Summary
Die In-vitro-Fertilisation ist eine häufig verwendete Technik mit einer Vielzahl von Modellorganismen, um Laborpopulationen zu erhalten und synchronisierte Embryonen für nachgelagerte Anwendungen zu produzieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das diese Technik für verschiedene Populationen des mexikanischen Tetrafisches Astyanax mexicanusumsetzt.
Abstract
Astyanax mexicanus entwickelt sich zu einem Modellorganismus für eine Vielzahl von Forschungsbereichen in der biologischen Wissenschaft. Ein Teil des jüngsten Erfolgs dieser Teleostfischart ist, dass sie interfertile Höhlen- und Flusspopulationen besitzt. Dies ermöglicht die genetische Kartierung vererbbarer Merkmale, die während der Anpassung an die verschiedenen Umgebungen dieser Populationen fixiert wurden. Während diese Art im Labor gepflegt und gezüchtet werden kann, ist es schwierig, sowohl Embryonen während des Tages zu erhalten und Hybridembryonen zwischen Stämmen zu erzeugen. Die In-vitro-Fertilisation (IVF) wurde mit einer Vielzahl unterschiedlicher Modellorganismen eingesetzt, um Tiere im Labor erfolgreich und wiederholt zu züchten. In diesem Protokoll zeigen wir, wie wir durch die Akklimatisierung von A. mexicanus an verschiedene Lichtzyklen gekoppelt mit Veränderungen der Wassertemperatur Brutzyklen auf eine gewählte Tageszeit verschieben können. Anschließend zeigen wir, wie man geeignete Elternfische identifiziert, gesunde Gameten von Männchen und Weibchen sammelt und mit IVF lebensfähige Nachkommen produziert. Dies ermöglicht verwandte Verfahren wie die Injektion von genetischen Konstrukten oder Entwicklungsanalysen während der normalen Arbeitszeit. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um Hybriden zwischen der Höhle und oberflächenbewohnenden Populationen zu schaffen und so die Erforschung der genetischen Grundlagen phäkotypischer Anpassungen an unterschiedliche Umgebungen zu ermöglichen.
Introduction
In den letzten Jahren hat sich Astyanax mexicanus zu einem Modellorganismus in verschiedenen Bereichen wie Entwicklungsbiologie, Evolutionsbiologie, Verhaltensbiologie und Physiologie1,2,3,4 . Die Einzigartigkeit dieses Systems kommt von dieser Art mit mehreren Morphotypen, die sich an sehr unterschiedliche Umgebungen angepasst haben. Der Oberflächen-Morphotyp lebt in Flüssen, wo es eine hohe Artenvielfalt und viele Nahrungsquellen für die Fische gibt. Im Gegensatz dazu leben die Höhlenmorphotypen von A. mexicanus, dem Höhlenfisch, in Höhlen, in denen Artenvielfalt, Nahrungsquellen und Sauerstoff drastisch reduziert werden1. Höhlenfische unterscheiden sich von den Oberflächenfischen in einer Vielzahl von Phänotypen wie das Fehlen von Augen und Pigmentierung, Insulinresistenz, und die Fähigkeit, Fett zu speichern2,3,4. Oberflächenfische und Höhlenfische gehören jedoch immer noch zu denselben Arten und sind daher interfertile.
Für beide Morphotypen wurde eine Reihe von Bedingungen definiert, um routinemäßige Wartung und Züchtung unter Laborbedingungen5,6zu ermöglichen. Genetische Veränderungen, richtige embryonale Entwicklungsstudien und die Kreation von Hybriden sind jedoch aus mehreren Gründen immer noch eine Herausforderung. A. Mexicanus laichen in erster Linie in den Nachtstunden, was für nachfolgende Experimente an frühen embryonalen Stadien wie der Injektion genetischer Konstrukte oder der Überwachung früher embryonaler Entwicklungsprozesse unbequem ist. Darüber hinaus ist die Erzeugung von Oberflächen- und Höhlenhybriden mit natürlichem Laichen eine Herausforderung, da die Höhlenmorphotypen einen veränderten zirkadianen Rhythmus7 haben, der letztlich die Produktion lebensfähiger Eizellen beeinflusst. Erfolgreiche, aber invasive IVF-Verfahren wurden für andere Astyanax-Arten beschrieben, bei denen Die Gametenproduktion und das Laichverhalten mit hormonellen Injektionen8,9grundiert wurde. Weniger invasive IVF-Verfahren (d. h. die Gewinnung von Gameten aus dem manuellen Laichen ohne Injektion von hormonellen Präparaten) wurden beschrieben, berücksichtigen jedoch nicht die Unterschiede im Laichzyklus zwischen Höhlen- und Oberflächenmorphotypen von A. mexicanus 6.
Andere Fischmodellorganismen, wie der Zebrafisch, können leicht gentechnisch verändert und auf embryonaler Ebene untersucht werden, da die oben genannten Hindernisse erfolgreich gelöst wurden. Die Implementierung standardisierter Züchtungstechniken, in vitro Fertilisation und Spermienkryokonservierung haben Zebrafische nach vorne getrieben und den Einsatz des Modells in den biologischen Wissenschaften verfestigt10. Daher wird die Ausweitung dieser Techniken auf A. mexicanus sie als Modellsystem weiter stärken.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für IVF vor, das dazu beitragen wird, A. mexicanus zugänglicher zu machen. Wir werden ein Zucht-Setup vorstellen, das es ermöglicht, die Lichtzyklen der Fische von Tag zu Nacht zu verschieben, so dass lebensfähige Eizellen während der Tagesstunden ohne Injektion von hormonellen Präparaten erhalten werden können. Wir bieten dann eine detaillierte Beschreibung, wie man die Eizellen und milt für IVF verwendet zu erhalten. Diese Methode wird die Erzeugung von Embryonen während der normalen Arbeitszeit ermöglichen und weitere nachgelagerte Anwendungen im Vergleich zur Verwendung von Embryonen aus natürlichem Laichverfahren erleichterbarer machen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Stowers Institute for Medical Research genehmigt.
1. Lichtzyklus-Manipulation
- Richten Sie Fischtanks in einem undurchsichtigen, vollständig geschlossenen (Lichtschutz) durchfließenden Aquakultursystem ein, das mehrere Tanksreihen enthält (Abbildung 1).
HINWEIS: Das Influsssystem, wie in Abbildung 1 dargestellt, verwendet Systemwasser, um Abfälle durch das hintere Standrohr jedes Tanks zu spülen und fließt in einen Sumpf, der in einen sanitären Abfluss mündet. In diesem Experiment wurde ein Wasserwechselkurs von einer Gallone (US) pro Stunde durch einen Tropfstrahler verwendet. - Halten Sie die Temperatur jedes Tanks mit einem unabhängigen Heizelement, das verwendet wird, um die Temperatur während des Grundierungsprozesses manuell zu ändern.
- Richten Sie einzelne Zeilen so ein, dass jeweils separate Fotoperioden aktiviert werden. Installieren Sie Türen in jeder Reihe, die geschlossen werden können, um zu verhindern, dass Licht eindringt oder entweicht.
HINWEIS: Der automatisierte Controller kann die Manipulation aller Photoperioden mit der geringsten Störung des Fisches ermöglichen. - Rüsten Sie das Rack mit einem roten Arbeitslicht und Verdunkelungsvorhängen für den Zugang während der dunklen Stunden.
2. Anpassen der Photoperiod und Grundierung Fisch für Gamete Sammlung
- Entfernen Sie den gewünschten Fisch (Abbildung 2a) aus allgemeinen Systemregalen und legen Sie ihn in Zuchtregalen, um die Photoperiode 14 Tage vor der Grundierung zu justieren.
HINWEIS: Dies ermöglicht es den Fischen, sich an eine neue Umgebung zu gewöhnen. - Halten Sie die Fische in dieser Zeit mit dem installierten Wasserheizungssystem bei 22,8 °C .F. Die normale Fotoperiode ist von 6 bis 20 Uhr hell und von 20 bis 6 Uhr dunkel. Für den Lichtzyklus-Rack, verschieben Sie die Photoperiode auf 22 Uhr bis 12 Uhr Licht und 12 Uhr bis 22 Uhr dunkel, indem Sie den Timer einstellen, der das Licht im Rack antreibt.
HINWEIS: Männchen und Weibchen sind im selben Tank untergebracht, damit natürliches Grundverhalten stattfinden kann. Während das Laichen im Becken stattfinden kann, können Fische weiterhin für die In-vitro-Fertilisation verwendet werden, da Gameten in Stufe11freigesetzt werden. - Sobald die Fische akklimatisiert sind, beginnen Sie, die Tiere zum Laichen5 zu grundieren, wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.5 beschrieben.
HINWEIS: Dieses Verfahren dauert insgesamt sechs Tage. Ändern Sie in dieser Zeit die Temperatur, um die Eizellenproduktion mit einem installierten Wasserheizungssystem zu grundieren. Mit den 50W Aquatic Heaters (siehe Tabelle der Materialien), stellen Sie die Heizung direkt auf die Temperatur (Skala auf der Heizung ist in Fahrenheit) im Protokoll bei jedem Schritt angegeben. Je nach Größe des Tanks und Durchflussrate des Wassers kann die Zeit der Temperaturanpassung abweichen. In diesem Experiment wurde die Temperatur am Mittag eingestellt und die Temperaturgleichgewichtnahme übernahm die nächsten 18 h.- Heben Sie die Temperatur am ersten Tag von 22,8 °C auf 24,4 °C an.
- Erhöhen Sie am 2. Tag die Temperatur von 24,4 °C auf 26,1 °C.
- Halten Sie die Temperatur an Tag 3 und 4 bei 26,1 °C .F. Fische werden während des Tages laichen bereit sein und IVF kann durchgeführt werden.
HINWEIS: Je nach Fisch können Weibchen an Tag 3 und/oder Tag 4 laichen. Wir empfehlen, je nach Erfolg der Eizellensammlung am 3. Tag und/oder Tag 4 zu versuchen, Eizellen zu erhalten. - Senken Sie am 5. Tag die Temperatur von 26,1 °C auf 24,4 °C.
- Senken Sie am 6. Tag die Temperatur von 24,4 °C auf 22,8 °C.
HINWEIS: Stellen Sie einen 7-Tage-Abstand bereit, bevor Sie diesen Temperaturzyklus wiederholen. Es wird empfohlen, die Fische weiterhin in dieser Fotoperiode zu halten, da dies die Gesamtzeit reduziert, die der Fisch benötigt, um sich an diesen verschobenen Lichtzyklus anzupassen.
3. Weibliche Gamete-Sammlung
- Beginnen Sie mit dem Einlegen eines befeuchteten Gewebes in einen Petrischalendeckel und schließen Sie die Schale, um eine befeuchtete Kammer zu schaffen und zu verhindern, dass die Eizellen während des Entnahmeprozesses austrocknen.
- Als nächstes wählen Sie eine Frau für die Sammlung. Gravid-Fische mit großen, hervorstehenden Bauch werden wahrscheinlich die beste Wahl für dieses Verfahren sein (Abbildung 2a).
HINWEIS: Um zwischen Männchen und Weibchen von erwachsenen A. mexicanuszu unterscheiden, wurde die Baumwollkugelmethodeverwendet 12. - Immobilisieren Sie ein Weibchen mit gekühltem Wasser und legen Sie es in die Supine-Position in einem befeuchteten Schwamm Tierhalter. Dies geschieht, indem Sie die Fische mindestens 30 s in 4 °C-Systemwasser geben oder bis der Fisch immobilisiert ist (d. h. Verlust der Kiemenbewegung, siehe Ross und Ross13 für Details).
HINWEIS: Arbeiten Sie schnell und versuchen Sie, eine Erwärmung der Fische zu vermeiden, bis das Verfahren abgeschlossen ist. Dazu kann gehören, regelmäßig die gehandicapten Fingerspitzen in kaltes Wasser zu tauchen oder eine zusätzliche Anästhesie anzubieten. Andere Anästhesiemethoden (z.B. MS-22213) können ebenfalls angewendet werden. Nach den IACUC-Richtlinien des Stowers Institute for Medical Research gilt die manuelle Entnahme von Eizellen als nicht-invasives Verfahren, das keine vollständige Anästhesie erfordert (z. B. bis MS-222). - Sobald Sie positioniert sind, blinken Sie die ventrale Seite des Fisches mit einem empfindlichen Gewebewisch, da der Kontakt mit Wasser dazu führt, dass die Eizellen aktiviert werden.
- Halten Sie das Weibchen zwischen Daumen und Zeigefinger. Drücken Sie vorsichtig gegen die Seitenseiten der koelomischen Höhle in Richtung der Urogenitalöffnung, während Sie die Finger leicht rollen. Sammeln Sie die ausgedrückten Eizellen mit einem Einweg-Spachtel.
- Diese Eizellen auf die befeuchtete Petrischale übertragen.
HINWEIS: Mehrere Kupplungen von Eizellen können in der gleichen Schale kombiniert werden, wenn bestimmte Abstammungsdaten nicht benötigt werden. Die Eizellen können bei 24 °C gelagert werden und eignen sich am besten, wenn sie innerhalb von 30-60 min nach der Entnahme für IVF verwendet werden. - Nach der Abholung die Fische vorsichtig in einen mit Systemwasser gefüllten Bergungstank zurückgeben.
HINWEIS: Legen Sie den Fisch bei Bedarf wieder in den dunklen Schranktank für die zukünftige Eizellensammlung.
4. Männliche Gamete-Sammlung
- Wählen Sie ein Männchen für die Sammlung.
HINWEIS: Es gibt keine äußerlich sichtbaren Anzeichen von männlicher Gamete-Qualität. Jedoch, Fisch sollte gesund im Aussehen vor der Verwendung in diesem Verfahren erscheinen. Zur Unterscheidung zwischen Männchen und Weibchen des erwachsenen A. mexicanuswurde die Baumwollkugelmethode12verwendet. - Immobilisieren Sie ein Männchen mit gekühltem Wasser und legen Sie ihn in der Supine-Position in einem befeuchteten Schwamm Tierhalter. Immobilisieren, indem Sie die Fische mindestens 30 Sekunden lang in 4 °C-Systemwasser geben oder bis der Fisch immobilisiert ist (d.h. Verlust der Kiemenbewegung, siehe Ross und Ross13 für Details).
HINWEIS: Arbeiten Sie schnell und versuchen Sie, eine Erwärmung der Fische zu vermeiden, bis das Verfahren abgeschlossen ist. Dazu kann gehören, regelmäßig die gehandicapten Fingerspitzen in kaltes Wasser zu tauchen oder eine zusätzliche Anästhesie anzubieten. Auch andere Anästhesiemethoden (z.B. MS-22213) können hier verwendet werden. Nach den IACUC-Richtlinien des Stowers Institute for Medical Research gilt die manuelle Entnahme von Spermien als nicht-invasives Verfahren, das keine vollständige Anästhesie erfordert (z. B. über MS-222). - Blot die ventrale Seite des Fisches mit einem empfindlichen Gewebe wischen als Kontakt mit Wasser wird die milt aktivieren.
- Legen Sie das Ende eines Kapillarrohrs vorsichtig an der Urogenitalöffnung ab.
- Vertreiben Sie milt, indem Sie sanften Druck auf die Seiten der Fische mit Dem Daumen und Zeigefinger ausüben. Beginnen Sie distal zu den Kiemen, in Richtung der urogenitalen Öffnung bewegen.
- Sammeln Sie die Milt am Ende eines Kapillarrohrs. Eine schonende Absaugung kann durch verwendung eines Aspiratorrohres erforderlich sein. Vermeiden Sie Kot, der mit der Milt vertrieben werden kann.
- Die Milt in ein leeres 1,5 ml Zentrifugenrohr geben und mit dem doppelten Volumen des Spermextenders E400 verdünnen (siehe Materialtabelle). Auf Eis bleiben.
HINWEIS: Milt von mehreren Männern kann zusammen gepoolt werden, wenn bestimmte Abstammungsdaten nicht benötigt werden. Dieser Schritt kann verwendet werden, um die Arbeitszeit der milt um mehrere Stunden zu verlängern, aber es ist nicht für die sofortige Befruchtung erforderlich. - Nach der Abholung die Fische vorsichtig in einen mit Systemwasser gefüllten Bergungstank zurückgeben.
HINWEIS: Legen Sie Fische bei Bedarf wieder in einen dunklen Schranktank für die zukünftige Spermiensammlung.
5. In-vitro-Fertilisation
- Mit einer neuen Pipette für jeden Bestand, mischen Sie die Spermien durch Pipettieren und/oder Agitieren der Seite des Rohres vor der Befruchtung als Sperma in milt kann in der E400-Lösung im Laufe der Zeit absetzen.
- Geben Sie die milt oder erweiterte milt Lösung in die frisch gesammelten Eizellen.
- Fügen Sie schnell 1 ml Systemwasser in die Kupplung, um die Spermien und Eier für die Befruchtung zu aktivieren. Vermeiden Sie das Mischen oder Aufsetzen des Schaleninhalts und lassen Sie 2 min für die Befruchtung auftreten.
HINWEIS: Mischen und Rühren reduziert die Düngeraten erheblich und sollte daher vermieden werden14. - Fügen Sie E2 Embryo Media hinzu, um die Schale 2/3rd voll zu füllen.
HINWEIS: Je nach nachfolgendem Verfahren können Embryonen entweder sofort verwendet werden (z. B. zur Injektion genetischer Konstrukte, wie vor15beschrieben) oder Embryonen können in E2 Embryo Media bei 23 °C bis zu 5 dpf inkubiert werden. An dieser Stelle übertragen Embryonen auf das Haupt-Umwälzgehäusesystem mit Systemwasser.
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Representative Results
Das hier vorgestellte Protokoll basiert hauptsächlich auf einem zuvor veröffentlichten Protokoll6. Da A. mexicanus jedoch in den Nachtstunden laicht, haben wir ein Gehäusefürsttell für die Fischzucht entworfen, das die Photoperiode unabhängig von den Arbeitszeiten ändern kann (Abbildung 1). Der Fischlichtzyklus wird innerhalb eines vollständig geschlossenen, durchfließenden Aquakultursystemsmit drei Tanksreihen (Abbildung 1) verändert. Jeder Tank enthält ein unabhängiges Heizelement, das verwendet wird, um die Temperatur während des Grundierungsprozesses manuell zu erhöhen. Einzelne Regale können auf separaten Fotoperioden aufgestellt werden und können geschlossen werden, um zu verhindern, dass Licht eindringt oder entweicht. Alle Photoperioden können über einen automatisierten Controller an der Seite des Lichtzyklusregals manipuliert werden. Für den Zugang während der dunklen Stunden ist das Rack mit einem roten Arbeitslicht und Verdunkelungsvorhängen ausgestattet. A. mexicanus laicht nach einem Temperaturanstieg von 23 - 26 °C mit einem Anstieg von 1,5 °C pro Tag16. Um dies in unseren dunklen Schränken zu erreichen, haben wir in jedem Tank Tauchaquarienheizungen eingesetzt (Abbildung 1).
Der Schlüsselfaktor für ein erfolgreiches IVF-Verfahren in A. mexicanus ist die Qualität der gesammelten Eizellen. Gravid, weibliche Fische mit großen, hervorstehenden Bauch sind am ehesten lebensfähige Eizellen freizusetzen, die klar und sogar im Aussehen erscheinen (Abbildung2a-d). Das Hinzufügen der gesammelten Milz zu solchen Eizellen führt zur Entwicklung von befruchteten Embryonen in der Regel innerhalb von 20-30 min (Abbildung2e). Lebensfähige befruchtete Embryonen werden etwas lichtdurchlässiger, bevor sie in die eine Zellphase des Entwicklungszyklus eintreten, während unbefruchtete Eizellen ungleichmäßiger und undurchsichtiger erscheinen (Abbildung 2e). Die resultierenden Embryonen werden in Petrischalen in ZIRC E2 Embryo Media gehalten und bei 23 °C in einem 14/10-Licht-/Dunkelzyklus inkubiert. Die Embryonen werden dann nach 5 Tagen nach der Befruchtung zur Aufzucht in das Hauptumlaufgehäuse system übertragen.
Um die Bedeutung der Technik zu demonstrieren, zeigen wir, wie die Phänotypisierung von Hybriden für bestimmte Merkmale wie Augengröße und Körperpigmentierung bei der Entschlüsselung ihrer genetischen Basis helfen kann. Höhlenfische unterscheiden sich deutlich von Oberflächenfischen in ihrer Augengröße und Körperpigmentierung. Um die genetische Grundlage dieser Merkmale zu verstehen, kreuzten wir Oberflächen- und Höhlenfische (F0) und erzeugten hybride F1- und F2-Populationen mit IVF, um die erhaltene phänotypische Variation zu beobachten (Abbildung 3). Die Größe der Augen ist in der F1-Generation kleiner, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von Augen ein teilweise dominantes Merkmal ist (Abbildung 3). Bei Oberflächenhöhlen-F2-Hybriden erhalten wir eine breite Palette von Augengrößen, was darauf hinweist, dass es mehrere Loci gibt, die die Augengröße in A. mexicanus steuern, was es zu einem quantitativen Merkmal macht (Abbildung 3). Ein weiteres Beispiel ist die Pigmentierung. Unter Beobachtung der F1-Hybride aus Oberflächen- und Höhlenfischen kann der Schluss gezogen werden, dass die Körperpigmentierung ein dominantes Merkmal ist, da die Fische vollständig pigmentiert sind (Abbildung 3). In der F2-Generation deutet die Variation der Körperpigmentierung erneut auf ein quantitatives Merkmal hin. Die Kombination dieser phänotypischen Daten mit Sequenzierungsdaten kann die zugrunde liegenden genetischen Loci aufdecken, die für diese Phänotypen verantwortlich sind. Diese F2-Populationen sind eine gute Ressource, um die genetische Nütze verschiedenerMerkmale zu verstehen, und solche Populationen wurden zuvor für die Untersuchung dieser Merkmale 17,18,19verwendet. Eine standardisierte IVF-Technik kann die Erzeugung von Hybriden erheblich rationalisieren, was eine genetische Kartierung der Loci ermöglicht, die solche Merkmale steuern, und uns hilft zu verstehen, wie bestimmte Phänotypen in einigen Lebensräumen nachteilig und in anderen adaptiv sind.
Abbildung 1 : Design von Regalen zur Verschiebung von Tag/Nacht-Zyklen von A. mexicanus. (a) Die allgemeine Einrichtung dieses Rack-Systems ermöglicht Photoperiodenmanipulation, so dass eine Simulation der Nachtzeit während der Tagesstunden, wenn Türen geschlossen sind, und die Regalleuchten ausgeschaltet sind. (b) Die Grundierung der Fische zur Stimulierung der Ova-Reifung wird durch die Verwendung von Tauchheizungen (siehe Materialtabelle)erreicht, die in einzelnen Tanks installiert sind und separat eingestellt werden können (rote Pfeile). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Beispiele für geeignete Weibchen für die Eizellensammlung und repräsentative Darstellung lebensfähiger und nicht lebensfähiger Eizellen. (a) Gravid, weibliche Fische mit großen, hervorstehenden Bauch sind besser geeignet für manuelle Eizellensammlung als (b) Weibchen mit einem stromlinienförmigen Bauch. (c) Lebensfähige Eizellen (d. h. Eizellen, die lebensfähige Embryonen produzieren, wenn sie befruchtet werden) können durch ihr klares, gleichmäßiges Aussehen identifiziert werden, während nicht lebensfähige Eizellen (d. h. Eizellen, die keine lebensfähigen Embryonen produzieren, wenn sie befruchtet werden), wie in (d) dargestellt, eine trübe, ungleichmäßige aussehen. (e) Nach erfolgreicher Befruchtung werden lebensfähige Embryonen durchscheinender und gelangen in die eine Zellstufe, während unbefruchtete Eizellen (rote Pfeile) langsam zerfallen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Genetische Analyse der Augengröße und Körperpigmentierungsmerkmale. Stammbaum zeigt Bilder von elterlichen (F0) Oberflächenfischen (oben links) und Höhlenfischen (oben rechts), F1-Hybriden (zweite Reihe) und den F2-Hybriden. Die F1-Fische haben eine mittlere Augengröße und sind vollständig pigmentiert, während F2-Fische eine breite Variation in den beiden morphologischen Merkmalen aufweisen: Augengröße und Pigmentierung. Auf alle Originaldaten, die dieser Abbildung zugrunde liegen, kann über das Stowers Original Data Repository auf http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365 zugegriffen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Während IVF eine standardisierte Methode für viele verschiedene Modellorganismen wie Zebrafische ist, berücksichtigen bestehende Protokolle für A. mexicanus nicht, dass diese Art natürlich in den Nachtstunden laicht6. Da sich Höhlenfische und Oberflächenfische in ihren zirkadianen Rhythmen recht stark unterscheiden, unterscheidet sich der Reifezyklus der Eizellen auch zwischen den Höhlen- und Oberflächenmorphotypen. Während die Staging-Temperaturen und -Zeiten für Oberfläche A. mexicanus gut untersucht sind12, können Höhlenfische in ihrem Laichverhalten und Reifungszyklus unterscheiden. Herkömmliche Methoden der Hybridproduktion sind daher sehr anspruchsvoll und unsicher aufgrund des Verlusts des zirkadianen Rhythmus im Höhlenmorphotyp von A. mexicanus7, was zu veränderten Laichzeiten dieser Fische führt. Durch die Verschiebung der Photoperiode können wir zeitspezifische Hybridembryonen bereitstellen, ohne uns auf seltene natürliche Laichereignisse zwischen den beiden Morphotypen verlassen zu müssen. Die Trennung von Höhlen- und Oberflächenfischen verhindert auch, dass aggressive Oberflächenmorphen sich nachteilig auf die Zucht auswirken.
Bei dieser Methode bestehen einige Einschränkungen, z. B. Abweichungen in der Eizellenqualität. Die Identifizierung eines Weibchens (Oberflächen- oder Höhlenfische) mit reifen Eizellen ist nicht trivial und erfordert sorgfältige Beobachtungen des Fischverhaltens. Im Allgemeinen haben zum Laichen bereite Gravidweibchen größere Bauchmuskeln und bürsten wiederholt gegen die Bodentankoberfläche oder Embryo-Sammelfalle20.
Wir beobachteten, dass die Qualität der Spermien während des gesamten Tag-Nacht-Zyklus konsistent ist. Der entscheidende Schritt erfolgreicher IVF (erfolgreich in Bezug auf die Erzeugung von befruchteten Embryonen) ist die Erzielung guter Qualität, lebensfähige Eizellen. Daher ist es äußerst wichtig, die Eizellen von Fischen zu sammeln, die im Begriff sind, natürlich zu laichen (Abbildung 2a). Sobald die Eizellen gesammelt sind, können sie unter einem Seziermikroskop beobachtet werden, um die Qualität zu untersuchen. Die Sammlung lebensfähiger Eizellen während der Nacht ist jedoch unbequem und herausfordernd für den Forscher. Die Einrichtung, die wir hier präsentieren, ermöglicht eine Verschiebung des Reifezyklus der Eizellen, so dass IVF verwendet werden kann, um synchronisierte Embryonen für die nachgelagerte Anwendung während der normalen Arbeitszeiten zu erzeugen.
Mit der Weiterentwicklung der Kryokonservierung von milt (z.B., wie es in Zebrafisch21beschrieben wird), wird IVF ein leistungsfähiges Werkzeug zur Etablierung und Aufrechterhaltung genetischer Linien für das aufkommende Modellsystem A. mexicanuswerden. In Kombination mit Methoden zur genetischen Veränderung15 und Morpholino-basierten Knockdown17werden diese Verfahren die methodische Plattform bieten, um die genetischen und entwicklungsbezogenen Grundlagen von Anpassungen an verschiedene Lebensräume in A. mexicanus.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier vorgestellte Protokoll die Herstellung synchronisierter Embryonen von A. mexicanus für andere nachgelagerte Anwendungen wie die Injektion genetischer Konstrukte oder die Untersuchung früher embryologischer Phänotypen ermöglichen wird. Die Hauptstärke des Protokolls besteht darin, dass es eine effiziente Produktion von Oberflächen-Höhlen-Hybriden ermöglicht, die verwendet werden können, um phänotypische Unterschiede zwischen Oberflächenfischen und Höhlenfischen durch QTL-Analysen (quantitative trait loci) genetisch abzubilden. Zusammengenommen ist die Gewinnung lebensfähiger Eizellen während des Tages für IVF eine leistungsstarke Technik, die für eine Vielzahl zukünftiger Studien in verschiedenen Bereichen der biologischen Wissenschaften von Vorteil sein wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Philippe Noguera und Kimberly Bland für ihre Unterstützung bei der Videoproduktion. Die Autoren möchten auch das gesamte Aquatics Team des Stowers Institute for Animal Gemaniz würdigen. Diese Arbeit wurde durch institutionelle Mittel für DPB und NR unterstützt. NR wurde von der Edward Mallinckrodt Foundation und JDRF unterstützt. RP wurde durch einen Zuschuss der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt (PE 2807/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
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