ben-beskyttende effekter samt de farmakologiske virkningene av GSK granulater, forfatterne her gir en detaljert prosedyre for utarbeidelse av arbeidsløsninger og narkotika (GSK granule) inneholder serum. Videre beskriver denne artikkelen anvendelsen av GSK granulater i en OVX-indusert osteoporotiske musemodell og GSK granule-inneholdende serum for in vitro osteoclastogenesis/osteoblastogenesis.

GSK granulater er sammensatt av flere urter13,14 og kan være helt oppløst i saltvann lett. Derfor fungerer saltvann som kjøretøyet. Humbug-opererte mus (Sham) og OVX mus ble administrert samme volum av saltvann som granule-administrerte mus. Tilsvarende doser av GSK granulat for musen ble beregnet basert på Meeh-Rubner ligningen15. Denne ligningen ikke bare har fordelen av å skaffe trygge doser, men også garanterer farmakologiske effekter15. De tre doser av GSK granulater ble generert som følger: (1) GSKL: OVX + lav dose GSK granulater, 2 g/kg/dag. (2) GSKM: OVX + medium-dose GSK granulat, 4 g/kg/dag. (3) GSKH: OVX + høy dose GSK granulater, 8 g/kg/dag. Mus i GSKL, GSKM og GSKH grupper ble intragastrically administrert GSK granulater. Kalsium (600 mg/tablett) med vitamin D3 (125 internasjonal enhet/tablett), for eksempel i et produkt som er moden og markedsført (f.eks. Caltrate [CAL]) for behandling og forebygging av osteoporose, ble brukt som positiv kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de eksperimentelle prosedyrene ble utført med godkjenning av institusjonelle Animal Care og bruk komité i Shanghai University of TCM (SZY201604005).

1. forberedelse og administrering av GSK arbeids løsning

  1. Beregn tilsvarende doser av GSK granulat for mus.
    1. Beregn kroppens overflate basert på Meeh-Rubner ligningen15: Body Surface = K x (kroppsvekt2/3)/1000, der k-verdiene er 10,6 for mennesker og 9,1 for mus. Forutsatt en menneskelig kroppsvekt på 70 kg, deretter menneskekroppen overflate (m2) = 10,6 x (702/3)/1000 = 1,8 m2. Forutsatt en mus kroppsvekt på 20 g (0,02 kg; f. eks, 1 mnd gammel, hunn, C57/BL6), deretter mus Body Surface (m2) = 9,1 x (0,022/3)/1000 = 0,0067 m2.
    2. Basert på den beregnede kroppsoverflaten, beregne kroppen transformere forholdet for menneskelig og mus. Human: 70 kg/1.8 m2 = 39. Mus: 0,02 kg/0.0067 m2 = 3. GSK granule = 20 g/70 kg x 39/3 = 3,72 g/kg ≈ 4 g/kg.
    3. Basert på en kroppsvekt på 20 g per mus, beregne tilsvarende dosering for mus: 4 g/kg x 0,02 kg = 0,08 g.
    4. Beregn tre tilsvarende doser av GSK granulater basert på 20 mus per gruppe og en intervensjon som varer i 3 måneder (90 dager): (1) GSKL (OVX + lav dose GSK granulater [2 g/kg/dag]): 0,04 g mus/dag x 20 mus x 90 dager = 72 g. (2) GSKM (OVX + medium-dose GSK granulater [4 g/kg/ dag]): 0,08 g mus/dag x 20 mus x 90 dager = 144 g. (3) GSKH (OVX + høy dose GSK granulater [8 g/kg/dag]): 0,12 g mus/dag x 20 mus x 90 dager = 216 g.
      Merk: Forbered ytterligere 20% av GSK granulater i praksis for å kompensere for tapet.
  2. Beregn volumet av GSK granule per mus basert på kroppsvekt15: for eksempel volum (V) = 0,24 ml/mus/dag.
    Merk: volumet for intragastrisk administrasjon for mus er 0,12 mL/10 g.
  3. Veie 10-dagers ' verd av tre doser av GSK granulater. Veie 8 g, 16 g, og 24 g av GSK granulater og tjene som GSKL, GSKM, og GSKH, henholdsvis.
  4. Beregn den tilsvarende dosen av kalsium med vitamin D3 (CAL) for mus basert på Meeh-Rubner ligningen15 som i trinn 1.1.1 og 1.1.2: Cal dosering = 2 tablett/70 kg x 39/3 = 0,372 tablett/kg ≈ 0,4 tablett/kg.
  5. Basert på en kroppsvekt på 20 g per mus (f. eks, 1 mnd gammel, hunn, C57/BL6), beregne tilsvarende dosering av CAL for mus: 0,4 tablett/kg x 0,02 kg = 0,008 tablett. Deretter beregne tilsvarende dose CAL basert på 20 mus per gruppe og en intervensjon som varer i 3 måneder (90 dager): 0,008 tablett x 20 x 90 = 14,4 tabletter. Veie 10-dager ' verd av CAL (1,6 tabletter).
  6. Oppløsning
    1. Plasser 8 g GSK granulat i en 50 mL rør. Tilsett 48 mL saltvann og rist røret for å løse opp helt.
      Merk: standarden for fullstendig oppløsning er fraværet av sediment. Fullstendig oppløsning kan bli ytterligere bekreftet hvis en gavage nål kan trekke opp arbeids løsningen og deretter utvise den jevnt.
    2. Gjenta trinn 1.5.1 med 16 g og 24 g av GSK granulater.
    3. Plasser 1,6 tabletter (10-dagers ' verdi) av CAL inn i et 50 mL rør. Tilsett 48 mL saltvann og rist røret for å løse opp helt.
      Merk: arbeids løsningene kan oppbevares ved-4 ° c og tilberedes hver 10.
  7. Intragastrisk administrasjon
    1. Ta tak i baksiden av musen (1 måned gammel, hunn, C57/BL6) med musen vendt fremover og sikre at den holder seg fast i den posisjonen. Hold musen rolig i 2 − 3 min før administrering.
      Merk: Sørg for at forskeren kan tydelig se fronten av musen. Bruk hansker for å hindre mus biter, spesielt for nye forskere.
    2. Plasser gavage nål (størrelse: #12, 40 mm) i arbeids løsningen av GSK granulat og trekke 0,24 mL av arbeids løsningen.
    3. Sett gavage nålen inn i musen gjennom den ene siden av munnen til gavage nålen når magen.
      Merk: for å bekrefte at gavage nålen har nådd magen: (1) gavage nålen møter følelsen av motstand. I mellomtiden, musen viser virkningen av å svelge før gavage nålen passerer den fysiske innsnevring av spiserøret. (2) Injiser ca 0,5 mL av arbeids løsningen i musen og vent i 1 min. Hvis det ikke er noen løsning som kommer ut av musen, betyr dette at gavage nålen har nådd magen.
    4. Injiser arbeids løsningen av GSK granule (0,24 mL/mus) inn i magen og deretter trekke ut gavage nålen. Tilbake musen i buret sitt.
    5. Gjenta trinn 1.6.4 med CAL-løsningen og Injiser 0,24 mL CAL-oppløsning per mus.
      Merk: volumet av CAL-løsningen beregnes som i trinn 1,2.

2. Micro-CT skanning

  1. T ibia høsting og forberedelser
    1. Intraperitonealt bedøve mus med 300 mL/100 g 80 mg/kg ketamin dagen etter 90-dagens intervensjon. Bruk en nål klype tærne for å bekrefte om musen er helt anesthetized. Ingen respons indikerer vellykket anestesi. Deretter drepe musen med cervical forvridning.
    2. Fest musen med både armer og Ben på skum med stifter.
    3. Klipp av huden med saks (størrelse: 8,5 cm) og pinsett (størrelse: 10 cm) av bena fra proksimale til den, og deretter høste tibias.
    4. Umiddelbart sette tibias i 70% etanol og vask for 3 ganger.
  2. Vikle venstre Tibia av musen med svamp skum og legg den i en prøve Tube (35 mm diameter, 140 mm lengde).
    Merk: den lange aksen på prøven skal være sammen med prøve røret. Sørg for at proksimale enden av Tibia peker oppover.
  3. Kjøre Micro-CT 80 skanne maskin
    1. Start Micro-CT 80 skanne maskinen ved romtemperatur.
    2. Sett prøve røret inn i mikro-CT 80 og start kryss-seksjonen skanning med følgende skanning parametere: pixel størrelse 15,6 μm, tube spenning 55 kV, rør nåværende 72 μA, integrering tid 200 MS, romlig oppløsning 15,6 μm, pixel oppløsning 15,6 μm, og bilde matrise 2048 x 2048.
      Merk: cancellous benet skilles fra kortikale benet ved forhåndsskanning. Skanningen området av Tibia er definert som cancellous bein området fra 5 mm under tibial platået til den flate enden.
  4. Kvantifisering av Ben parameter
    1. Når du har fullført skanning på tvers av delen, kan du hente bildene fra venstre tibias.
    2. Sett tetthets terskelen til 245 − 1000. Bruk Micro-CT evalueringsprogrammet V 6.6 for å måle følgende bein parametre: Ben mineral tetthet (BMD), bein volum over total volum (BV/TV), trabekulær bein nummer (TB. N), trabekulær bein tykkelse (Tb.Th), samt bein-trabekulær bein separasjon ( TB. SP).

3. utarbeidelse av blod serum for in vitro eksperimenter

  1. Beregning
    1. Basert på en rotte kroppsvekt på 0,2 kg (1 måned gammel, hunn, Sprague-Dawley), beregne dosering av GSK granule: Human dosering/dag x kroppsvekt av menneskelig x K/kroppsvekt av rotte = 20 g/70 kg/dag x 70 kg x K (K = 0,018)/0,2 kg = 2 g/kg/dag.
      Merk: K er den farmakologiske transformerings koeffisienten mellom menneske og mus15 (k = 0,018).
    2. Gjenta trinn 3.1.1 og beregne følgende doser.
      1. Beregn dosering av GSKL: 10 g/70 kg/dag x 70 kg x K/0.2 kg = 1 g/kg/dag.
      2. Beregn dosering av GSKM: 20 g/70 kg/dag x 70 kg x K/0.2 kg = 2 g/kg/dag.
      3. Beregn dosering av GSKL: 40 g/70 kg/dag x 70 kg x K/0.2 kg = 4 g/kg/dag.
      4. Beregn dosering av CAL: 2 tablett/70 kg/dag x 70 kg x K/0.2 kg = 0,2 tablett/kg/dag.
    3. Beregn den totale dosen av GSK granule og CAL.
      1. Beregn total dose for GSKL: 1 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 rotter x 3 dager = 3,6 g.
      2. Beregn den totale dosen for GSKM: 2 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 rotter x 3 dager = 7,2 g.
      3. Beregn den totale dosen for GSKH: 4 g/kg/dag x 0,2 kg x 6 rotter x 3 dager = 14,4 g.
      4. Beregn CAL dosering = 0,2 tablett/kg/dag x 0,2 kg x 6 rotter x 3 dager = 0,72 tablett.
        Merk: totalt 10 mL GSK granule serum er nødvendig for å fremstille 100 mL kultur medium (20% GSK granule serum). Hver rotte (6 rotter/gruppe) forventes å gi 1,5 − 2 mL GSK granule-inneholdende serum etter sentrifugering.
    4. Beregn volumet av GSK granulat påføres per rotte basert på kroppsvekt15: for eksempel volum (V) = 2 ml/rotte/dag.
      Merk: volumet for intragastrisk administrasjon for rotte er 0,1 mL/10 g.
  2. Veie 3-dager ' verd av tre doser av GSK granulater. Veie 3,6 g, 7,2 g, og 14,4 g av GSK granulater og tjene som GSKL, GSKM, og GSKH, henholdsvis. Veie 0,72 tablett for CAL-gruppen.
  3. Plasser 7,2 g av GSK granulat i et 50 mL rør. Tilsett 36 mL saltvann og rist røret for å løse opp helt. Gjenta dette med 3,6 g og 14,4 g av GSK granulater.
  4. Gjenta avsnitt 1,6 for intragastrisk administrering med 2 mL GSK arbeids løsning.
    Merk: Administrer det samme volumet av saltvann (2 mL per rotte) for å tilberede serum og fungerer som en blank kontrollgruppe for in vitro-analyser.
  5. Fremstilling av GSK-inneholdende serum
    1. Intraperitonealt bedøve rottene med 300 mL/100 g 80 mg/kg ketamin 1 time etter siste administrering av GSK granulater. Bruk en nål hugge av tærne å anerkjenne hvorvidt rotta er absolutt anesthetized. Ingen respons indikerer vellykket anestesi.
    2. Utsette magen til bunnen av thorax av rotter ved hjelp av rett drift saks etter incising huden og peritoneum.
      Merk: det kirurgiske instrumentet må steriliseres ved høye temperaturer og høyt trykk før bruk. Operasjonsområdet må steriliseres med 70% etanol under blodoppsamling.
    3. Fjern bindevevet i abdominal aorta med silkepapir for å avdekke fartøyet klart.
    4. Tegn blod fra abdominal aorta ved hjelp av en 10 mL, 22 G sprøyte. Fjern deretter nålen og overføre blodet til et 15 mL sterilt rør. Vanligvis, 6 − 8 mL blod kan fås fra en rotte.
      Merk: hver rotte må holdes levende når du tegner blod. En indikator er at abdominal aorta pulserer når rotta er i live. Rotta er død etter blodprøve.
    5. Hold slangen oppreist ved romtemperatur i 30 − 60 min til blodet er clotted i slangen. Deretter sentrifuger røret ved 500 − 600 x g i 20 min. overføre alle supernatanten (serum) fra en gruppe (6 rotter) til 1 50 ml sterilt rør og rist for å blande.
    6. Deaktiver serum ved å incubating i et vannbad på 56 ° c i 30 minutter. Filtrer serum med et 0,22-μm-pore-størrelse hydrofile polyetersulfon sprøyte filter. Oppbevares ved-80 ° c for lang tids bruk (mindre enn 1 år).
      Merk: det filtrerte serum kan brukes til in vitro osteoclastogenesis og osteoblastogenesis.
  6. Programmet
    1. Osteoclastogenesis i vitro
      1. Fortynne de tre doser av GSK-inneholdende serum (GSKL, GSKM, GSKH) ved forholdet mellom 1:4 med minimum Eagle ' s medium (α-MEM) som inneholder L-glutamin, ribonucleosides, og deoxyribonucleosides.
        Merk: Sørg for at den endelige konsentrasjonen av GSK-inneholdende serum for in vitro osteoclastogenesis og osteoblastogenesis er 20%.
      2. Tilsett den fortynnede serum som inneholder GSK (200 μL/brønn) fra trinn 3.6.1.1 til benmarg makrofager (BMMs) fra 4 − 6 ukers gamle C57BL/6-mus for osteoclastogenesis og stimulere BMMs med macrophage koloni-stimulerende faktor (M-CSF, 10 ng/mL) og reseptor aktivator for kjernefysisk faktor-KB ligand (RANKL, 100 ng/mL) som tidligere beskrevet2.
    2. Osteoblastogenesis i vitro
      1. Gjenta trinn-3.6.1.1.
      2. Tilsett den fortynnede GSK-inneholdende serum (2 mL/brønn) til bein Mesenchymal stamceller (BMSCs) fra 4 − 6 ukers gamle C57BL/6-mus for å generere osteoblast som tidligere beskrevet16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultater fra mikro-CT-skanning indikerte at OVX-musene viste signifikant tap av bein i forhold til saltvanns mus (figur 1a). Intervensjonen (90 dager) av GSK granulater i stor grad økte BMD, spesielt i GSKM-gruppen (figur 1B). Benstruktur parametrene, for eksempel BMD, BV/TV, TB. N og Tb.Th, ble kvantifisert. GSK granule behandlinger førte til økt BMD, BV/TV, TB. N og Tb.Th, men reduserte TB. SP (figur 1C).

Farging av Tartrate resistent syre fosfatase (TRAP) viste en økning i antall osteoklaster i OVX-mus sammenlignet med kontroll mus (figur 2a). GSK granule behandlinger reduserte TRAP-positive osteoklaster sammenlignet med OVX-gruppen. Disse funnene ble bekreftet ved å beregne forholdet mellom TRAP-positive området til trabekulær bein overflaten (OCs/BS%) og forholdet mellom osteoclast tall og Ben område (OCs/mm2). Disse kvantitative resultatene viste en signifikant reduksjon i antall osteoklaster i GSK-grupper sammenlignet med OVX-gruppen (figur 2b, C).

GSK granule serum ble administrert til benmarg makrofager (BMMs) fra 4 − 6 ukers gamle C57BL/6-mus for å generere osteoclast og antall osteoklaster ble analysert av TRAP farging. Resultatene viste at GSK granule-inneholdende serum reduserte antall TRAP-positive osteoklaster i GSK grupper sammenlignet med kontrollgruppen (figur 3a, B).

Alkalisk fosfatase (ALP) farging viste at GSK granule-medisinsk serum utøvde stimulerende effekter på osteoblastogenesis med MSCs fra C57BL/6 mus. ALP farging viste at alle tre grupper av GSK granule-medisin serum hadde økt aktiviteten til ALP (figur 4a, B) sammenlignet med kontrollgruppen.

Figure 1
Figur 1: GSK granule hindrer bein tap i OVX-indusert mus. (A) mus ble behandlet med GSK granulater i 3 måneder og venstre tibias ble høstet til å utføre Micro-CT analyse. Representative tredimensjonale (3D) rekonstruksjon bilder av trabekulær Ben av venstre tibias ble vist. Scale bar = 0,5 mm. (B) Ben mineral TETTHET (BMD) ble målt og kvantifisert. (C) bein parametre for venstre tibias, slik som trabekulær bein nummer (TB. N), bein volum over total volum (BV/TV), trabekulær bein tykkelse (TB.th), og trabekulær Ben separasjon (TB. SP), knyttet til trabekulær bein strukturen i alle gruppene ble vist. GSKL-, GSKM-og GSKH-grupper ble sammenlignet med kontroll (con; Sham + Saline) og OVX-gruppen (n = 6, *p < 0,05, kontra kontroll; *p < 0,05, kontra OVX). CAL: kalsium med vitamin D3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: GSK granulater undertrykke antall osteoklaster i OVX mus. (A) felle farging ble utført på korsrygg vertebra 3 (L3) etter at GSK-behandlede mus ble høstet. TRAP resultater fra kontroll (humbug + saltvann), OVX (OVX + saltvann), CAL (OVX + Caltrate), GSKL (OVX + lav dose GSK, 2 g/kg/dag), GSKM (OVX + medium dose GSK, 4 g/kg/dag), og GSKH (OVX + høy dose GSK, 8 g/kg/dag) ble målt og analysert. Scale bar = 100 μm (øverste bilder) eller 50 μm (nederste bilder). (B) kvantifisering av osteoclast overflate over bein overflaten. (C) Osteoclast nummer. Verdier ble uttrykt som gjennomsnittet ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). *P < 0,05, OVX versus kontroll (con); *P < 0,05, GRUPPENE av Cal eller GSKL/GSKM/GSKH versus OVX gruppen. Alle analysene ble gjentatt med minst 3 mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: GSK granule medisin-serum avtar osteoclastogenesis fra benmarg makrofager (BMMs). (A) BMMS fra C57BL/6 mus (4 − 6 uke gamle) ble høstet, og kultivert med M-CSF (10 ng/ml) og RANKL (100 ng/ml) (kontroll), M-CSF og RANKL pluss GSK eller Cal medisin serum. Osteoclastogenesis ble vurdert på dag 4 − 6 ved farging av TRAP. Scale bar = 100 μm. (B) antall osteoklaster ble kvantifisert. *P < 0,05, GRUPPENE av GSKL/GSKM/GSKH versus kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: GSK granule-medisin serum fremmer osteoblastogenesis. (A) Bone Mesenchymal stamceller (MSCs) fra C57BL/6-mus (4 − 6 uker gamle) ble isolert og behandlet med GSK eller Cal medisinsk serum. ALP farging ble utført på dag 7 for å vurdere osteoblastogenesis. Scale bar = 100 μm. (B) antall osteoblaster ble kvantifisert. *P < 0,05, GRUPPENE av Cal eller GSKL/GSKM/GSKH versus kontroll. Alle analysene ble gjentatt med minst 3 mus eller 3 ganger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Granulater av TCM-agenter har blitt en av de vanligste valgene for formuleringer eller resepter. GSK granulater er sammensatt av flere urte medisiner basert på kliniske erfaringer eller TCM-teorien, og de utøver bedre helbredende effekter med færre bivirkninger4. Sammenlignet med vann avkok, de granulater har disse fordelene: god smak, praktisk levering, langsiktig lagring, standard protokoll og konsekvent helbredende effekter, samt høyere produktivitet. For tiden er granulater en av de mest brukte apotek formasjonene i TCM. Imidlertid er de underliggende mekanismene for farmakologiske effekter fortsatt sjelden studert. Det er nødvendig å bestemme de kritiske trinnene i utarbeidelsen av granulater for å undersøke de underliggende farmakologiske mekanismene.

I de siste ti årene, en eller flere representative effektive komponenter fra urtemedisin har vanligvis blitt brukt til å utføre molekylære analyser og farmakologiske resultater på grunn av deres strukturelle klarhet. Det er utført mange undersøkelser for å forstå de helbredende virkningene med effektive komponenter fra TCM urter5,6,7. Imidlertid er det fortsatt vanskelig å etterligne hva som vil skje i en pasient på grunn av det komplekse miljøet, med mange effektive komponenter som arbeider sammen. For å løse dette problemet, undersøkelser med granulater kan utforske farmakologiske prosesser og er ett valg i å utføre molekylære studier i forhold til undersøkelser med effektive komponenter.

Utarbeidelse av arbeidsløsninger for granulater inneholder fire grunnleggende trinn. Det første trinnet er oppløsning. Granulater er vanligvis blandet i saltvann etter omrøring for å fullføre oppløse før videre undersøkelser. Mengden og eiendom av granulater påvirker tid og stabilitet av granulater under oppløsning prosessen. Variasjonen i oppløsning tid og stabilitet avhenger av urter, på grunn av deres fysiske, kjemiske og Farmakologiske egenskaper17. Riktig risting og høyere temperatur vanligvis fremme og sikre fullstendig oppløsning av granulater. Det neste trinnet er konsentrasjon. Det riktige volumet av gavage administrasjon for dyr er nøye vurdert og bestemmes av volumet av arbeids løsningen. Orale gavages ved høye konsentrasjoner, som 10 mL/kg eller mer, kan føre til flere absorpsjons relaterte problemer. Rask skifting av arbeids løsningen av granulat i tolvfingertarmen er et vanlig problem. Andre problemer, slik som aspirasjon lungebetennelse, på grunn av passiv reflux av arbeider løsning av granulater i spiserøret, er også observert18. Filtrering er det tredje trinnet, som hjelper gavage nålen å redusere i volum og hindrer den fra å bli tilstoppet med urte granulat, samt hjelpemidler fordøyelsen av granulater. Det fjerde trinnet er lagring. Lagring av arbeidsløsninger av granulater ved lav temperatur (-20 ° c) garanterer bedre utfall.

Tilnærmingen til å beregne dyret bioekvivalente dose er viktig å bestemme effekten av granulater i praktiseringen av TCM. Kroppsvekten (mg/kg) og arter blir ofte vurdert. Kroppens overflateareal (mg/m2) brukes ofte til å utføre beregningen19 fordi metabolic rate er knyttet til størrelsen på den enkelte dyret. Det er sunn fornuft å vurdere både kroppens overflateareal og kroppsvekt, og derfor ble Meeh-Rubner ligningen brukt, noe som er vanlig i in vivo undersøkelser i farmakologiske studier19,20.

Flere typer dyr er valgt for medikament som inneholder serum forberedelser, for eksempel kaniner, marsvin, rotter og mus. For in vivo-undersøkelser foretrekkes de samme artene. Rotter var valgt fordi de ikke alene men også skaffe flere serum enn mus bortsett fra er likeledes nøyere å mus inne pris av utviklingen enn annet dyrene. Dosen tilsvarende i vivo (rotte: 7-fold av tilsvarende dose) og klinisk bruk for pasienter er også anbefalt. Ti ganger tilsvarende dose av serum-forutsatt dyr er ikke vanligvis anvendes for in vivo undersøkelser fordi behandlet celler eller organer kan føre til mulige toksiske reaksjoner21. Metoder som injeksjon, hud administrasjon og inhalasjon er de vanligste administrasjons prosedyrene i henhold til in vivo-administrasjoner. Oral administrering ved gavage nåler ble valgt i denne studien. Den granule administrasjonsfrekvensen varierer fra én gang til to ganger per dag, og perioden for intervensjonen er 3 − 14 dager. Den endelige innsamling av blod er vanligvis utføres innen 2 h etter siste administrasjon22,23, når konsentrasjonen av granulater i blodet er relativt stabilt og på toppnivå i henhold til en tidligere studie24.

Medikament som inneholder serum for in vitro-analyser før bruk er fortsatt kontroversielt. Noen forskere holder at det kan føre til uventede reaksjoner eller bivirkninger, som påvirker resultatene på grunn av tilstedeværelsen av mange aktive komponenter i serum, inkludert enzymer, hormoner, antistoffer, og utfyller25. Men noen forskere holder motsatt oppfatning at aktive komponenter kan også bli fjernet av deaktivering prosessen26. For å nå en middelvei var serum i denne studien deaktivert før inkubasjons i et vannbad ved 56 ° c i 30 min. Dessuten ble en blank serum gruppe inkludert, der serum fra saltvanns behandlede dyr blir brukt, for å utelukke mulige bivirkninger. Derfor kan stoff som inneholder serum tjene som en potensiell metode for å undersøke farmakologiske mekanismer eller terapeutiske utfall.

Sammenlignet med lignende metoder, har protokollen her følgende fordeler: (1) helhet. Både in vitro og in vivo metoder brukes samtidig og kan gjensidig støtte hverandre i farmakologiske effekter. (2) egnethet. Bare mus og rotter er inkludert fordi de er nært beslektet. (3) repeterbarhet. Begge to mus og rotter er lett kjøpt for lav bekostning, og metodene kan lett gjentatt. (4) lav pris. Den OVX-indusert osteoporotiske Mouse modellen er ofte brukt og pålitelig27,28 og kan enkelt gjøres eller kjøpes. Derfor protokollene her er mer egnet i forhold til andre metoder for å studere de farmakologiske virkningene av urtemedisin, som granulat.

Men det er flere begrensninger for protokollene med GSK granulater. Først tre doser ble administrert, selv om granulater viste ingen signifikant dose avhengig tendens til in vivo undersøkelser. Årsaken kan være at doser for dyrestudier ikke er følsomme og intervensjon tiden er ikke tilstrekkelig lang, noe som krever ytterligere testing. Neste, en lengre periode med intervensjon er nødvendig for in vitro parallelle undersøkelser. Legemidlet som inneholder serum, selv om det er deaktivert, kan forårsake bivirkninger etter langvarig intervensjon. For det tredje, bare ettall kvantum av arbeider løsning brukes for dyr administrasjon, hvilke kan modifisert inne fremtid studier. Til slutt, dyrearter valgt for utarbeidelse av medikament som inneholder serum og administrasjonen rutiner kan endres og vil bli testet i videre studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (81804116, 81673991, 81770107, 81603643, og 81330085), programmet for innovative team, departementet for vitenskap og teknologi i Kina (2015RA4002 til WYJ), programmet for Innovativt team, utdanningsdepartementet i Kina (IRT1270 til WYJ), Shanghai TCM Medical Center av kronisk sykdom (2017ZZ01010 til WYJ), tre års aksjon for å akselerere utviklingen av tradisjonell kinesisk medisin plan (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 til WYJ), og nasjonale nøkkel forsknings utviklingsprosjekter (2018YFC1704302).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Hyclone
laboratories		 SH30265.018 For cell culture
β-Glycerophosphate Sigma G5422 Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL) Wyeth L96625 Animal interventation
C57BL/6 mice SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Ainimal preparation
Dexamethsome Sigma D4902
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438 Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Sangon Biotech 60-00-4 Samples treatmnet
Fetal bovine serum Gibco FL-24562 For cell culture
Gushukang granules kangcheng companyin china Z20003255 Herbal prescription
Light microscope Olympus BX50 Olympus BX50 Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate Sigma A8960-5G Osteoblastogenesis
Microscope Leica DMI300B Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF Peprotech AF-300-25-10 Osteoclastogenesis
Μicro-CT Scanco
Medical AG		 μCT80 radiograph microtomograph Bone Structural analsysis
RANKL Peprotech 11682-HNCHF Osteoclastogenesis
Sprague Dawley SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT TRAP staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
  2. Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
  3. Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
  4. Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
  5. Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
  6. Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
  7. Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
  8. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
  9. Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
  10. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
  11. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
  12. Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
  13. Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
  14. Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
  15. Zhang, Y. P. Pharmacology Experiment. , 2nd edition, People’s medical publishing house. Beijing, China. (1996).
  16. Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
  17. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  18. Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
  19. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  20. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  21. Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
  22. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  23. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  24. Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  25. Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  26. Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
  27. Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
  28. Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).

Tags

Medisin tradisjonell kinesisk medisin Gushukang granule medikament som inneholder serum serum farmakologi osteoclastogenesis ovariectomized mus osteoblastogenesis in vivo in vitro
Utarbeidelse av Gushukang (GSK) granulat for in vivo og in vitro eksperimenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang,… More

Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang, Y., Shu, B., Zhao, D. Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59171, doi:10.3791/59171 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter